Denne protokol forklarer primær Lgr5-positve organoide kultur og den efterfølgende udførelse af retroviral transduktion. Dette muliggør Cre-inducerbar overekspression eller knockdown af den leverede transgen og tillader funktionelle undersøgelser, der skal gennemføres i romanen in vitro organotypisk modelsystem.
Lgr5-positive stamceller kan suppleres med de væsentlige vækstfaktorer EGF, Noggin, og R-Spondin, som tillader os at kultur stadigt ekspanderende primære 3D epiteliale strukturer in vitro. Både arkitektur og fysiologiske egenskaber af disse »mini-indvolde«, også kaldet organoids, nøje ligne deres in vivo kolleger. Dette gør dem til et attraktivt modelsystem til tyndtarmens epitel. Ved hjælp af retroviral transduktion, kan funktionelle genetik nu udføres ved betinget gen overekspression eller knockdown. Denne video viser proceduren for organoide kultur, generering af retrovirus, og den retrovirale transduktion af organoids at hjælpe fænotypisk analyse af tyndtarmens epitel in vitro. Denne hidtil ukendte organotypisk modelsystem i kombination med retrovirale medieret genekspression giver et værdifuldt værktøj til hurtig analyse af genfunktion in vitro uden behov for costly og tidskrævende generation til transgene dyr.
High-throughput funktionelle genetik er nødvendig for at øge vores biologiske forståelse af kroppen, for at forbedre den nuværende grundlæggende videnskab og medicin. Mus genetik er guldstandarden til at undersøge genfunktion in vivo, men det er både tidskrævende og dyrt. Cellelinjer, er den anden fælles valg, har en højere kapacitet på og samtidig være billigere. Men de er hæmmet af deres manglende evne til at gengive den korrekte mikromiljø og dermed fysiologiske reaktioner ses in vivo. Der er således et entydigt behov for en nem at håndtere modelsystem, som giver cost / tidseffektive high throughput analyse, mens efterligne de fysiologiske reaktioner observeret i in vivo transgene (TG) museforsøg.
For endodermal epitel et sådant modelsystem udkom i 2009 1. Blandt viden fra opdagelsen af Lgr5-positive tarm stamceller, blevoplysninger om den niche, der svarer til de ekstra-cellulær matrix og vækstfaktorer der er nødvendige for stamcelle vedligeholdelse. Ved hjælp af disse oplysninger blev det muligt at etablere »mini-indvolde 'også kendt som organoids 2. For nylig en konsensus nomenklatur for in vitro-kulturer, hvor organoids er benævnt »enteroids«, blev foreslået 3. Ligesom cellelinjer, de organoids er stadigt voksende og let at behandle med ligander og inhibitorer. Men i stedet for at være to-dimensionelle de er tredimensionale selvorganiserende strukturer, som bevarer krypten-villus organisation samt stamceller og differentierede cellelinier i tyndtarmen (SI). Organoids består af et enkelt lag af epitelceller, der omgiver et luminale område. Fremspringende spirende strukturer svarer til tyndtarmens krypter, som indeholder knoglemarven. Begyndende fra spidsen af den spirende struktur progenitorceller differentiere de af mirist mod epitelomkranset, hvor terminalt differentierede celler kaste ind i hulrummet. Sammenlignet med cellelinier denne ex vivo-system, nærmere rekapitulerer den normale fysiologi og er derfor en lovende model for tyndtarmens epitel.
I denne video protokol af retroviral transduktion, præsenterer vi en metode, der gør det muligt for ex vivo genfunktion undersøgelser i denne roman organoide kultur-system. Vi starter med at beskrive organoide kultur i en trin-for-trin måde, og fortsætte med at demonstrere generation af retrovirus efterfulgt af transduktion procedure. Endelig er der et afsnit for yderligere råd til fejlfinding. En fordel ved denne teknik er, at den kan kombineres med billeddannelse eller lægemiddel-screening for at studere homeostase, cell fate beslutninger og celle-celle-interaktioner i tarmepitelet. På grund af deres enkle arkitektur og hurtig omsætningshastighed, organoids udgør en ideel model system for at studere voksne stamceller biologi. Desuden kan anvendes retrovirustransduktion til organoids afledt af forud etablerede transgene mus såvel som humane patientprøver. Som knock-in og knock-out tilgange ikke kan udvides til mennesker, de menneskelige SI organoids udgør et attraktivt alternativ.
Sammenfattende genmanipulation gennem retroviral transduktion tillader fænotypeanalyse i små tarm organoids afledt fra mus eller humane vævsprøver og dermed supplere muse genetik og cellelinjer, mens du åbner nye muligheder for studier i humane stammer væv. Retrovirustransduktion muliggør GAIN- og tab af funktion undersøgelser, der skal udføres i organoide kultur system 4. Dette gør det en værdifuld ressource for at undersøge gen-funktion, voksne stamceller biologi og sygdom og samtidig være i overensstemmelse med de tre R'er (reduktion, forfining og erstatning).
For at opnå høj transduktionseffektivitet visse aspekter er kritiske. Den ene er den forbehandling af organoids med ENRWntNic medier indtil de vedtager en rund cystisk form. Dette øger antallet af stamceller og dermed mulighed for at opnå en stabil integration af transgenet, samt øge overlevelsesraten for SI organoids hele transduktion proceduren. En anden parameter er inkubationstiden efter spinoculation. For kort eller for lang inkubationstid resulterer i dårlig transduktionseffektivitet og dårlig overlevelse organoids hhv. Det spinoculation trin er ikke afgørende, selv om det øger procentdelen af transducerede organoids. Endelig højtiter-virus er afgørende for succesfuld transduktion. Denne er afhængig af typen af emballage cellelinie og virus. Kombinationen af platin-E cellelinie og murin stamcelle-virus (MSCV), blev fundet at frembringe en titer højt nok til transduktion af organoids.
ve_content "> Her er tips til fejlfinding, som kan bidrage til at opnå en vellykket transduktion. det første, hvis transfektion af pakkecellelinien er dårlig, skal du sørge for, at sammenflydning af cellerne er mellem 70-80%, og at inkubationstiden for pooled PEI-DNA-blandingen er mellem 20-30 min. overlevelsen af de organoids under transduktion stærkt afhænger af størrelsen fragmentet. For lang trypsinisering forårsager størstedelen af fragmenter at bestå af mindre end 3 celler og derved mindsker organoide overlevelsesevne. En anden faktor er aktiviteten af Wnt konditionerede medium, hvis aktiviteten for lav styrke den gennem tilsætning af CHIR99021 i en arbejdsgruppe koncentration på 5 uM kan øge overlevelse. CHIR99021 hæmmer GSK3p, hvilket resulterer i øget Wnt-signalering. Endvidere Y-27362, som forhindrer anoikis tilsættes til transduktion medier til forbedring organoide overlevelsesevne, da organoids forstyrres til fragmenter (indeholdende 1-10 celler) før transduktion. Som60; nævnt ovenfor bør inkubationstiden efter spinoculation ikke overstige 6 timer. Endelig, hvis der observeres dårlig transduktion de ovennævnte faktorer, der påvirker den virale titer og størrelsen grænse for indsats til retrovirusvektoren bør overvejes. Effektiviteten af knockdown er meget afhængig af miRNA. Eftersom effektiviteten varierer med kombinationen af målgenet og miRNA er det værd at udføre en effektivitet skærmen for at identificere dem, der fungerer bedst.Teknikken er begrænset til de epiteliale fænomener organoide systemet. I fremtiden vil det være muligt at studere infektiøse eller immun-medierede sygdomme gennem co-kultur af patogener eller rekonstitution med komponenter afledt fra immunsystemet hhv. Desuden kan retrovirus kun bære skær af en relativt lille størrelse. Derfor har naturligt forekommende regulatoriske regioner, der skal udelukkes, og derfor ekspression af transgenet kan ikke efterligne detdet endogene gen. Som nævnt ovenfor knockdown effektivitet er afhængig af målgenet og miRNA. Hvis der ikke kan findes miRNA med passende knockdown effektivitet det kan begrænse brugen af teknik for den pågældende mål-gen.
Teoretisk organoids er kompatible med alle standardiserede manipulerende teknikker, der anvendes til cellelinier. Retrovirustransduktion var den første metode, der skal indberettes 4, og for nylig BAC (bakteriel kunstigt kromosom) -transgenesis er blevet tilgængelig 5. Med den samlede tid af 2-3 uger efter transfektion af det virale plasmidet i pakkende cellelinie, det er betydeligt hurtigere end dannelsen af en transgen (Tg) mus. Ved at opretholde in vivo krypt-villus arkitektur mens indeholdende stamceller samt alle differentierede cellelinier af tarmepitelet det organoide dyrkningssystem bro mellem tg dyr og tidligere anvendte cellekultur.
<pclass = "jove_content"> Den her beskrevne protokol giver en metode til at udføre fænotypisk analyse af endodermal epitel in vitro gennem GAIN- og tab af funktion studier. Dette gør det muligt at tage fat fysiologisk relevante spørgsmål i voksne stamceller biologi, med et minimalt behov for tg mus. For eksempel kunne frembringelsen af betingede knockout-mus undgås ved organoids afledt fra nyfødte mutanter med perinatal letalitet 6. Desuden kan teknikken anvendes på organoids afledt fra den tidligere etablerede knockout-mus for at undersøge den rolle, paraloger ved at udføre yderligere knockdown 7,8.Efter etableringen af tyndtarmen organoids har tilpasning af den oprindelige kultur protokol tillod dyrkning af pancreas, lever, tyktarm og mave epiteler 9-11. Desuden har de menneskelige tarm organoids og tumor organoids stammer fra normale humane biopsier, primær Adenoma og endetarmskræft biopsier 10. Den virusinfektion protokol kan let udvides til disse typer af organoids og giver en hidtil uset måde at udføre funktionelle undersøgelser i humane stammer væv.
Tilsammen retroviral transduktion af tyndtarmens organoids er en værdifuld ressource for at undersøge stamcelle vedligeholdelse, differentiering og celle skæbne beslutning, samt cellesignalering og celler celle interaktioner.
The authors have nothing to disclose.
Koo BK og Mustata RC understøttes af Sir Henry Dale Fellowship fra Wellcome Trust og Andersson-Rolf A er støttet af Medical Research Council (MRC). Fink J er støttet af Wellcome Trust 4-årigt ph.d.-programmet.
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin- Streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
mouse EGF 500 µg/ml | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
mouse Noggin 100 µg/ml | Peprotech | 250-38 | |
R-Spondin conditioned medium | The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
Wnt conditioned medium | The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
Y-27632 10 µM | Sigma | Y0503-1MG | |
Polybrene 8 µg/ml) | Sigma | H9268-5G | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) supplied by AMSBIO can be used as an alterntive. |
24 well plate | Greiner Bio One | 662960 | |
48 well plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma | A3734-1MG | |
Platinum- E cells | Cell biolabs | RV-102 | |
Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
Blasticidin | Invitrogen | A1113902 | |
Polyethyleneimine (PEI) | Polysciences | 23966 | |
opti-MEM | Life Technologies | 51985-034 | |
TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
4-OHT | Sigma | H7904 |