Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

doi: 10.3791/51765 Published: August 11, 2014

Summary

이 프로토콜은 기본 Lgr5-positve organoid 문화와 레트로 바이러스 전달의 후속 성능을 설명합니다. 이 시험관의 Organotypic에 소설에서 수행 할 기능 연구를 전달 유전자의 Cre 호텔 유도 과발현 또는 최저을 가능하게하고 있습니다 모델 시스템.

Abstract

Lgr5 양성 줄기 세포가 중요한 성장을 보충 할 수있는 것은 EGF, 개가 밀, 문화가 체외에서 차 3D 상피 구조를 끊임없이 확장 우리를 할 수 있습니다 R-Spondin을 요인. 두도 organoids라는이 '미니 용기'의 구조 및 생리 학적 특성은 밀접하게 자신의 생체와 비슷합니다. 이것은 그들이 소장 상피 세포에 대한 매력적인 모델 시스템 있습니다. 레트로 바이러스 형질 도입을 이용하여 유전자의 기능은 현재 조건부 유전자 과발현 또는 최저 의해 수행 될 수있다. 이 동영상은 organoid 문화의 절차, 레트로 바이러스의 생성, 시험 관내에서 소장 상피 세포의 표현형 분석을 지원하기 위해 organoids의 레트로 바이러스 전달을 보여줍니다. 레트로 바이러스 매개 유전자 발현과 함께이 신규의 Organotypic 모델 시스템 costl의 필요없이 시험 관내에서 유전자 기능을 신속하게 분석하기위한 유용한 도구를 제공한다형질 전환 동물에 대한 y를 시간이 많이 소요되는 세대.

Introduction

하이 스루풋 기능 유전학 전류 기초 과학 및 의학 향상시키기 위해, 우리 몸의 생물학적 이해를 높일 필요가있다. 마우스 유전학은 시간 소모적이고 비용이 모두 있지만, 생체 내에서 유전자의 기능을 조사하는 금 표준이었다. 저렴하면서 다른 일반적인 선택되는 세포주는, 높은 처리 용량을 가지고있다. 그러나, 이들이 생체 내에서 본 적절한 미세 환경함으로써 생리적 반응을 재현하는 그들의 무능력에 의해 방해된다. 따라서, 비용 / 시간 효율적인 처리량 분석 동안 허용하기 쉬운 손잡이 모델 시스템에 대한 명백한 필요성이 존재 생체 내 유전자 전이 온도 (Tg) 마우스 실험에서 관찰 된 생리적 반응을 모방.

내배엽 상피를 들어 하나의 모델 시스템은 2009 년 1 나타났다. 지식 Lgr5 양성 장 줄기 세포로부터 얻은 발견 하였다 중에서도줄기 세포의 유지 보수에 필요한 세포 외 기질과 성장 요인에 대응하는 틈새 시장에 대한 정보를 제공합니다. 그것은 또한 organoids 2로 알려진 '미니 용기'를 구축 할 가능하게되었다이 정보를 활용. 최근 organoids가 'enteroids'라고합니다 체외 문화에 대한 공감대 명명법은 세를 제안했다. 세포주와 마찬가지로, organoids는 끊임없이 확장 및 리간드 및 억제제로 처리하기 쉽다. 그러나, 대신에 이차원 인의 이들은 입체 자기 조직화 토굴-융모 조직을 유지하는 구조뿐만 아니라 줄기 세포 및 소장 (SI)의 분화 된 세포 계통이다. Organoids는 내강 영역을 둘러싸는 상피 세포의 단일 층으로 구성. 신진 돌출 구조는 줄기 세포 구획을 포함하는 작은 창자 지하실에 대응한다. 그들은 MI로서 신진 구조의 선단부터 출발 전구 세포는 분화말기 분화 세포가 루멘으로 발산하는 상피 향해 쇠 격자. 세포주에 비해,이 시스템은 생체 더 밀접 정상적인 생리학을 되풀이하기 때문에 소장 상피위한 유망한 모델 시스템이다.

레트로 바이러스 형질 도입이 동영상 프로토콜에서는이 신규 organoid 배양 시스템에서 생체 외 유전자 기능 연구를 가능하게하는 방법을 제시한다. 우리는 단계별 방식으로 문화를 organoid 설명함으로써 시작하고, 전달 절차에 의해 다음에 레트로 바이러스의 생성을 보여줌으로써 계속합니다. 마지막으로, 문제 해결을위한 추가 조언 섹션이있다. 이 기술의 장점은 장내 상피 항상성, 세포 운명 결정 및 세포 - 세포 상호 작용을 연구하는 라이브 영상 또는 약물 스크리닝과 결합 될 수 있다는 것이다. 때문에 자신의 간단한 구조와 빠른 회전율로, organoids 이상적인 모델들 대표성체 줄기 세포 생물학 연구를위한 ystem. 또한 레트로 바이러스 전달은 미리 설정된 트랜스 제닉 마우스뿐만 아니라 인간 환자로부터 유도 된 시료 organoids에 적용될 수있다. 에 노크 노크 아웃 방식은 인간에게 확장 할 수 없기 때문에, 인간의 SI의 organoids는 매력적인 대안을 구성한다.

요약하면, 레트로 바이러스 전달을 통해 유전자 조작은 인간 유래의 조직에서 연구에 새로운 길을 여는 동안하여 마우스 유전학과 세포 라인을 보완, 쥐 또는 인간의 조직 샘플에서 파생 된 소장 organoids의 표현형 분석을 할 수 있습니다. 레트로 바이러스 형질 도입은 이득이 가능하고 기능 상실 연구 organoid 배양 시스템 (4)에서 수행된다. 이것은 세 루피 (감소, 정제 및 교체)에 따른하면서 유전자 기능, 성체 줄기 세포 생물학 및 질병을 조사하는 귀중한 자원한다.

Protocol

다음 프로토콜에 사용 된 모든 마우스는 무균 상태를 유지하고, 모든 절차는 영국 홈 오피스 규정에 따라 수행되었다.

1 준비

  1. 사용에 앞서 미디어 1 시간을 준비 적어도 10 분 사용하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 사전 따뜻한 (표 1 및 재료 목록 자세한 내용 참조).

2 배양 소장 (SI) Organoids

참고 : 달리 명시되지 않는 한, 모든 인큐베이션은 가습 배양기에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 수행됩니다. 살아있는 세포와 접촉 장비 및 시약은 멸균해야합니다.

사전 예열이 지하 매트릭스 (마트 리겔 또는 BME)이 시드 때 퍼지는에서 드랍 방지로 조직 배양 플레이트 것이 중요합니다. 또한, 지하 행렬은 항상 얼음에 보관해야합니다. -20 ° C와 해동에서 보관사용하기 전에 얼음에.

  1. 납골당을 분리
    1. 소장의 격리를 위해 그 때, 국가 규칙 및 규정에 따라 마우스를 희생의 뒷면에 동물을 배치하고 70 % 에탄올로 복부를 씻는다. 흉골에 사타구니에서 길이 중간 선 절개를 수행합니다. 먼저, 피부 후 피하 조직을 잘라. 위장 맹장에서 소장을 제거합니다. 십이지장, 소장 및 회장에서 분리 된 납골당은 organoid 문화에 사용할 수 있습니다.
    2. 칼슘 또는 마그네슘 (PBS0)없이 미리 냉각 된 인산염 완충 식염수와 격리 소장을 씻으십시오.
    3. 3~5cm 긴 조각으로 조직을 절단하고 길이 방향으로 자르면 가위를 사용합니다. 집게를 사용하여 조직을 확산.
    4. 커버 슬립을 사용하여 융모를 다 쳤어요. 주의, 너무 많은 힘이 찢어 조직의 원인이됩니다 및 단계는 다음의 지하실의 수율을 감소시킬 것이다.
    5. 미리 냉각 된 PBS0 날기를 함유 50ml를 튜브에 조직을 이동시켜g 집게. 격렬 통해 조직 조각을 씻고 PBS0을 변경합니다. 2 ~ 3 배를 반복하거나 PBS0 덜 흐린 꺼질 때까지.
    6. 튜브 롤러에 4 ° C에서 30 분 동안 1 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)와 PBS0의 30 ML을 포함하는 50 ML 튜브에서 조직을 품어.
    7. 적극적으로 튜브를 흔들 5 mM의 EDTA와 PBS0의 30 ML을 포함하는 또 다른 50 ML 튜브에 조직을 전송합니다. (이전에 조직 포함)을 1 mM의 EDTA 용액 소낭 및 융모의 혼합물을 포함 할 것이다. 종종 융모의 높은 비율로 포함 분획이 organoids의 시드에 적합하지 않다.
    8. 튜브 롤러에 4 ° C에서 1 시간 동안 조직을 더 품어.
    9. 적극적으로 튜브를 흔들 깨끗한 50 ML 튜브에서 솔루션을 수집합니다. 지하실의 존재를 확인하고 광학 현미경에 의해 50 μL의 지하실을 계산하여, 예를 들어 수를 추정한다. 50-100 지하실을 구하여 1.5 ML의 t에 전송하는 데 필요한 양을 계산우베.
    10. 5 분 동안 300 XG에 스핀. 상층 액을 버리고 미리 예열 24 웰 플레이트에 지하 행렬의 50 μL에서 펠렛 종자를 재현 탁. 지하 행렬은 중합 있도록 5 ~ 15 분 동안 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어.
    11. 500 μL ENR 매체와 오버레이 (표 1 참조). 작은 원형 낭성 모양을 보여줍니다 organoids 파종 후와 구조 신진 다른 2-3일 후 약 24 시간이 표시됩니다. 3 일마다 신선한 ENR 미디어로 변경합니다.
    12. 항로는 7 일마다 문화를 organoid.
  2. 계대 및 유지 Organoids
    1. 매 3 일 통과 한 미디어를 새로 고쳐 organoids 유지 : 루멘은 죽은 세포, 약 7 일마다 가득 채워져 5로 : 3 일.
    2. 1 ml의 pipetman 팁을 사용하여 매체 지하 매트릭스 돔 휴식 및 1.5 ML 튜브에 잘에서 전송합니다.
    3. 기계적 피펫을 통해 organoids을 떼어 놓다pproximately 50 배 벌금 (예를 들어, 200 μL) 팁을 사용.
    4. 5 분 동안 300 XG에 스핀.
    5. 뜨는을 취소하고 지하 행렬의 150 ~ 250 μL에 펠렛을 재현 탁. 씨앗 24 웰 플레이트 (/ 웰 지하 행렬의 50 μl를) 사전은 따뜻하게. 코팅 한 지하 행렬 상하 팁의 벽을 피펫 파종 전에. 피펫은 천천히 확산 지하 행렬을 방지하기 위해 잘 중간에 거품과 씨앗을 방지 할 수 있습니다. 이 웰의 중심에 지하 행렬의 돔을 얻는 것이 바람직하다.
    6. 지하 행렬은 중합 있도록 5 ~ 15 분 동안 조직 문화 배양기에서 배양한다. 물론 당 500 μL의 ENR 미디어와 오버레이.

3 전 감염 SI Organoids의 치료

NOTE도 1은 형질 도입 절차를 도시한다.

  1. ENRWntNic에 환율 ENR은 중간 (표 1 참조) t에 organoids 성장삼일 또는 그들이 낭성 형태를 채택 할 때까지 최소 자신의 매체. 니코틴 아미드 (닉) 문화 효율을 개선하면서 Wnt3a는 줄기와 Paneth 세포의 수를 증가시킨다.

4 바이러스 생산

  1. 플래티넘-E 세포 중 하나 150mm의 요리는 감염에 필요한이. 종자 약 퓨로 마이신 (1 μg / ml) 및 블라스트 (10 μg / ㎖)의 존재 하에서 15 ~ 18 ㎖의 매체 (DMEM + 10 % FBS) 5 × 106 세포. 그들은 70~80%의 포화 상태에 도달 할 때 2 ~ 3 일 후에 세포를 형질. 퓨로 마이신없이 형질 전환 이전에 블라스트 DMEM + 10 % FBS에 매체를 변경합니다.
  2. OPTI-MEM 1 ㎖를 포함하는 튜브를 분리하는 폴리에틸렌 이민 (PEI)의 레트로 바이러스 DNA 구조의 30 μg과 240 μl를 추가합니다. 혼합하고 5 분 동안 실온에서 배양한다.
  3. 이 솔루션을 수영장과 20 ~ 30 분 동안 실온에서 배양한다. 플래티넘-E 세포의 매체에 완전한 혼합물을 추가하고 조심스럽게 작은지면을 흔들전자는 DNA-PEI 단지의 동등한 분배를 보장합니다.
  4. 밤새 형질 전환 혼합물과 백금-E 세포를 품어 매체에게 다음과 같은 일을 새로 고칩니다. 이일을 위해 새로운 매체의 세포를 유지합니다.
  5. , 50 ML 팔콘 튜브 만 매체를 수집 12-16 시간 동안 4 ° C에서 8,000 XG에서 0.45 μm의 필터와 원심 분리기를 통해 전달합니다. 상등액을 버리고 전달 매체의 250 μL에 펠렛을 재현 탁 (표 1 참조).

5 Organoid 조각 준비

  1. 한 감염은 24 웰 플레이트에서 잘 하나가 필요합니다. 1 ml의 pipetman 팁을 사용하여 매체 지하 매트릭스 돔 휴식 및 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
  2. 미세한 볼륨 팁 (예를 들어, 200 μL 팁) 피펫 (30-50x)를 통해 organoids를 기계적으로 방해하기 위해 사용합니다. 이 솔루션은 흐린 될 것입니다 더 전체 organoids는 볼 수 없습니다.
  3. 5 분 동안 실온에서 원심 분리, 900 XG .
  4. 상층 액을 제거하고 세포 배양 등급 재조합 단백질 분해 효소 (예를 들어, TrypLE)의 500 μL에 펠렛을 재현 탁. 5 분 동안 37 ° C에서 품어. 배양 한 다음 프래그먼트 당 세포의 수를 세고, 광 현미경을 사용하여 organoid 단편의 크기를 확인한다. 5-10 세포를 포함하는 단편은 이상적이다. 단편의 대부분은 세포의 더 높은 번호를 포함하는 경우 배양 시간은 시간에 2 분으로 증가 될 수있다.
  5. ENR 배지 500 μl를 첨가하여 분해 처리를 종료한다.
  6. 실온에서 원심 분리기, 5 분 동안 900 XG. 상층 액을 제거하고 얼음 또는 4 ° C에서의 펠렛을 유지합니다.

6 레트로 바이러스 형질 도입

  1. 48 웰 플레이트 잘 하나에서 (4.5부터) 레트로 바이러스 솔루션의 250 μL와 organoid 조각을 결합합니다. 1 ㎖의 pipetman 팁을 사용하여 천천히 피펫으로 가볍게 섞는다.
  2. 파라 필름과 판을 밀봉합니다.
전자 "> 7. Spinoculation 및 도금

  1. 1 시간 동안, 32 ° C, 600 XG에서 접시를 원심 분리기. 조심스럽게 파라 필름을 제거하고 6 시간 동안 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어.

감염 Organoid 조각의 8 시드

  1. 5 분 동안 900 XG에 1.5 ML 튜브, 스핀에 우물에서 감염된 organoid 조각 및 전달 매체를 전송합니다.
  2. 뜨는을 취소하고 멋진 5 분 동안 얼음에 펠렛을 포함하는 튜브를 넣어. 지하 매트릭스의 100 μl를 추가하고 위아래로 천천히 피펫 팅하여 펠렛을 재현 탁.
  3. 새로운 24 웰 플레이트에 50 ㎕의 '혼합 -cell 지하 매트릭스'의 종자 삭제합니다. 지하 매트릭스 응고 될 때까지 5 ~ 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
  4. 우물에 폴리 브렌없이 전달 매체를 추가하고 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어. 2-3 일마다 미디어를 변경합니다.

9 선택

  1. 시작 자체미디어에 퓨로 마이신 (1 μg / ml)에 추가하여 2~3일 후 성귀.
  2. 조각이 형성 organoids 퓨로 마이신 (1 μg / ml)로 보충 ENR 매체와 전달 매체를 대체하기 시작합니다.

(10) 후 감염 SI Organoids의 치료

  1. 문화에 따라 "과 Passaging 및 organoids을 유지"프로토콜 (2.2.1) organoids 형질. 1~2주 후 SI의 organoids는 신진 구조를 되 찾을 것입니다.
  2. 1 μM의 농도로 작동 hydroxytamoxifen 4-(4-OHT)를 추가하여 miRNA의 또는 cDNA의 발현을 유도 신진 구조물의 모양에 따라. 이 단계가 Addgene (pMSCV -에 loxP-DsRed의 -에 loxP-eGFP는 - 순수하지 않아-WPRE (32702), pMSCV -에 loxP-DsRed의 -에 loxP-3xHA - 순수하지 않아-WPRE (32,703), 그리고 pMSCV에서 레트로 바이러스 벡터를 사용하는 경우에만 유효합니다 차 돌려 - 순수하지 않아-DsRed의-GFP-miRNA가 (32704)) 먹어 치운다-ERT2을 표현 organoids.

감염 및 EXPR의 11 확인관심의 유전자의 ession / 억제

  1. Addgene (32702, 32703 및 32704)에서 레트로 바이러스 벡터를 사용하는 경우 전달 효율은 DsRed의 발현의 관찰에 의해 확인 될 수있다. 쿠 4에 예시 된 바와 같이 또한, 관심의 유전자의 발현 또는 억제는 GFP 또는 (유전자 녹다운을위한) 3xHA의 (유전자 과발현) 에피토프 및 qPCR에를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 확인 될 수있다.

Representative Results

Organoids 중앙 루멘 인해 죽은 세포 (그림 2)의 존재에 어두운 때 분할 할 준비가 된 것입니다. 전처리 organoids 2 ~ 3 일 후에 라운드 낭성 형태 (그림 3)을 채택해야한다. 이것은 안정한 통합을 얻는 가능성을 향상 줄기 세포의 수를 증가시킨다. 바이러스 펠릿의 크기로 인해 펠렛 크기로 세포 파편의 변화에​​ 기여, 바이러스 상청액 다음 원심 분리 가능성을 변할 수있다. 전달 효율에 명확한 상관 관계가 관찰되지 않았다. 사람 안정적인 통합이 남아하면서 선택 과정 동안 비 형질 organoids는 죽을 것이다. MSCV-eGFP는 레트로 바이러스에서 형광 단백질 (그림 4) 전달 다음 2~3일 내 낭성 형태를 가지고 생존 organoids에서 유래 세포에서 관찰 할 수있다.

= "그림 1"FO : 콘텐츠 너비 = "6 인치"SRC = "/ 파일 / ftp_upload / 51,765 / 51765fig1highres.jpg"너비 = "600"/>
그림 1 레트로 바이러스 전달 절차의 개략도. 이전 감염 organoids에 대한 사전 처리가 낭성 구조 (1 단계)을 채택 할 때까지 ENRWntNic을 사용하고 있습니다. 백금-E 세포 패키징 세포주로 사용하고, 그들은 70-80%의 포화 상태에 도달 할 때까지 배양된다. 그 후 그것들은 PEI를 사용하여 레트로 바이러스 구축물로 형질 감염된다. 바이러스는 이일 이상 (2 단계) 수확. Organoids 1-10 세포 (단계 3)를 포함하는 단편을 수득 트립신 처리하고, (단계 4)를 감염. 안정적인 통합 (7 단계)를 수행 할 수 있습니다와 spinoculation를 수행하면 감염 효율 (5 단계) 증가, 감염된 organoid 조각이 긍정적 인 클론 (6 단계) 2 ~ 3 일 후에 선택을 씨앗을 품고있다.

1765fig2highres.jpg "폭 ="500 "/>
그림 문화 4-6 일 후에 organoids의 2 대표 이미지. 루멘은 죽은 세포로 가득 어두워 표시하고있다. 이 단계에서 Organoids는 계대 할 준비가 된 것입니다.

그림 3
3~4일에 대한 ENRWntNic 미디어에서 배양 소장 organoids의 그림 3 대표 이미지. organoids는 낭성 형태를 채택한다.

그림 4
소장 organoids의 그림 4 대표 이미지 (a)는 바이러스 성 유전자 발현 (B, eGFP는)을 보여 그.

ADVAnced DMEM / F12 + + +
사주 4 ° C에서 보관
고급 DMEM / F12 500 ml의
Glutamax의 100 배 5 ML
헤 페스 한 M 5 ML
항생제의 100 배 5 ML
ENRWntNic 매체 (20 ㎖ 용)
이주 4 ° C에서 보관
고급 DMEM / F12 + + + 7.2 ml의
B27 보충제 (50 배) 400 μL
N2 영양 (100 배) 200 μL
N-아세틸 시스테인 (500 밀리미터) 50 μL
마우스 EGF (500 μg / ㎖) 2 μL
마우스 개가 밀 (100 μg / mL)에서 세척 하였다 20 μL
R-Spondin의 conditioned 매체 2 ML
Wnt3a 조정 배지 10 ML
니코틴 아미드 (1 M) 200 μL
전달 매체 (20 ㎖ 용)
신선한 준비
ENRWntNic 매체 20 ML
Y-27632 (10 μM) 20 μL
폴리 브렌 (8 μg / ㎖) 20 μL
ENR 매체 (20 ㎖ 용)
사주 4 ° C에서 보관
고급 DMEM / F12 + + + 17.4 ML
B27 보충제 (50 배) 400 μL
N2 영양 (100 배) 200 μL
N-아세틸 시스테인 (500 밀리미터) 50 μL
마우스 EGF (500 μg / ㎖) 2 μL
마우스 개가 밀 (100 μg / mL)에서 세척 하였다 20 μL
R-Spondin 조정 배지 2 ML
플래티넘-E 세포에 대한 미디어 (500 ml의 경우)
12 주 4 ° C에서 보관
DMEM 449.45 ML
태아 혈청 (FBS) 50 ML
퓨로 마이신 (1 μg / ㎖) 50 μL
블라스트 (10 μg / ㎖) 500 μL

플래티넘-E 세포에 대한 고급 DMEM / F12 + + +, ENRWntNic 매체, 전달 매체, ENR 매체와 매체에 대한 표 1 미디어 조성.

Discussion

높은 전달 효율 특정 부분이 중요한 달성하기 위해. 그들은 원형 낭성 형상을 채택 할 때까지 하나 ENRWntNic 매체와 organoids의 전처리이다. 이것은 줄기 세포의 수와 트랜스의 안정한 통합을 얻을뿐만 아니라 전달 과정의 전반 SI organoids의 생존율을 증가시켜 기회를 증가시킨다. 또 다른 매개 변수는 spinoculation 다음 배양 시간이다. 각각 가난한 전달 효율과 organoids의 가난한 생존, 너무 짧거나 너무 긴 배양 결과. 그것은 현저하게 형질 organoids의 비율을 증가시킨다하더라도 spinoculation 단계는 필수적인 것은 아니다. 마지막으로, 높은 역가의 바이러스가 성공적으로 전달하기위한 열쇠입니다. 이것은 패키징 세포주 및 바이러스의 종류에 의존한다. 백금 E 세포주 및 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV)의 조합은, organoids의 전달에 충분한 높은 역가를 생성하는 것으로 확인되었다.

ve_content "> 다음은 성공적인 전달을 달성하는 데 도움이 될 수있는 문제 해결에 대한 도움말입니다. 포장 세포주의 형질이 좋지 않을 경우 첫째, 세포의 배양이 70 ~ 80 % 사이와의 배양 시간 있다는 것을 확인 풀링 PEI-DNA 혼합물을 20 ~ 30 분 사이입니다. 전달하는 동안 organoids의 생존은 매우 단편 크기에 따라 달라집니다. 너무 오래 트립신 미만 3 세포를 구성하는 조각의 대부분을 발생시켜 organoid 생존을 감소시킨다. 또 다른 요인은 Wnt에 조정 배지의 활성은, 활성이 너무 낮은 생존율을 증가시킬 수 5 μM의 작동 농도 CHIR99021의 첨가를 통해 증폭하는 경우. CHIR99021 증가 Wnt 신호의 결과로, GSK3 억제. 또한, Y-27362, 어느 방지 organoids 전에 전달에 단편 (1-10 세포를 포함)로 파쇄되기 때문에 anoikis는 organoid 생존 성을 향상시키기 위해 전달 매체에 첨가된다.로서는(60)는, 위에서 언급 한, spinoculation 후 배양 시간이 6 시간을 초과하지 않아야합니다. 나쁨 전달이 관찰되면 마지막으로 바이러스 역가 및 레트로 바이러스 벡터에 대한 인서트의 크기 제한에 영향을 미치는 전술 한 인자가 고려되어야한다. 최저의 효율성의 miRNA에 크게 의존한다. 효율이 표적 유전자의 miRNA와의 조합에 따라 변화하기 때문에 그것이 가장 잘 작동 자들을 식별하는 효율 화면을 수행 가치가있다.

이 기술은 organoid 시스템의 상피 현상으로 제한됩니다. 향후에는 각각 면역계로부터 유래 성분과 병원균 또는 재구성의 공존 배양을 통해 감염성 또는 면역 - 매개 질환을 연구 할 수있을 것이다. 또한, 레트로 바이러스는 단지 상대적으로 작은 크기의 삽입을 수행 할 수있다. 결과적으로, 자연적으로 발생하는 규제 영역은 제외해야하므로 형질 전환 유전자의 발현의 모방 할 수 없습니다내생 유전자. 전술 한 바와 같이, 최저 효율 및 표적 유전자의 miRNA에 의존한다. 적합한 최저 효율의 miRNA가 전혀 발견되지 않는 경우는 해당 특정 표적 유전자에 대한 기술의 사용을 제한 할 수있다.

이론적으로, organoids 세포주에 사용되는 모든 표준화 된 속임수 기술과 호환됩니다. 레트로 바이러스 전달 4를보고 할 수있는 첫 번째 방법이고, 최근 BAC (박테리아 인조 염색체) -transgenesis 5 사용할 수있게되었다. 2~3주의 총 발생 시간, 패키징 세포주에 바이러스 플라스미드의 형질 감염 후에, 그 트랜스 제닉 (Tg)가 마우스의 세대보다 훨씬 빠르다. 줄기 세포뿐만 아니라 소장 상피 세포 분화의 모든 계통을 함유하면서 생체 토굴-융모 아키텍처를 유지함으로써, organoid 배양 시스템은 TG 동물과 이전에 사용 된 세포 배양 물 사이의 간극에 다리.

시험관 내에서 내배엽 상피 세포의 표현형 분석을 수행하는 방법 및 기능 연구의 loss-을 제공합니다. 이 TG 마우스의 최소한의 필요와 성체 줄기 세포 생물학의 생리 학적 관련 문의 사항에 답변을 제공하는 것이 가능합니다. 예를 들어, 조건부 녹아웃 마우스의 생성은 산기 치사 6 신생아 돌연변이로부터 유도 organoids를 사용함으로써 회피 될 수있다. 또한, 기술은 추가적인 최저의 7,8을 수행함으로써 paralogues의 역할을 연구하기 위해 이전에 설정된 녹아웃 마우스로부터 유도 organoids에 적용될 수있다.

소장 organoids의 설립에 따라, 원래 문화 프로토콜의 적응은 췌장, 간, 대장과 위 상피 9-11의 배양을 허용했다. 또한, 인간의 장내 organoids 종양 organoids는 기본 아덴, 정상적인 인간 생체 검사로부터 유도 된OMA 및 대장 암은 10 생검. 바이러스 감염 프로토콜은 쉽게 organoids 이러한 유형의 확장과 인간 유래 조직에서 기능 연구를 수행하는 전례없는 방법을 제공 할 수 있습니다.

종합적으로, 소장 organoids의 레트로 바이러스 전달은 줄기 세포 유지, 분화 및 세포 운명 결정뿐만 아니라, 세포 신호 및 세포 - 세포 상호 작용을 조사하는 유용한 자원이다.

Acknowledgments

쿠 BK와 Mustata RC는 의학 연구위원회 (MRC)가 지원하는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 및 앤더슨 - 롤프에서 헨리 데일 원정대에 의해 지원된다. 핑크 J는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 4 년 박사 - 프로그램에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12  Invitrogen 12634-034
Glutamax 100x  Invitrogen 35050-068
HEPES 1 M Invitrogen 15630-056
Penicillin-streptomycin 100x Invitrogen 15140-122
B27 supplement 50x Invitrogen 17504-044
N2 supplement 100x  Invitrogen 17502-048
n-Acetylcysteine 500 mM Sigma-Aldrich A9165-5G
Mouse EGF 500 µg/ml Invitrogen Biosource PMG8043
Mouse Noggin 100 µg/ml Peprotech 250-38
R-Spondin conditioned medium The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013.
Wnt conditioned medium The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013.
Nicotinamide 1 M Sigma N0636
Y-27632 10 µM Sigma Y0503-1MG
Polybrene (8 µg/ml) Sigma H9268-5G
Standard BD Matrigel matrix BD Biosciences 356231 Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02)
supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.
24-well Plate Greiner Bio One 662960
48-well Plate Greiner Bio One 677980
CHIR99021 Sigma A3734-1MG
Platinum-E cells Cell Biolabs RV-102
Puromycin Invitrogen A1113802
Blasticidin Invitrogen A1113902
Polyethyleneimine (PEI) Polysciences 23966
opti-MEM Life Technologies 51985-034
TrypLE Invitrogen 12605-010
Parafilm Sigma P7793-1EA
4-OHT Sigma H7904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  2. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
  3. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).
  4. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature. 9, 81-83 (2012).
  5. Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PloS one. 8, e76871 (2013).
  6. Mustata, R. C., et al. Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo. EMBO reports. 12, 558-564 (2011).
  7. Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476, 293-297 (2011).
  8. Koo, B. K., et al. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors. Nature. 488, 665-669 (2012).
  9. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).
  10. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  11. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J. Vis. Exp. (90), e51765, doi:10.3791/51765 (2014).More

Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J. Vis. Exp. (90), e51765, doi:10.3791/51765 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter