Verschillende muismodellen van midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) worden veel gebruikt in experimenteel onderzoek hersenen. Hier tonen we het model van transcraniële permanente distale MCAO die consistent zijn corticale infarct van een omvang die overeenkomt met die door de meerderheid van de menselijke ischemische beroertes schade veroorzaakt.
Beroerte is de derde meest voorkomende oorzaak van overlijden en een belangrijke oorzaak van verworven volwassen gehandicapten in de ontwikkelde landen. Slechts zeer beperkte therapeutische opties zijn beschikbaar voor een klein deel van de patiënten met een beroerte in de acute fase. Het huidige onderzoek is intensief op zoek naar nieuwe therapeutische strategieën en richt zich steeds meer op de sub-acute en chronische fase na een beroerte, omdat meer patiënten kunnen in aanmerking komen voor therapeutische interventies bij een verlengde tijdvenster. Deze vertraagde mechanismen omvatten belangrijke pathofysiologische studierichtingen zoals de post-stroke ontsteking, angiogenese, neuronale plasticiteit en regeneratie. Om deze mechanismen te analyseren en vervolgens te evalueren nieuwe targets, zijn experimentele takt modellen met klinische relevantie, lage sterfte en hoge reproduceerbaarheid gewild. Bovendien muizen zijn de kleinste zoogdieren waarbij een focale beroerte laesie kan worden geïnduceerd en die een breed spectrum van transgene modellenbeschikbaar. Daarom beschrijven we hier de muismodel van transcraniële permanente coagulatie van de middelste cerebrale slagader via electrocoagulatie distaal van de lenticulostriatal bloedvaten, de zogenaamde "coagulatie model". De resulterende infarct in dit model bevindt zich voornamelijk in de cortex; de relatieve infarct volume in verhouding tot de hersenen grootte overeenkomt met de meeste menselijke slagen. Bovendien is het model aan de bovengenoemde criteria van reproduceerbaarheid en lage sterfte. In deze video laten we zien de chirurgische methoden van een beroerte inductie in de "coagulatie-model" en rapporteren histologische en functionele analyse-instrumenten.
Beroerte is de derde meest voorkomende oorzaak van overlijden en een van de belangrijkste redenen van verworven volwassen gehandicapten in de ontwikkelde landen 1. Ongeveer 80% van de acute neurologische ziekte wordt veroorzaakt door hersen ischemie als gevolg van een belemmering van de cerebrale bloedstroom terwijl ongeveer 15% wordt veroorzaakt door een intracerebrale bloeding 2. Ondanks het lopende onderzoek, intraveneuze toediening van weefselplasminogeenactivator is de enige goedgekeurde farmacologische behandeling voor ischemische beroerte tot nu toe en alleen beschikbaar voor een minderheid van de patiënten met een beroerte als gevolg van de korte goedgekeurd tijdvenster van 4,5 uur na de beroerte 3,4. Aangezien er geen in vitro modellen, die goed kan modelleren de complexe interacties tussen de hersenen, bloedvaten en systemische pathofysiologische mechanismen tijdens beroerte, diermodellen essentieel preklinische slagonderzoek.
Daarom hebben verschillende ischemische beroerte modellen zijn in een vari ontwikkeldschappij van soorten. Een van de meest gebruikte tweetaktmodellen de "filament model" waarbij een hechtdraad tijdelijk wordt ingebracht in de interne halsslagader en doorgestuurd totdat het uiteinde afsluit de oorsprong van de midden cerebrale slagader (MCA), waardoor een einde van de bloedstroom en daaropvolgende herseninfarct van subcorticale en bij langdurige occlusie ook corticale gebieden 5,6. In fototrombotisch modellen van ischemische beroerte, is een fotochemische occlusie van de bestraalde corticale vat bereikt na injectie van een fotosensibilisator resulteert in kleine, lokaal begrensd laesies 7. De permanente occlusie van de MCA distale van de lenticulostriatal slagaders kan worden bereikt door ligatie van de arterie, de voorbijgaande druk of door permanente coagulatie 8,9. De resulterende infarct in dit model treft vooral de neocortex 10 vanwege de occlusie van de MCA in dit model is distaal van de lentischeulostriatal slagaders, die de basale ganglia leveren.
Aangezien de meerderheid van de menselijke beroerte letsels bevinden zich op het grondgebied van de midden cerebrale slagader, alle gewone takt modellen lijken afsluitingen van het MCA of een van zijn filialen 11. De MCA is een van de grote slagaders die bloed levert aan de hersenen; dit voortvloeit uit de interne halsslagader, routes langs de laterale sulcus waar het dan takken en projecten om de basale ganglia en de zijvlakken van de frontale, pariëtale en temporale kwabben, met inbegrip van de primaire motorische en sensorische cortex. De rechter en linker MCA zijn verbonden met de voorste cerebrale arteriën en de achterste communicerende slagaders, die worden aangesloten op de achterste cerebrale slagaders, waardoor de Cirkel van Willis (figuur 1).
Zoals eerder gerapporteerd door Carmichael et al.. 11, infarcten gemodelleerd door de distale midden cerebrale Arterij Occlusie (MCAO) model bij muizen omvatten ongeveer 10-15% van de halve bol, waarbij een meerderheid van de menselijke beroerte laesies die zich in het corticale gebied MCA 11,12 nabootsen. In 1981, Tamura et al.. Beschreven permanent, transcraniële MCAO coagulatie model in ratten 8. De beschreven door Tamura model betrof een proximale occlusie van de MCA om de meer distale splitsing van de slagader te omzeilen. Zo is de originele "Tamura model" induceert niet alleen corticale ook striatale laesies, vergelijkbaar met de door de "filament model" 6 laesies. Hier beschrijven we de permanente distale MCAO model van transcraniële elektrocoagulatie in muizen. Daarnaast melden wij gerelateerde histologische en functionele methoden om de slag uitkomst in dit model te analyseren. Alle methoden zijn gebaseerd op standaard operationele procedures ontwikkeld en gebruikt in onze laboratoria.
Het huidige protocol beschrijft de experimentele slag model van distale, permanente MCAO door transcraniële electrocoagulatie – de zogenaamde "coagulatie-model". Dit model is inmiddels uitgegroeid tot een van de meest gebruikte diermodellen in experimenteel slagonderzoek 12. Vergeleken met andere focale hersenischemie modellen, de coagulatie model zoals gepresenteerd in deze video heeft het voordeel van een zeer korte werkingsduur van ongeveer 10 minuten wanneer uitgevoerd door een getrainde wetenschapper. Daarom kan korte verdoving tijden worden bereikt dit model, hetgeen een gunstig kenmerk van een experimenteel slagmodel vanwege de invloed van anesthetica op neuroprotectie en beroerte resultaat bekend 15. Zoals eerder beschreven door Carmichael et al.. 11, bevestigen we dat de resulterende infarctvolume en lokalisatie na distale permanente MCA coagulatie overeenkomt met ischemische hersenletsels in de meeste menselijkeslagen in verhouding tot omvang van de hersenen. Menselijke beroerte is meestal kleine grootte met laesies van ongeveer 5-15% van de halve bol, op basis van eerdere studies en klinische populatie imaging studies 16-18, in tegenstelling tot grote slag letsels met samendrukkende hersenoedeem die bij minder dan 10% van klinische slagen 19. Daardoor kan een beroerte laesies in de MCA gebied van ongeveer 12% van de halve bol bereikt door gepresenteerde model worden beschouwd als een translationeel relevante slagvolume. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat verschillende muizenstammen gebruikte verdoving protocollen de resulterende laesie volume 20 kunnen beïnvloeden.
Mortaliteit gedurende de observatieperiode na een beroerte inductie in dit model is vrijwel afwezig. De totale sterfte van minder dan 5% bestaat voornamelijk van de sterfgevallen tijdens de werking als gevolg van anesthesiologische complicaties of opoffering vanwege het bereiken van de uitsluitingscriteria. Om de lage v rechtvaardigenariability van dit model en de uitstekende reproduceerbaarheid, raden wij de volgende uitsluitingscriteria: 1) Een subarachnoïdale bloeding tijdens de operatie. 2) Werktijd langer dan 15 minuten. 3) rekanalisatie van de MCA na twee pogingen voor electrocoagulatie met slechts voorbijgaande MCAO. Bovendien moeten dieren dagelijks na MCAO (fundamentele fysiologische gedrag, bont uiterlijk en lichaamsgewicht) te controleren voor pijn, ongemak of ziekte gedrag worden onderzocht.
Verschillende maatregelen kunnen worden toegepast voor de analyse van een beroerte uitkomst zoals laser spikkel meting, magnetic resonance imaging, gedragstesten of histologische analyse. In dit protocol bieden wij illustratieve werkwijzen voor gedragsanalyse en infarctvolume analyse. Verscheidene testen voor gedragsanalyse na focale hersenischemie ontwikkeld en gebruikt in experimenteel slagonderzoek. Geschikt tests voor sensomotorische dysfunctie eerder door onze groep die in deze slag model 21,22 were de Rotarod proef 23, Sticky-label proef 24, Corner-test 25 en de cilinder-test 13, dat wordt aangetoond in deze video. De cilinder-test toont consequent motor asymmetrie in de acute fase na distale permanente MCAO en ook detecteert opeenvolgende herwinnen van motorische functies.
Ondanks de duidelijke voordelen enkele beperkingen van deze slag model rekening moet worden gehouden. Eerst wordt een trepanatie van de schedel nodig om de slagader coaguleren, waardoor een potentiële toegang peri-operationele herseninfecties produceren, hoewel bacteriële infecties van de operatiewond, temporale spier of de hersenen zelf nooit gedetecteerd door onszelf of gedocumenteerd door anderen met behulp van dit model. Bovendien kan mechanische beschadiging van de cortex tijdens bereiding en coagulatie niet worden uitgesloten, maar kan worden beperkt door zorgvuldige boren en verwijdering van de schedel, voortdurende bevochtiging van het chirurgisch en minimale ne cessary electrocoagulatie (zie uitsluitingscriteria). Hoewel tijdens de MCA zoals in figuur 2 is in de meeste C57BL / 6 muizen, beschrijven wij in het protocol hoe in normale variaties van de cursus vaartuig model variabiliteit te minimaliseren. Verder stellen we het gebruik van meerdere (3 bij bifurcatie, 2 zonder splitsing van de MCA) occlusie plaats om het risico van gedeeltelijke recanalization van de MCA, die onze ervaring is een belangrijke factor voor de variabiliteit van dit model te minimaliseren.
Qua gedragstesten kunnen slechts kleine gedragstekorten worden gedetecteerd in de bovengenoemde gedragstesten en functionele regeneratie kan worden waargenomen binnen de eerste week na een beroerte. Zo zouden meer geavanceerde testsystemen met hogere gevoeligheid en kwalitatieve testparameters zoals de vakman bereiken proef 27 geschikter voor de lange termijn functioneel resultaat te detecteren in dit model.
NHOUD "> Tenslotte vanwege de permanente coagulatie van de MCA geen reperfusie kan worden verkregen, welke kenmerkend is waargenomen in een aanzienlijk percentage van patienten door onge stolsel of therapie 28. echter een eerder beschreven trombo slagmodel 26 voorziet de optie voor een gratis beroerte model met reperfusie van corticale hersenen ischemie. Tezamen de hoge reproduceerbaarheid, de mogelijke lange-termijn waarneming vanwege minimale sterfte en de vergelijkbare relatieve infarctvolume en lokalisatie ten opzichte van de menselijke beroerte te onderscheiden van de "coagulatie model" als een waardevol model voor fundamenteel en translationeel onderzoek beroerte.The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de voortreffelijkheid cluster van de Duitse Research Foundation "München Cluster Systems voor Neurologie (synergie)" en door de Daimler-Benz stichting naar AL
Camera Canon Eos 500D | Canon | optics: 18-55 mm; 30 fps; 640×480 video function | |
Mirror | Kristallform | 2677089 | 30×30 cm |
Transparent acrylic glass cylinder | H&S Kunststofftechnik | diameter: 8 cm, height: 25 cm | |
Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
Forceps | FST | 11616-15 | |
Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
Saline solution | Braun | 131321 | |
Bepanthen pomade | Bayer | ||
Isoflurane | Abbot | B506 | |
Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
Electrosurgical device | ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgiegerät | ||
Drill | Proxxon | D-34343 | |
Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
Xylacine | Albrecht | ||
5ml Syringe | Braun | ||
Phosphate Buffered Saline PH: 7,4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
Isopentane | Fluka | 59070 | |
Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 |