Detta protokoll förklarar primära Lgr5-positve organoid kulturen och den efterföljande prestanda retroviral transduktion. Detta gör att Cre-inducerbart överuttryck eller knockdown av den levererade transgenen och tillåter funktionella studier som skall utföras i romanen in vitro organotypisk modellsystem.
Lgr5-positiva stamceller kan kompletteras med den väsentliga tillväxtfaktorer EGF, Noggin, och R-Spondin, som tillåter oss att kulturen ständigt växande primära 3D epitelceller strukturer in vitro. Både arkitektur och fysiologiska egenskaperna hos dessa "mini guts", även kallade organoids, mycket lika deras in vivo motsvarigheter. Detta gör dem till ett attraktivt modellsystem för tunntarmens epitel. Använda retroviral transduktion, kan funktionella genetik nu utföras av villkor gen överuttryck eller knockdown. Denna video visar proceduren i organoid kultur, generering av retrovirus, och den retrovirala transduktion av organoids att bistå fenotypisk analys av tunntarmens epitel in vitro. Denna nya organotypisk modellsystem i kombination med retroviral medierad genuttryck ger ett värdefullt verktyg för snabb analys av geners funktion in vitro utan behov av costly och tidskrävande generation för transgena djur.
Hög genomströmning funktionella genetik behövs för att öka vår biologiska förståelsen av kroppen, för att förbättra nuvarande grundvetenskap och medicin. Mus-genetik har varit den gyllene standarden för att undersöka genfunktion in vivo, även om det är både tidskrävande och kostsamt. Cellinjer, som är den andra vanligaste valet, har en högre genomströmningskapacitet samtidigt som billigare. Men de hindras av sin oförmåga att återge korrekt mikromiljö och därigenom fysiologiska reaktioner ses in vivo. Därför finns det ett otvetydigt behov av ett lätt hantera modellsystem, vilket gör att kostnaden / tidseffektiv hög genomströmning analys, samtidigt som härma de fysiologiska reaktioner som observerats i in vivo transgena (tg) mus experiment.
För endodermalt epitel ett sådant modellsystem dök upp i 2009 1. Bland kunskap från upptäckten av Lgr5-positiva intestinala stamceller varinformation om den nisch som motsvarar de extracellulära matrix och tillväxtfaktorer som är nödvändiga för stamcells underhåll. Med hjälp av denna information blev det möjligt att upprätta "mini guts" även känd som organoids 2. Nyligen konsensus nomenklatur för in vitro-kulturer, där organoids benämns "enteroids", föreslogs 3. Liksom cellinjer, de organoids är ständigt växande och lätt att behandla med ligander och inhibitorer. Men istället för att vara tvådimensionell de är tredimensionella självorganiserande strukturer som behåller kryptan-villus organisation samt stamceller och differentierade cellinjer i tunntarmen (SI). Organoids bestå av ett enda skikt av epitelceller som omger en luminal yta. Utskjutande spirande strukturer motsvarar små tarm kryptor som innehåller stamceller. Utgående från spetsen på knoppstrukturen progenitorceller differentiera som de migaller mot epitelbeklädnaden där terminalt differentierade celler skjul i lumen. Jämfört med cellinjer, denna ex vivo-system rekapitulerar närmare den normala fysiologin och är därför en lovande modellsystem för tunntarmens epitel.
I den här videon protokoll av retroviral transduktion, presenterar vi en metod som gör det möjligt för ex vivo gen funktionsstudier i denna roman organoid odlingssystem. Vi börjar med att beskriva organoid kultur i en steg-för-steg sätt, och fortsätter genom att visa generering av retrovirus följt av transduktion förfarandet. Slutligen finns det en avdelning för ytterligare råd för felsökning. En fördel med denna teknik är att den kan kombineras med levande avbildning eller drogscreening för att studera homeostasis, beslut cell öde och cell-cell interaktioner i tarmepitelet. På grund av sin enkla arkitektur och snabb omsättningshastighet, organoids utgör en ideal modell ssystemprogram för att studera vuxna stamcellsbiologi. Dessutom kan tillämpas retroviral transduktion till organoids härrör från förutbestämda transgena möss samt humana patientprover. Som knock-in och knock-out metoder inte kan utvidgas till människor, de mänskliga SI organoids utgör ett attraktivt alternativ.
Sammanfattningsvis genmanipulation genom retroviral transduktion möjliggör fenotypisk analys i små intestinala organoids härledda från möss eller vävnadsprover mänskliga och därmed komplettera mus genetik och cellinjer samtidigt öppna nya vägar för studier i mänskliga härrör vävnader. Retroviral transduktion möjliggör GAIN- och förlust av funktionsstudier som ska utföras i organoid odlingssystemet 4. Detta gör den till en värdefull resurs för att undersöka geners funktion, vuxna stamcellsbiologi och sjukdomar samtidigt vara i enlighet med de tre R (minskning, förfining, och ersättnings).
För att uppnå hög transduktionseffektiviteten vissa aspekter är kritiska. En är förbehandling av organoids med ENRWntNic media tills de antar en rund cystisk form. Detta ökar antalet stamceller och därigenom möjligheten att erhålla en stabil integrering av transgenen, såväl som att öka överlevnadsgraden för de SI organoids hela transduktion förfarandet. En annan parameter är inkubationstiden efter spinoculation. För kort eller för lång inkubationstid resulterar i dålig transduktion effektivitet och dålig överlevnad organoids, respektive. Det spinoculation steget är inte nödvändigt även om det signifikant ökar andelen omvandlade organoids. Slutligen är hög titer virus nyckel för framgångsrik transduktion. Detta är beroende av den typ av förpackning cellinje och virus. Kombinationen av platina-E cellinjen och murina stamcellviruset (MSCV), befanns producera en titer tillräckligt högt för transduktion av organoids.
ve_content "> Här är tips för felsökning som kan bidra till att uppnå framgångsrik transduktion. första, om transfektion av packningscellinjen är dålig, se till att sammanflyt av cellerna är mellan 70-80% och att inkubationstiden för poolad PEI-DNA-blandningen är mellan 20-30 min. Överlevnaden av organoids under transduktion beror i hög grad på fragmentstorlek. För lång trypsinization orsakar majoriteten av fragment för att bestå av mindre än 3 celler och därmed minskar organoid överlevnadsförmåga. En annan faktor är aktiviteten av Wnt medium, om verksamheten för lågt öka den genom tillägg av CHIR99021 i en arbetskoncentration av 5 ^ M kan öka överlevnaden. CHIR99021 hämmar GSK3, vilket resulterar i ökad Wnt-signalering. Dessutom Y-27362, vilket förhindrar anoikis är som läggs till de överföringsmedia för att förbättra organoid överlevnads eftersom organoids störs till fragment (innehållande 1-10 celler) före transduktion.60; nämnts ovan bör inkubationstiden efter spinoculation inte överstiga 6 tim. Slutligen, om dålig transduktion observeras ovan nämnda faktorer som påverkar den virala titer och storleksgränsen av insatsen för retrovirusvektorn bör övervägas. Effektiviteten i knockdown är mycket beroende av miRNA. Eftersom verkningsgraden varierar med kombinationen av målgenen och miRNA det är värt att utföra en effektivitets skärmen för att identifiera de som fungerar bäst.Tekniken är begränsad till de epiteliala företeelser organoid systemet. I framtiden kan det bli möjligt att studera infektiösa eller immunmedierade sjukdomar genom samodling av patogener, eller rekonstitution med komponenter som härrör från immunsystemet, respektive. Dessutom kan retrovirus bara bära insatser av relativt liten storlek. Följaktligen har naturligt förekommande regulatoriska regioner som skall uteslutas och därför expressionen av transgenen inte kan efterlikna den hosden endogena genen. Såsom nämnts ovan är den knockdown effektivitet beroende målgenen och miRNA. Om man inte kan finna miRNA med lämpliga knockdown effektivitet kan begränsa användningen av tekniken för just målgen.
Teoretiskt organoids är kompatibla med alla standardiserade manipulativa tekniker som används för cellinjer. Retroviral transduktion var den första metod som skall rapporteras 4, och nyligen BAC (bakteriell artificiell kromosom) -transgenesis har blivit tillgängliga 5. Med en total generationstid av 2-3 veckor, efter transfektion av det virala plasmiden in i förpacknings cellinje, är det betydligt snabbare än generering av en transgen (tg) mus. Genom att upprätthålla den in vivo-crypt-villus arkitektur medan innehållande stamceller liksom alla differentierade cellinjer av tarmepitelet, överbryggar organoid odlingssystem gapet mellan tg djur och tidigare använda cellkultur.
<pclass = "jove_content"> Protokollet som beskrivs här ger en metod för att utföra fenotypisk analys av endodermalt epitel in vitro genom GAIN- och förlustfunktionsstudier. Detta gör det möjligt att ta itu med fysiologiskt relevanta frågor inom vuxenstamcellsbiologi, med ett minimalt behov av tg möss. Till exempel kan genereringen av villkorade knockoutmöss undvikas genom användning organoids härledda från nyfödda mutanter med perinatal dödlighet 6. Dessutom kan tekniken appliceras på organoids härledda från tidigare fastställda knockoutmöss för att studera rollen av paraloger genom att utföra ytterligare knockdown 7,8.Efter inrättandet av små tarm organoids har anpassning av den ursprungliga kulturen protokollet tillät odling av bukspottkörteln, levern, kolon och magen epitel 9-11. Dessutom har människans tarm organoids och tumör organoids härletts från normala mänskliga biopsier, primär adenoma och kolorektal cancer biopsier 10. Den virusinfektion protokoll kan lätt utvidgas till dessa typer av organoids och ger en oöverträffad sätt att utföra funktionella studier i humana härledda vävnader.
Sammantaget är retroviral transduktion av små tarm organoids en värdefull resurs för stamcells underhåll, differentiering och cell öde beslut, samt cellsignalering och celler cell interaktioner utreda.
The authors have nothing to disclose.
Koo BK och Mustata RC stöds av Sir Henry Dale Fellowship från Wellcome Trust och Andersson-Rolf A stöds av Vetenskapsrådet (MRC). Fink J stöds av Wellcome Trust 4-års PhD-programmet.
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin- Streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
mouse EGF 500 µg/ml | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
mouse Noggin 100 µg/ml | Peprotech | 250-38 | |
R-Spondin conditioned medium | The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
Wnt conditioned medium | The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013 | ||
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
Y-27632 10 µM | Sigma | Y0503-1MG | |
Polybrene 8 µg/ml) | Sigma | H9268-5G | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) supplied by AMSBIO can be used as an alterntive. |
24 well plate | Greiner Bio One | 662960 | |
48 well plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma | A3734-1MG | |
Platinum- E cells | Cell biolabs | RV-102 | |
Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
Blasticidin | Invitrogen | A1113902 | |
Polyethyleneimine (PEI) | Polysciences | 23966 | |
opti-MEM | Life Technologies | 51985-034 | |
TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
4-OHT | Sigma | H7904 |