Bruges åben mark aktivitetsniveauer at vurdere lokomotiv og adfærdsmæssige aktivitetsniveau. Denne protokol giver en veltilrettelagt, standardiseret protokol til brug i prækliniske forsøg for neuromuskulære lidelser.
Overvågningssystemet åben mark aktivitet omfattende vurderer bevægelsesmæssigt adfærdsmæssige aktivitetsniveauer af mus og. Det er et nyttigt redskab til at vurdere lokomotiv værdiforringelse i dyremodeller af neuromuskulære sygdomme og effekten af terapeutiske lægemidler, der kan forbedre bevægelse og / eller muskelfunktion. Målingen åben mark aktivitet giver en anden målestok end muskelstyrke, som er almindeligt vurderes af gribestyrke målinger. Det kan også vise, hvordan lægemidler kan påvirke andre organ systemer samt når det bruges med supplerende resultatmål. Hertil kommer, at foranstaltninger såsom samlede distance spejle 6 min gangtest, et klinisk forsøg resultat foranstaltning. Dog er overvågning åben mark aktivitet også forbundet med betydelige udfordringer: Åben Felt Aktivitet målinger varierer i forhold til dyrets stamme, alder, køn og døgnrytme. Desuden kan rumtemperatur, fugtighed, lys, støj og endda lugt påvirke vurdering resultater. Samlet set denne manuscript giver en velafprøvet og standardiseret åbent felt aktivitet SOP til prækliniske forsøg i dyremodeller af neuromuskulære sygdomme. Vi giver en diskussion af vigtige overvejelser, typiske resultater, dataanalyse og detaljeret beskrivelse af de styrker og svagheder i åben afprøvning i marken. Derudover giver vi anbefalinger til optimal studiedesign, når du bruger åben mark aktivitet i et præklinisk forsøg.
Dyremodeller har været nyttige for at lære om sygdomsmekanismer, men deres anvendelighed til at forudsige behandlingseffekt i kliniske forsøg er ofte blevet udfordret 1-3. Talrige "lovende" prækliniske undersøgelser offentliggøres hvert år; Men meget få af de foreslåede tiltag viser positive resultater, når flyttes til kliniske forsøg. Disse uoverensstemmelser er ofte tilskrives publikationsbias, overoptimistiske konklusioner og dårligt konstrueret og udført prækliniske studier, der fører til reproducerbare resultater 1-3.
Med de nuværende fremskridt inden for udvikling af lægemidler til neuromuskulære sygdomme, der er et stigende behov for veldesignede prækliniske forsøg. Især er der behov for strenge metoder, der kan udføres på en standardiseret og blindet måde, med validerede, reproducerbare og oversætbare resultatmål. Som medlem af medfødt muskelsygdom Consortium, medønsket om at gennemføre mere grundige prækliniske studier, deler vi her vores Standard Operating Procedure (SOP) for Open Felt Aktivitet. Denne SOP er tidligere valideret 4 og offentliggjort som en del af TREAT-NMD er standardforskrifter for Duchennes muskeldystrofi (DMD) dyremodeller 5. Vi har brugt denne metode til at fænotype og afprøve den terapeutiske virkning af en lang række stoffer i en række dyremodeller for neuromuskulære sygdomme, herunder Lama2 dy-2J / J (Dy2J) mus, den dyremodel for medfødt muskeldystrofi (CMD) 6,7 . Til gengæld er denne artikel tilpasset fra vores tidligere offentliggjorte TREAT-NMD SOP 5.
Overvågningssystemet åben mark aktivitet omfattende vurderer bevægelsesmæssigt adfærdsmæssige aktivitetsniveauer af mus, som kan sammenholdes med lokomotiv funktion og. Testen er også almindeligt anvendt til at vurdere angst ud, og sonderende adfærd 8-10. Især det åbne område er et nyttigt redskab for røvEssing lokomotiv værdiforringelse i dyremodeller af neuromuskulære sygdomme 11,12 og effekten af terapeutiske lægemidler, der kan forbedre bevægelse og / eller motorisk funktion 6,7,13,14. Den åbne vurdering felt aktivitet giver en anden målestok end muskelstyrke, som er almindeligt måles med greb, og det viser, hvordan lægemidler kan påvirke andre organ systemer (dvs. det centrale nervesystem) samt 5. Desuden åben mark aktivitet foranstaltning samlede distance, afspejler 6 min gangtest, et klinisk forsøg effektmål, der fokuserer på submaksimal motion ydeevne og livskvalitet 15,16. Samlet dette gør det åbne område aktivitet teste en gavnlig sekundær eller hjælpende resultat foranstaltning til brug i prækliniske forsøg. Men den åbne overvågningssystem felt aktivitet har også store udfordringer forbundet med det. Testen er adfærdsmæssige og kan være ganske variabel, da det er påvirket af en lang række eksternefaktorer. For eksempel kan denne adfærd påvirkes af sonderende drev (dvs. kognition), angst, sygdom, døgnrytme, miljøfaktorer, genetisk baggrund, foruden motorens udgang 10. Som følge heraf er det bydende nødvendigt at gennemføre denne foranstaltning i en standardiseret måde med et kontrolleret miljø. Protokollen præsenteres her beskriver vores åben mark aktivitet SOP i detaljer. Det giver trin-for-trin procedurer og yderligere diskussion af vigtige overvejelser at kontrollere miljømæssige forhold og medvirke til at reducere variabilitet, typiske resultater, dataanalyse, og vurderingen styrker og svagheder i flere detaljer.
Målingen åben mark aktivitet er en in vivo-assay, der kan være til gavn for vurdering af sygdomsprogression og narkotika effekt i dyremodeller for neuromuskulære sygdomme 6,7,11-14. Som vist i figur 2, det giver en vurdering af aktivitetsniveauet, der generelt afspejler lokomotiv funktion. Dette er en anden foranstaltning end muskelstyrke, hvilket gør det til et ideelt sekundær eller hjælpende resultat foranstaltning at udføre i et præklinisk stof undersøgelse. Desuden er det en klinisk relevant 15 invasiv foranstaltning, der kan udføres flere gange i løbet af varigheden af en undersøgelse. Dog er adfærdsmæssige og lokomotiv aktivitet også påvirket af andre faktorer så godt (dvs. eksperimentator håndtering, miljøforhold, og kognition) at skabe variation i åbent felt aktivitetsdata. Målet med dette oplæg er at give en velafprøvet og standardiseret protokol, der reducerer variation og giver resultater at være Compared tværs af flere laboratorier, i håb om at forbedre oversættelse inden for vores felt.
En væsentlig ulempe ved denne foranstaltning er, at det er meget variable og påvirket af en række eksterne faktorer. Men vi tog dette i betragtning, når udviklingen af protokollen. Vi vurderede en række testprotokoller spænder i varighed fra 1-5 dage for dataindsamling. I sidste ende, vi fastslået, at udføre instrument akklimatisering forud for dataindsamling til at sætte dyrene med testkammeret miljø og udfører 4 dage af dataindsamlingen betydeligt reduceret mængden af variationen i resultatet oplysninger 5. Denne protokol blev oprindeligt designet til at vurdere adfærdsmæssige og lokomotiv aktivitetsniveau i MDX musemodel; Dette blev imidlertid protokol nylig valideret i Dy2J dyremodel samt 6. Det foreslås, at protokollen skal standardiseres i dit laboratorium for hvert dyr model, inden du bruger det i et præklinisk forsøg.
Åben mark aktivitet varierer fra genetisk baggrund 17, køn 18-20, 18 år, og døgnrytme 21. Dette kræver dyr af samme alder, køn og genetisk baggrund, der skal vurderes på samme tid. I planlægningsfasen, bør nøje overvejelser sættes til at beslutte på, hvad alder eller aldre åben mark aktivitet niveauer vil blive vurderet. Hver dyremodel har sin egen særskilte sygdomsprogression og lokomotiv og adfærdsmæssig fænotype, som varierer i sværhedsgrad og alder 6,15 (figur 2 og figur 3). Derfor er det vigtigt at fastslå klinisk og patologisk relevante tidspunkter for at vurdere åbne Felt Aktivitet foranstaltninger. Det samlede antal dyr, der er nødvendige i hver behandlingsgruppe til at detektere statistisk signifikante forskelle varierer efter dyremodel, alder og køn samt. Derfor bør relevante beregninger stikprøvestørrelse også udføres i planlægningsfasen at determine det samlede antal dyr, der er nødvendige i hver behandlingsgruppe til at detektere statistisk signifikante forskelle. Disse beregninger bør også tage hensyn til yderligere resultatmål anvendt i undersøgelsen (f.eks gribestyrke målinger eller histologiske analyser). Baseret på vores magt beregninger, vi bruger typisk 10-12 dyr pr behandlingsgruppe. Desuden bør man være særlig opmærksom på, hvad kontrol stamme anvendt i undersøgelsen. Der er en tendens til utilstrækkelig kontrol-stammer, der skal anvendes i prækliniske undersøgelser. For eksempel er BL6-mus ofte anvendes som en stamme i mdx-mus kontrol; imidlertid mdx musen er på en BL10 baggrund. Som det ses i figur 3, BL10 mus er meget mere aktive end BL6-mus, hvilket gør det umuligt at sammenligne mdx og BL6-data. Ved udførelse af prækliniske studier med mdx-mus, bør BL10 mus anvendes som kontrolstammen. Desuden, hvis et forsøg gennemføres med Dy2J mus, BL6-mus bør anvendes som control-stamme.
Små miljømæssige ændringer kan også påvirke aktivitetsniveauet betydeligt. Disse omfatter belysning, temperatur, fugtighed, lugt, støj og aktivitet 4,15 menneske. Derfor er det meget vigtigt, at testning udføres i et temperaturreguleret og fugtighed kontrolleret rum uden direkte belysning på samme tidspunkt hver dag 5. Testkamrene skal være jævnt fordelt i hele rummet og ikke placeret under direkte belysning eller i skygge eller mørke hjørner 5. Dyrene randomiseres til deres testkamre hver dag for at mindske virkningerne af varierende miljøforhold i hele rummet, og de skal have lov til at akklimatisere sig til testning plads til 10-30 minutter før dataindsamling. Sørg for at spore boksen tildeling af hvert dyr i hele undersøgelsens varighed for at sikre, at enhver påvirkning af kasse / miljø er ligeligt fordelt mellem de forskellige behandlingsgrupper. De personer loading Animals ind testkamrene og håndtering af dyrene under hele undersøgelsen skal blindet for behandlingsgruppen, og dyrs belastning, når det er muligt. Påvirkes i mange tilfælde genotyper afviger markant fra tilhørende kontroller og blændende er ikke muligt. Dog bør den enkelte altid blive forblændet mellem behandlede og ubehandlede grupper. Desuden bør alle personer forlade lokalet under dataindsamling for at reducere støj og distraktioner i rummet, og alle kamre skal rengøres grundigt efter hver session dataindsamling. Disse tiltag vil reducere variationen i data. Det er vigtigt at bemærke, at dyr er også meget modtagelige for tilpasning 15. Derfor foreslås det, at dyrene fjernes fra testkammer direkte efter 60 min af dataindsamling hver dag, og at åbne felt aktivitetsniveauer vurderes ikke mere end en gang om måneden.
Den samlede distance og den samlede trækment tidsmålinger tendens til at være de mest følsomme åbne felt aktivitetsmålinger 5. I Dy2J model målingen lodret aktivitet tendens til at være den mest følsomme åbne felt aktivitet foranstaltning (figur 3); kan det imidlertid være vanskeligt at fange nøjagtige vertikale aktivitetsmålinger i mindre dyr. For eksempel er det muligt, at en mindre dyr vil udvise opdræt adfærd og sensoren vil ikke optage det på grund af højden af den lodrette sensor. Som et resultat, anbefaler vi test dyr tidligst 5 ugers alderen. Det er også muligt, at et dyr vil sove under hele en dataindsamling session. Hvis dette er tilfældet, er det hensigtsmæssigt at tilføje en ekstra dag for dataindsamling. Endelig kan dårlig tilpasning af kvadrant divider eller blokering af sensorer i kassen resultere i ukorrekte oplysninger så godt. Derfor er det meget vigtigt at udføre en sensor precheck, før afprøvning, og gennemgå alle data efter afslutningen afhver dataindsamling session.
Forsigtighed bør også tages, når man analyserer åbent felt aktivitetsdata. Åbent felt aktivitetsdata har en tendens til at være ikke-normalfordelte og få afvigere 4. Forud for udførelse af eventuelle statistiske analyser, vores biostatisticians anbefales at kontrollere oplysningerne om normalitet og afvigere. Hvis oplysninger ikke normalt fordelt, bør man overveje at bruge en ikke-parametrisk test, når man sammenligner midler. Desuden skal alle data analyseres af en person blindet hvad behandlingsgrupperne er.
Samlet set åben mark aktivitet foranstaltning har store fordele: a) Det er en samlet vurdering af både lokomotorisk og adfærdsmæssig aktivitet, som er stærkt, men ikke altid korreleret med lokomotiv-funktion; b) at det er en nem foranstaltning til at udføre; c) at det kræver ingen dyr håndtering under afprøvning; d) det er en noninvasiv foranstaltning, der kan udføres mere end én gang i hele varigheden af et study; e) ingen særlig uddannelse er nødvendig for at udføre testen; f) flere dyr kan testes på en gang; og g), er det en klinisk relevant effektmål 5,16. Men når der testes terapeutiske, huske på, at andre faktorer kan påvirke et dyrs adfærd, og til gengæld åbent Felt Aktivitet målinger. Narkotika kan have CNS og eller anden myndighed brede effekter og adfærd kan også være påvirket af en stressende miljø. Som et resultat, kan det være svært at skelne mellem om ændringer i lokomotiv eller adfærdsmæssige aktivitetsniveauer er relateret til ændringer i muskel funktion, muskelstyrke, eller er et resultat af bivirkninger fra medicin. Derfor bør yderligere funktionelle, histologiske og eller molekylære assays udføres som godt. Denne standardiserede protokol er også blevet anvendt med succes i andre muskelsygdomme 4,17; Men som det ses i figur 3, pilotundersøgelser bør udføres i første omgang at vurdere følsomheden af foranstaltningen i dyretmodel.
The authors have nothing to disclose.
Denne publikation er finansieret gennem Cure CMD, Fransk Muscular Distrophy Association (AFM), en translationel forskning tilskud fra Muskelsvindfonden Association, National Institutes of Health (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06), Department of Defense ( W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) og en pilot tilskud fra Parent Project Muscular Distrophy ( PPMD).
Dette papir er en af flere i en serie af standardforskrifter for rutinemæssigt anvendte metoder i medfødt muskelsygdom område. Det afspejler den indsats drøftet og fastlagt af over 20 eksperter inden for området medfødt muskelsygdom på det seneste medfødt muskelsygdom Consortium Workshop, som blev afholdt i april 2013, Washington, DC
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equipment | |||
VersaMax Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA | Retired | |
Fusion Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA | Suggested system currently on the market | |
Computer | Dell, Inc. | ||
Materials | |||
Virkon-S Broad spectrum disinfectant (Potassium Peroxymonosulfate/ Sodium Chloride) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | ||
Mice | |||
B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J) | Jackson Lab | 000524 | |
C57BL/6J (BL6) | Jackson Lab | 000664 | |
SJL/J (SJL) | Jackson Lab | 000686 | |
C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) | Jackson Lab | 001801 | |
C57BL/10ScSnJ (BL10) | Jackson Lab | 000476 |