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Medicine

Controllata corticale modello Impact per trauma cranico

doi: 10.3791/51781 Published: August 5, 2014

Introduction

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Lesione cerebrale traumatica (TBI) è definita come una alterazione nella funzione del cervello, o altro titolo di patologia cerebrale, causata da una forza esterna 1. TBIs rimangono un grave problema di salute in tutto il mondo, in particolare negli Stati Uniti. Secondo i Centers for Disease Control and Prevention, almeno 1,7 milioni di TBI si verificano ogni anno negli Stati Uniti con conseguente 30,5% di tutti i decessi lesioni correlate. Nel 2000, i costi medici diretti e costi indiretti di TBI ammontano a una cifra stimata 76,5 miliardi dollari nei soli Stati Uniti. Nonostante i progressi tecnologici e terapeutici in decenni precedenti hanno migliorato la qualità e la durata della vita per chi soffre di TBI, non farmaceutica efficace o trattamenti preventivi esistono attualmente. A causa della complessità e effetti di vasta portata di TBI, comprese lesioni tessutali, morte cellulare e degenerazione dell'assone, non esistono due ferite sono identici; quindi, nessun modello TBI corrente per gli animali riproduce fedelmentetutti gli aspetti della TBI come si è visto negli esseri umani. Tuttavia, i modelli animali forniscono la capacità di produrre danni quasi identici necessari per indagare i vari effetti di TBI con la speranza di comprendere ulteriormente le manifestazioni cliniche della TBI.

L'impatto corticale (CCI) modello controllato utilizza un sistema di impatto per fornire impatto fisico a dura esposta di un animale. Induce TBI che vanno da lievi a gravi simili a quelle sperimentate dagli esseri umani. Questa lesione è stato caratterizzato nella furetto 2 ed è stato successivamente adattato per l'uso nel ratto 3,4, mouse 5-7, pecore e 8. Poiché la prima caratterizzazione, il sito della lesione è stato posto sia sulla linea mediana 2,9 e la corteccia laterale 10. CCI fornisce un metodo semplice e preciso di indagare gli effetti e trattamenti potenziali per TBI.

Oltre al modello CCI, la percussione fluido e peso goccia modelli sono commonly utilizzato per produrre TBI. Tuttavia, questi modelli limitazioni presenti, tra cui un minore controllo sui parametri di pregiudizio, producendo cambiamenti histopathalogical non si vedono in TBIs umano e una maggiore incidenza di morte accidentale nei topi 3,5,10. Il modello di onda d'urto è utilizzato anche per la produzione di TBI. Anche se il modello di onda d'urto non riproduce le modifiche histopathalogical osservati a seguito di un impatto meccanico, questo modello non produce esattamente TBIs vissute in particolare da personale militare 11. Il modello controllato impatto corticale è facile da controllare a causa del controllo preciso su parametri di deformazione come il tempo, la velocità e la profondità di impatto 5. Tale precisione consente di replicare le lesioni quasi identici in un intero gruppo di animali più fattibile. Soprattutto, CCI riproduce TBIs con le caratteristiche viste in TBIs umano 12. Tuttavia, non esiste un modello unico animale che è del tutto riuscito a riprodurre la gamma completa di patologico chanGES si osservano dopo il trauma cranico. Ulteriori ricerche sono necessarie per rivelare pienamente le modifiche acute e croniche che si verificano dopo TBI.

Due tipi di lesioni si verificano in seguito a un trauma cranico: le lesioni primarie e secondarie. La lesione primaria si verifica al momento dell'impatto e non è sensibile ai trattamenti terapeutici; tuttavia, le lesioni secondarie che persistono dopo la lesione iniziale vengono sottoposti a trattamenti 13. Il modello controllato impatto corticale produce la lesione primaria, permettendo così ai ricercatori di indagare gli effetti del trauma cranico e potenziali trattamenti terapeutici per i potenziali effetti di lunga durata di lesioni secondarie. Aree di potenziale di ricerca utilizzando il modello di CCI sono morte neuronale, edema cerebrale, neurogenesi, effetti vascolari, i cambiamenti histopathalogical e deficit di memoria e più 3,13-16.

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Protocol

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Animal Care
Maschile C57 BL / 6 topi erano alloggiato in gruppo e conservati in 12/12 ore di luce / buio ciclo con libero di accedere a cibo e acqua ad libitum. Gli animali utilizzati in questo protocollo sono di 10-12 settimane di età. Tutte le procedure sono state eseguite secondo protocolli approvati dalla cura degli animali e uso commissione di Indiana University.

1. Preparazione chirurgica

  1. Anestetizzare il mouse usando una miscela di ketamina / xilazina (87,7 mg / ml ketamina e 12,3 mg / ml Xylazina) e somministrare (1 ml / kg) tramite iniezione IP.
  2. Radersi la testa del topo tra le orecchie.
  3. Applicare una gelatina a base di petrolio agli occhi del mouse per prevenire l'essiccazione durante la chirurgia.
  4. Pulire la zona rasata con il 10% di iodio. Quindi utilizzare il 70% di etanolo per pulire lo iodio.
  5. Fissare la testa del mouse nel frame stereotassico utilizzando le barre di auricolari e piastra morso. Assicurarsi che il cervello è stabile.

2. Craniectomy

  • Effettuare una incisione longitudinale nel mezzo della testa con le forbici. Utilizzare una pinza emostatica per tenere la pelle fuori al lato sinistro.
  • Utilizzare un applicatore con punta di cotone per rimuovere il sangue e tessuto sull'osso per esporre il cranio. Lasciare cranio esposto ad asciugare per 1 min.
  • Usare pinze per applicare la pressione e far sì che il cranio rimane immobile. Identificare punti di repere anatomici Lambda (aspetto caudale) e Bregma (aspetto frontale). Disegnare un cerchio al centro di Lambda e Bregma con un diametro di 4 mm di distanza dalla linea mediana 0,5 mm.
  • Usare un trapano per tagliare lungo il cerchio marcato. Soffiare delicatamente la polvere di osso di distanza. Non forare completamente attraverso l'osso per evitare di danneggiare la dura madre.
  • Usare pinze per rimuovere l'osso ed esporre la dura madre.
  • 3. Impaction

    Il sistema impatto comprende una scatola di controllo per impostare i parametri di impatto, un attuatore per eseguire l'occlusione, e un telaio stereotassico per fissare l'attouator e la testa del mouse per l'impatto.

    1. Pre-impostare la velocità dell'attuatore di 3 m / sec prima dell'intervento chirurgico.
    2. Pre-set profondità della deformazione diverso da indurre diversi livelli di gravità del pregiudizio. Profondità di deformazione di 0,0-0,2 mm, 0,5-1,0 mm, e 1,2-2,0 mm si tradurrebbe in TBIs lieve, moderata e grave, rispettivamente. Questo protocollo spiegato come ottenere una lesione cerebrale moderatamente grave deformazione con una profondità di 1 mm, utilizzando una velocità di 3 m / sec.
    3. Fissare l'attuatore al titolare nel telaio stereotassico e utilizzare i micromanipolatori spostandolo per fissare il turno, punta piatta dell'attuatore (diametro 3 mm) nel centro dell'area cranio aperto. Quindi regolare la punta con un angolo parallelo alla superficie del sito di impatto.
    4. Stabilire il punto zero spostando verso il basso l'attuatore nel modello di proroga fino a toccare la superficie del sito di impatto. Quindi impostare il canale Z sul pannello di controllo stereotassica a zero.
    5. Ritrarre la punta di simulazionementre simultaneamente spostando l'attuatore giù 1 mm.
    6. Premi il pulsante impatto di colpire il sito di lesione e di raggiungere una profondità di deformazione di 1 mm.

    4. Lesioni sito Chiusura

    1. Utilizzare applicatori di cotone con punta per eliminare l'eventuale impatto di sangue in seguito, ma non toccare la zona ferita.
    2. Posizionare il mouse su un tappetino caldo per mantenere la temperatura corporea.
    3. Una volta emorragia si è fermata, suturare la ferita chiusa. Mettere l'animale nella gabbia pulita e permettono di recuperare da un intervento chirurgico durante la notte sul pad caldo.
    4. Somministrare Buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg SQ ogni 8-12 ore per 2 giorni dopo l'intervento.

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    Representative Results

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    Il modello di impatto corticale controllata produce TBI variano in gravità da lieve a grave. Post-impatto la quantità di gonfiore cranico, emorragia, e la distorsione cranica nel sito di impatto riveleranno la gravità del pregiudizio derivante dai parametri di velocità e profondità di deformazione. TBI Lieve producono gonfiore cranica presso il sito di impatto e leggero sanguinamento dovuto alla violazione durata limitata. Un trauma cranico moderato presenta gonfiore cranica e aumentato sanguinamento dovuto alla dura violazione su impattazione (Figura 1). La differenza tra un TBI moderato e grave può essere difficile distinguere fino visualizzata su tessuti fissati utilizzando un microscopio (figura 2); tuttavia, un grave trauma cranico può occasionalmente visualizzare distorsione amplificata e cranio gonfiore post-impatto. Il modello CCI può essere utilizzato per determinare gli effetti di più aspetti della TBI, incluse deformazione dei tessuti (Figura 2), morte neuronale, e cambiamenti histopathalogical.

    = "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 1
    Figura 1. Controllata modello impatto corticale per lesioni cerebrali traumatiche moderate. La procedura di impatto corticale controllata è illustrato in questa figura. A) La testa di topo è stata stabilmente fissata sul telaio stereotassico con bar orecchio e la bocca bit. B) Il cranio sinistro era esposto e 4 mm cerchio è stato elaborato nel centro di bregma e lambda. C) L'osso è stato rimosso dalla foratura per generare una finestra per impatto. D) L'attuatore è stato fissato sul telaio stereotassico e il punto zero sull'asse Z è stata istituito. E) Il tessuto cerebrale è stata distorta e ha causato il sanguinamento con un impatto. F) L'emorragia si fermò alcuni minuti dopo l'impatto e il sangue è stato rimosso da applicatore cotone./ Ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

    Figura 2
    Figura 2. Istologia per moderati lesioni cerebrali traumatiche. A) A 10-12 settimane di età cervello naive topo è stato rimosso. B) A 10-12 settimane di età cervello di topo è stato usato come un. Controllo sham C) Il cervello di un topo 10-12 settimane di età è stato rimosso 24 ore dopo un moderato TBI utilizzando il modello CCI. D) Il cervello di un topo di 10-12 settimane di età è stato rimosso 6 settimane dopo un trauma cranico moderato utilizzando il modello CCI. Una rientranza nel tessuto cerebrale è evidente nel sito di impatto. E) Nissl colorazione è stata eseguita su un controllo sham 10-12 settimane di età cervello di topo per mostrare il istologia normale. F) Nissl colorazione è stata eseguita su un 10-12 settimane di età cervello di topo che avevaha ricevuto un trauma cranico moderato utilizzando il modello CCI. Una cavità è visibile si estende in profondità nella corteccia. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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    Discussion

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    Le fasi più critiche per la generazione di successo TBIs coerenti con un sistema elettronico di impatto magnete di causare una CCI sono: 1) stabilmente fissa la testa del mouse nel frame stereotassico; 2) generare la stessa dimensione della finestra ossea tra topi e rimuovendo l'osso senza danneggiare la dura sotto in caso craniectomy; 3) posizionare correttamente la punta impatto nel centro della zona aperta e fissazione del punto zero prima di colpire.

    Una testa mouse deve essere fissato nel telaio stereotassico molto ben prima dell'impatto. Fissazione allentato genererà grandi variazioni nel livello del pregiudizio. Per garantire una fissazione stabile, usare il forcipe per esercitare una pressione sul cranio una volta che la testa del mouse è fissata nel telaio stereotassico e confermare che il cranio rimane immobile. Prendere misure precauzionali per evitare l'infezione del cranio esposto. Dopo aver esposto il cranio, passare alla parte più difficile della chirurgia controllata impatto corticale: foratura una circolaretagliare il cranio senza danneggiare la dura madre sotto.

    La dimensione ottimale della punta del trapano è di 0,5 mm. La velocità è adatto 10.000-20.000 rpm; tuttavia, utilizzando una velocità superiore può facilitare la foratura di un finestra ossea migliore. Foratura genera calore che può danneggiare il cervello, in particolare nei giovani topi le cui ossa e dura in allegato. Per evitare danni al cervello, applicare salina alla superficie del cranio durante la perforazione. Applicando salina renderà necessario ricorrere ad un microscopio da dissezione per vedere il cerchio forato. Quando topi maturi, uno spazio sviluppa tra l'osso e dura madre, così l'effetto del calore generato dalla perforazione produrrebbe un impatto minimo.

    Durante la perforazione, spostare la punta lentamente e continuamente lungo un percorso circolare. Altrimenti, il bit può muovere sulla linea o passare direttamente attraverso l'osso e danneggiare il tessuto cerebrale. Toccare delicatamente la finestra ossea con pinze per ispezionare la perforazione. Se il bis ossa del craniosily muove su e giù, spostare la multa punta della pinza nello spazio tra l'osso e la dura. Quindi sollevare per rimuovere l'osso intero, creando così la finestra. Non sollevare l'osso da un lato ad un altro, perché così facendo può danneggiare il tessuto cerebrale. Rendere le finestre osso identico dimensioni è fondamentale per la generazione di lesioni cerebrali coerenti. A causa della pressione endocranica, il cervello rigonfiamento della zona aperta una volta l'osso viene rimosso, causando la deformazione cervello minore. Se la dimensione della finestra ossea varia, il livello di deformazione cervello sarà diverso, essendo simile alla curva superficie cervello nel sito di impatto. L'osso non è stato riposizionato sul sito di impatto dopo chirurgia dato che era più piccolo della finestra ossea. Ciò causerebbe l'osso di aderire direttamente al tessuto cerebrale. Applicare la colla per sigillare la finestra ossea potrebbe comportare un aumento della pressione intracranica. Esaminando un sito di impatto 3 settimane dopo un intervento chirurgico CCI una nuova membrana è constatato che copre il tessuto cerebrale with nessuna crescita tessuto cerebrale di fuori del sito di impatto. Non sono noti cambiamenti istologici si verificano a causa della mancanza di copertura dell'osso.

    Il sistema elettronico di impatto magnete è estremamente stabile e può controllare con precisione la velocità e la profondità della deformazione. Tuttavia, a causa del disegno, la bobina collegata alla punta impatto può spostare mentre colpisce e provocare uno spostamento del sito di impatto. Questa è la principale causa di lesioni incoerenti, salvo altre complicazioni. Nonostante la possibilità di spostare il punto di impatto, il metodo impatto corticale controllata rimane più preciso e più facile da controllare rispetto alla percussione fluido e metodi peso goccia, rendendo così CCI un metodo preferito per indagare le breve termine ea lungo termine dei TBIs , nonché possibili trattamenti terapeutici. Sebbene importante per la ricerca TBI, rimuovere una porzione del cranio prima dell'impatto limita la rilevanza clinica del modello CCI.

    Il protocollo di cui sopra describes il procedimento per produrre un TBI moderato in un topo. Il sito di impatto può variare 1-6 mm di diametro seconda dell'animale e la gravità delle lesioni desideri. Anche se il protocollo indicato punta impatto è stato 3 mm di diametro, un diametro di 4 mm craniectomy stata effettuata per evitare accidentalmente colpire osso. Oltre a modificare la dimensione del sito di impatto, la velocità del dispositivo di simulazione e la profondità di deformazione può essere regolata per raggiungere la severità necessaria.

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    Acknowledgments

    Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Cord Indiana spinale & Brain Injury Research Grants (SCBI 200-12), Ralph W. e Grazia M. Showalter Research Award, Indiana University ricerca biologica Grant, NIH sovvenzioni RR025761 e 1R21NS072631-01A.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Povidone-iodine 7.5% Purdue product L.P. Surgical scrub
    Cotton tipped applicators Henry Schein 100-6015 Remove blood and debris
    Scissor Fine Science Tools 14084-08 Surgery
    Forcept Fine Science Tools 11293-00 Surgery
    Hemostat Fine Science Tools 13021-12 Surgery
    Rechargeable Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Combine with Burrs for generating the bone window
    Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
    Suture monofilament Ethicon G697 Suture
    tert-Amyl alcohol Sigma 152463-250ML Making 2.5% Avertin
    2,2,2-Tribromoethanol Sigma T48402-25G Making 2.5% Avertin

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    References

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    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).More

    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).

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