Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.
En av de stora frågorna i mikrobiell ekologi är "vem är det?" Denna fråga kan besvaras med hjälp av olika verktyg, men en av de långvariga guldstandarder är att sekvensera 16S ribosom RNA (rRNA) gen amplikoner genereras av domännivå PCR reaktioner amplifierar från genomiskt DNA. Traditionellt Detta utfördes genom kloning och Sanger (kapillärelektrofores) sekvensering av PCR-amplikoner. Tillkomsten av nästa generations sekvensering har oerhört förenklat och ökat sekvensedjup för 16S rRNA genen sekvensering. Införandet av stationär sequencers tillåter nu små laboratorier för att utföra sina 16S rRNA sekvense internt inom några dagar. Här är ett tillvägagångssätt för 16S rRNA genen amplikon sekvense med hjälp av en bänk nästa generations sekvense detalj. Miljö DNA först med PCR med användning av primers som innehåller sekvense adaptrar och streckkoder. De är sedan kopplade till sfäriska partiklar via emulsion PCR. Partiklarna är loaded på en engångs chip och chip är införd i sekvenseringsmaskinen efter vilket sekvensbestämning utförs. Sekvenserna hämtas i fastq format, filtrerades och de streckkoder används för att fastställa provets medlemskap i läsningar. Den filtrerade och arkiveras läser analyseras sedan vidare med hjälp av offentligt tillgängliga verktyg. Ett exempel analys där läser klassificerades med en taxonomi undersökningsalgoritm inom programpaket Mothur ges. Metoden beskrivs här är enkel, billig och enkel och bör hjälpa mindre labb för att dra nytta av den pågående iska revolutionen.
Metagenomic sekvense är en mycket kraftfull teknik eftersom den riktar helheten av den genetiska information som finns i ett miljöprov. Det finns olika varianter av metagenomic sekvense, inklusive hagelgevär sekvensering, stor-insticksbibliotek och amplicon sekvensering. Amplicon sekvense erbjuder fördelen av att vara relativt billig, snabb och kunna producera läser från en enda genomisk region som kan generellt inriktade. Dessutom är dataanalys arbetsflöde för amplikon sekvense oftast standardiserade. Men eftersom det är baserat på PCR, har det alla fördomar som rör ofullständiga specificitet, ofullständig täckning och primer förspänner 1,2, vilket gör denna metod semikvantitativ i bästa fall. Flera genomiska regioner kan riktas till amplikon sekvense inklusive funktionella gener, men de mest populära alternativen är att använda markörgener såsom 16S rRNA-genen för att skapa en gemenskap profil. Traditionellt 16S rRNA-genen amplikon sequencing utfördes med hjälp av arbetsintensiva tekniker som ingår kloning i E. coli, koloniplockning och plasmid extraktion följt av Sanger-sekvensering på de isolerade plasmider, och därmed de flesta studier analyserade färre än 100 kloner per prov. Nästa generations sekvense tog två viktiga framsteg: massiv parallel av sekvenseringsreaktioner och, viktigast av allt, klon separation av mallar utan att behöva sätta in genfragment i en värd. Detta har förenklat oerhört sekvensering av 16S rRNA genen amplikoner, som nu är tillbaka som en rutinmässig funktion i många miljö mikrobiologi studier, vilket resulterar i en "renässans" för 16S rRNA-genen amplikon sekvense 3.
Sedan tillkomsten av Roche 454 sekvense 2005 4, har flera andra nästa generations sekvenseringsteknologier dykt upp på marknaden (t.ex. Illumina, Solid, PacBio). På senare tid, införandet av bänk-topp sekvensrs kommer till små labb sekvensekapaciteten gång exklusivt till stora sekvensecentra. Fem stationär maskiner är för närvarande tillgängliga: den 454 GS Junior, Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) och Proton, och Illumina MiSeq och NextSeq 500 Även om alla dessa sequencers erbjuder mindre läsningar per körning och färre baser per dollar än de flesta heltids skala sequencers, de är mer flexibla, snabbare, och deras låga anskaffningskostnader och köra har råd med små akademiska laboratorier. Fasta sequencers är särskilt väl lämpade för amplikon, liten arvsmassa och låg komplexitet metagenome sekvensemiljö mikrobiologi studier, eftersom denna typ av studier i allmänhet inte kräver en extrem djup av sekvensering. Till exempel är det allmänt accepterat att för 16S rRNA genen sekvense studerar antalet läsningar per prov inte är avgörande, eftersom ~ 1.000 läsningar kan generera samma mönster som flera miljoner läser datamängder 5. Med detta sagt, bänk nästa gene n sequencers fortfarande genererar stora mängder sekvensdata, med maximal avkastning på ~ 35 Mbp (454 GS Junior), ~ 2 GBP (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (Ion Torrent Proton), ~ 10 GBP (Illumina MiSeq) och ~ 100 GBP (Illumina Nästa Seq 500), vilket är mer än tillräckligt för de flesta miljö mikrobiologi studier.
Nästa generations sekvensering av 16S rRNA-amplikoner med användning av stationär sequencers har nyligen tillämpats på en mängd olika miljöer. Till exempel har Ion Torrent PGM använts för gemenskap analyser av urangruvavfall som hade särskilt högt pH och låg permeabilitet 6, för recirkulerande vattenbrukssystem 7, av kolväte-förorenad arktiska jordar 8,9 av oljesand gruv drabbade sediment och biofilmer från Athabasca River 10,11, i rizosfären av pilträd planteras i förorenad mark 12, de mänskliga och djurkroppar 13-16 och rötkammare 17.
jove_content "> I detta bidrag vi detalj vår inställning att sekvensera 16S rRNA genen amplikoner internt med hjälp av en bänk nästa generations sekvense (Ion Torrent PGM). Efter DNA-extraktion, 16S rRNA gener förstärks med hjälp av bakteriella primers domännivå som innehåller sekvense adaptrar och unika, provspecifika sekvenser (streckkoder). amplikonema renas, kvantifieras och slogs samman till ett ekvimolärt förhållande. De poolade proverna sedan klonalt förstärks i en emulsion PCR och sekvens. resulterar sekvenser analyseras med allmänt tillgängliga bioinformatiska verktyg ( t.ex. Mothur).Den metod som presenteras här är enkel och billig, och bör göra det möjligt många laboratorier för att komma åt kraften i metagenomic sekvensering. Även om det varierar beroende på sekvense plattform som används, när biblioteken är konstruerade väldigt lite praktisk tid krävs, med de flesta av den process som automatiseras. För sekvense plattform som används här (Ion Torrent PGM), kan hela förfarandet utföras inom två dagars arbete. I skrivande stund (September 2013), reagens kostnaderna för exemplet beskrivs ovan var följande: PCR-förstärkning av 36 prover: $ 25, gelrening och PicoGreen DNA kvantifiering av 36 prover: $ 125, emulsion PCR för en sammanslaget amplikon prov : $ 150 och sekvense reagenser: $ 250, för totalt $ 550 eller $ 15 per prov eller $ 0,0015 per kvalitets filtrerad läsning. Detta pris inkluderar inte instrument servicekontrakt, instrument avskrivningar, tekniker lön och laboratorieutrymme.
tält "> En av de viktigaste stegen är att samla alla produkterna i ett ekvimolärt förhållande, för att hämta liknande antal läsningar för varje prov. PicoGreen kvantifiering användes här, men andra metoder kan vara lämpliga, men mindre exakt (t.ex. UV-kvantifiering, gel-baserad kvantifiering). Även genom att göra den mest exakta kvantifiering och poolning, det finns en viss variation i antalet läsningar per prov, och i den typiska körningen beskrivs i tabell 2 varierar den från 4,380 till 32,750 läser, med ett genomsnitt på 10.338 läsningar. Om bearbeta stort antal prov (mer än 40 till 50), kan en enda kolonn gelrening ersättas av gelrening i plåt eller rening med användning av pärlor med en stringent storlek cutoff (t.ex. AMPure pärlor) .Hittills är det mest använda nästa generations sekvenseringsteknologi för 16S rRNA genen 454. Ion Torrent sekvenseringsteknologi som används i detta protokoll är begreppsmässigt mycket liktill 454 och båda teknikerna är benägna att samma typ av sekvensfel. Inte överraskande visade det sig att Ion Torrent sekvense ledde sekvense resultaten mycket liknar 454 sekvense 10. Nyligen har många forskare undersökt användningen av Illumina teknologi för 16S rRNA-genen amplikon sekvense 18,19. I vilket fall skulle det vara lätt att anpassa det nuvarande protokollet för andra stationär sequencers såsom Illumina MiSeq eller 454 GS Junior genom att ändra fusions primersekvensema att matcha adaptrar och streckkoder som behövs för dessa sekvenseringsteknologier, som i metoden som nyligen beskrivna för Illumina MiSeq 19. Alternativt kunde forskarna följa steg 1 och 2 i protokollet beskrivs här och skicka de poolade amplikonema till en sekvense centrum där emulsionen PCR och sekvensering skulle utföras.
16S rRNA-genen läser trimmades och klassificerats med hjälp Mothur, men många andra analyser kan utföras på16S rRNA-genen amplikoner. Till exempel kan beta mångfald utvärderas genom beräkning av de Unifrac avstånden mellan varje provpar hjälp av proceduren beskriven vid http://unifrac.colorado.edu/ 20. Alpha mångfald index och antal operativa taxonomiska enheter av varje prov kan beräknas med hjälp av verktyg inom QIIME som AmpliconNoise 21 eller genom att använda det förfarande som beskrivs av Huse et al. 22 och finns inom Mothur.
De primers som användes här förstärks de variabla regionerna 3 och 4 från 16S rRNA-genen, men många andra regioner skulle kunna utformas. I föreliggande studie har 16S rRNA-gener amplifierades från växtmaterial och valet av primer gjordes för att undvika förstärkning av kloroplast 16S rRNA-genen 23,24. Det finns ett brett utbud av andra primers som finns som varierar i tid av produktlängden, taxonomisk makt och användbarhet 25,26. Men i samtliga fall 200-400 bp läsningar av 16S rRNA genen inte tillförlitligt klassificeras på artnivå och analyser är begränsade till släktet och högre taxonomiska nivåer. Andra gener kan vara mer lämpligt om det behövs informations artnivå, liksom cpn60 och rpoB gener 27,28. Framtida drastiska droppar i kostnaden för sekvensering och ökar i kraft av analytiska verktyg kan göra det möjligt att byta ut 16S rRNA genen sekvensering genom kul- metagenomik, men tills dess 16S rRNA genen sekvensering är fortfarande den gyllene standarden för miljömikrobiologi.
The authors have nothing to disclose.
Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.
Reagent | Company | Catalog Number |
Ion 314 Chip Kit v2 | Life Technologies | 4482261 |
Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 | Life Technologies | 4482006 |
Ion PGM Template OT2 200 Kit | Life Technologies | 4480974 |
HotStarTaq Plus Master Mix Kit | Qiagen | 203646 |
Primers and probes | IDT | NA |
Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
BSA 20 mg/ml | Roche | 10,711,454,001 |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65001 |