Öppna fältaktivitetsnivåer används för att bedöma lok och beteendeaktivitetsnivå. Detta protokoll ger en väl utformad, standardiserat protokoll som ska användas i prekliniska studier för neuromuskulära sjukdomar.
Det öppna övervakningssystem fältverksamhet bedömer omfattande rörelse och beteende aktivitet av möss. Det är ett användbart verktyg för att bedöma lok försämring i djurmodeller av neuromuskulär sjukdom och effekten av terapeutiska läkemedel som kan förbättra rörelseförmåga och / eller muskelfunktion. Det öppna fältet aktivitetsmätning ger en annan åtgärd än muskelstyrka, som ofta bedöms av greppstyrkemätningar. Det kan också visa hur läkemedel kan påverka andra delar av kroppen samt vid användning med ytterligare effektmått. Dessutom åtgärder såsom sammanlagda sträcka spegla 6 min gångtest, en klinisk prövning effektmått. Dock är öppet fält aktivitet övervakning också förenad med betydande utmaningar: Öppen fältaktivitetsmätningar varierar beroende på djurstam, ålder, kön, och dygnsrytm. Dessutom kan rumstemperatur, fuktighet, belysning, buller, och även lukt påverka utfall bedömning. Sammantaget denna manuscript ger en väl beprövad och standardiserad öppet fält aktivitet SOP för prekliniska studier i djurmodeller av neuromuskulära sjukdomar. Vi tillhandahåller en diskussion om viktiga överväganden, typiska resultat, dataanalys och detaljer styrkor och svagheter i öppna fälttester. Dessutom ger vi rekommendationer för optimal studiedesign vid användning av öppet fält aktivitet i en preklinisk studie.
Djurmodeller har varit användbara för att lära sig om sjukdomsmekanismer, men deras användbarhet i att förutsäga behandlingseffekt i kliniska studier har ofta ifrågasatts 1-3. Många "lovande" prekliniska studier publiceras varje år; Men mycket få av de föreslagna insatserna visar positiva resultat när de flyttas till klinisk prövning. Dessa skillnader är ofta tillskrivs publikationsbias, alltför optimistiska slutsatser, och dåligt utformade och avrättade prekliniska studier som leder till reproducerbara resultat 1-3.
Med nuvarande framsteg inom läkemedelsutveckling för neuromuskulära sjukdomar, finns det ett ökande behov av väl utformade prekliniska studier. Framför allt finns det ett behov av rigorösa metoder som kan genomföras på ett standardiserat och blint sätt, med validerade, reproducerbara och översättningsbara effektmått. Som medlem i den Congenital Muscle Disease Consortium, medviljan att genomföra strängare prekliniska studier, delar vi här vår Standard Operating Procedure (SOP) för Open Field aktivitet. Denna SOP har tidigare validerat 4 och publiceras som en del av TREAT-NMD: s standardrutiner för Duchennes muskeldystrofi (DMD) djurmodeller 5. Vi har använt denna metod för att fenotyp och testa den terapeutiska effekten av många läkemedel i en mängd olika djurmodeller av neuromuskulära sjukdomar, inklusive Lama2 dy-2J / J (Dy2J) möss, djurmodell för kongenital muskeldystrofi (CMD) 6,7 . I sin tur, är den här artikeln anpassas från våra tidigare publicerade TREAT-NMD SOP 5.
Det öppna övervakningssystem fältverksamhet bedömer omfattande rörelse och beteendeaktivitetsnivåer hos möss, som kan korreleras med lok funktion. Testet är också allmänt används för att bedöma ångest ut och undersökande beteenden 8-10. I synnerhet är det öppna fältet ett användbart verktyg för assEssing lok försämring i djurmodeller av neuromuskulär sjukdom 11,12 och effekten av terapeutiska läkemedel som kan förbättra rörelseförmåga och / eller motorik 6,7,13,14. Det öppna fältet aktivitetsbedömning ger ett annat mått än muskelstyrka, som vanligen mäts med greppstyrka, och det visar hur läkemedel kan påverka andra delar av kroppen (dvs det centrala nervsystemet) och 5. Dessutom det öppna fältet aktivitetsåtgärd sammanlagda sträcka, speglar 6 min gångtest, en klinisk prövning utfallsmått, som fokuserar på submaximal motion prestanda och livskvalitet 15,16. Sammantaget gör detta fältet verksamhet som är öppen testa en fördelaktig sekundär eller extra effektmått att använda i prekliniska studier. Däremot har öppet övervakningssystem fältverksamhet också betydande utmaningar som är förknippade med den. Testet är beteende och kan vara ganska varierande eftersom det påverkas av en mängd yttrefaktorer. Till exempel kan detta beteende påverkas av undersökande enhet (dvs kognition), ångest, sjukdom, dygnsrytm, miljöfaktorer, genetisk bakgrund, förutom motoreffekt 10. Som ett resultat är det nödvändigt att genomföra denna åtgärd på ett standardiserat sätt med en kontrollerad miljö. Protokollet presenteras här beskriver vårt öppna fältverksamhet SOP i detalj. Det ger steg-för-steg-anvisningar och ytterligare diskussion om viktiga faktorer för att styra miljöförhållanden och bidra till att minska variationen, typiska resultat, dataanalys och utvärdering styrkor och svagheter mer i detalj.
Det öppna fältet aktivitetsmätning är en in vivo-analys som kan vara till nytta för att bedöma sjukdomsutveckling och läkemedlets effektivitet i djurmodeller av neuromuskulär sjukdom 6,7,11-14. Som visas i figur 2, ger det en bedömning av aktivitetsnivåer som i allmänhet speglar lok funktion. Detta är en annan åtgärd än muskelstyrka, vilket gör den till en idealisk sekundärt eller hjälp effektmått att utföra i en preklinisk läkemedelsstudie. Dessutom är det en kliniskt relevant 15, icke-invasiv åtgärd som kan genomföras flera gånger under hela en studie. Dock är beteende och lok aktivitet påverkas också av andra faktorer också (dvs försökshantering, miljöförhållanden, och kognition) skapar variation i öppet fältaktivitetsdata. Målet med denna uppsats är att ge en väl testad och standardiserat protokoll som minskar variation och låter resultaten att vara compared över flera labb, i hopp om att förbättra översättningen inom vårt område.
En stor nackdel med detta mått är att det är mycket varierande och påverkas av många yttre faktorer. Men vi tog hänsyn till detta vid utvecklingen av protokollet. Vi utvärderade ett antal olika testprotokoll varierar i längd från 1 till 5 dagar av datainsamling. Till slut bestämde vi att utföra instrument acklimatisering före datainsamling att bekanta djuren med testkammaren miljön och utför fyra dagar av datainsamling avsevärt minskat mängden variation i utfallsdata 5. Detta protokoll var ursprungligen avsedd att bedöma beteendemässiga och lokomotiv aktivitet i mdx musmodell; Men var detta protokoll nyligen validerats i djurmodell Dy2J samt 6. Det föreslås att protokollet standardiseras inom din arbetskraft för varje djurmodell innan du använder den i en preklinisk studie.
Öppet fält aktivitet varierar med genetisk bakgrund 17, kön 18-20, 18 år, och dygnsrytm 21. Detta kräver djur i samma ålder, kön och genetisk bakgrund som skall bedömas på samma gång. Under planeringsstadiet, bör noggrann eftertanke sättas i avgöra vid vilken ålder eller åldrar öppet fält verksamhetsnivåer kommer att bedömas. Varje djurmodell har sin egen distinkta sjukdomsutveckling och lok och beteende fenotyp, som varierar i svårighetsgrad och efter ålder 6,15 (figur 2 och 3). Därför är det viktigt att bestämma kliniskt och patologiskt relevanta tidpunkter för att bedöma öppna fältaktivitetsåtgärder. Det totala antalet djur som behövs i varje behandlingsgrupp för att detektera statistiskt signifikanta skillnader varierar med djurmodell, ålder och kön samt. Följaktligen bör relevanta urvalsstorlek beräkningar också utföras under planeringsstadiet för att determine det totala antalet djur som behövs i varje behandlingsgrupp för att detektera statistiskt signifikanta skillnader. Dessa beräkningar ska också ta hänsyn till ytterligare resultatmått som använts i studien (t.ex. mätningar eller histologiska analyser greppstyrka). Baserat på våra kraftberäkningar använder vi vanligtvis 10-12 djur per behandlingsgrupp. Dessutom bör särskild uppmärksamhet ägnas åt vad kontrollstammen används i studien. Det finns en tendens till att felaktiga kontrollstammar som används i prekliniska studier. Till exempel är BL6 möss används ofta som ett kontrollstam för MDX möss; emellertid är den mdxmus på en BL10 bakgrund. Såsom framgår av fig 3, BL10 möss är mycket mer aktiva än BL6 möss, som gör det omöjligt att jämföra MDX och BL6-data. Vid genomförande av prekliniska studier med mdx möss bör BL10 möss användas som kontrollstammen. Dessutom, om en studie genomförs med Dy2J möss, BL6 möss bör användas som kontrol-stammen.
Små förändringar i miljön kan också avsevärt påverka aktivitetsnivåer. Dessa inkluderar belysning, temperatur, luftfuktighet, lukt, buller och mänsklig aktivitet 4,15. Därför är det mycket viktigt att testerna genomföras i en temperatur-och fuktighetskontrollerade rum med icke-direkt belysning vid samma tidpunkt varje dag 5. Testkamrarna bör vara jämnt fördelade i hela rummet och inte placeras i direkt belysning eller i skuggade eller mörka hörn 5. Djur bör slumpmässigt till deras testkammare varje dag för att minska effekterna av varierande miljöförhållanden i hela rummet, och de bör tillåtas att anpassa sig till i provningsrummet under 10-30 min före datainsamling. Se till att spåra lådan tilldelningen av varje djur under hela studien för att se till att varje påverkan av box / miljö är jämnt fördelad mellan de olika behandlingsgrupperna. Individerna inläsning av animals i testkamrarna och hanterar djuren under hela den tid som undersökningen skall förblindas till behandlingsgruppen och djurstammen när det är möjligt. I många fall påverkas genotyper markant skiljer sig från tillhörande kontroller och bländande är inte möjligt. Däremot bör enskilda alltid förblindas mellan behandlade och obehandlade grupper. Dessutom bör alla personer lämna rummet under datainsamlingen för att minska buller och distraktioner i rummet, och alla kammare bör rengöras noggrant efter varje session datainsamling. Dessa åtgärder kommer att minska variationen i data. Det är viktigt att observera att djur är också mycket mottagliga för anpassning 15. Därför föreslås det att djuren avlägsnas från testkammaren direkt efter 60 min av datainsamling varje dag och att öppna fältaktivitetsnivåer utvärderas inte mer än en gång i månaden.
Den sammanlagda sträcka och total dragningstidsmätningar brukar vara de mest känsliga öppna fältaktivitetsmätningar 5. I Dy2J modellen tenderar vertikala aktivitetsmätning för att vara den mest känsliga öppet fält aktivitetsåtgärd (Figur 3); Men, kan det vara svårt att fånga exakta vertikala aktivitetsmätningar i mindre djur. Till exempel är det möjligt att en mindre djur kommer att uppvisa uppfödningsbeteende och sensorn kommer inte att fånga upp det på grund av höjden av den vertikala sensorn. Som ett resultat, rekommenderar vi testdjur tidigast fem veckor. Det är också möjligt att ett djur kommer att sova under hela datainsamlingssession. Om så är fallet, är det lämpligt att lägga till en extra dag för datainsamling. Slutligen kan dålig inriktning av kvadranten delaren eller blockering av sensorer i rutan resultera i felaktiga uppgifter också. Därför är det mycket viktigt att göra en sensor PreCheck, före testning, och granska all data efter det attvarje datainsamling session.
Försiktighet bör också tas vid analys öppna fältaktivitetsdata. Öppet fält aktivitets uppgifter har en tendens att vara icke-normalfördelade och har extremvärden 4. Innan du utför några statistiska analyser, våra biostatistiker rekommenderar kontroll av uppgifter om normalitet och extremvärden. Om data inte är normalfördelade, bör man överväga att använda en icke-parametrisk prov när jämförelseorgan. Dessutom bör alla data som analyseras av en person blind för vad behandlingsgrupperna är.
Totalt sett har det öppna fältet aktivitetsåtgärd stora fördelar: a) det är en omfattande bedömning av både rörelse och beteendeaktivitet, vilket är starkt, men inte alltid korrelerar med lok funktion; b) det är en enkel åtgärd för att utföra; c) det krävs ingen djurhantering under provning; d) det är en icke-invasiv åtgärd som kan utföras mer än en gång under hela en study; e) Ingen särskild utbildning behövs för att utföra testet; f) flera djur kan testas på en gång; och g) det är en kliniskt relevant resultatmått 5,16. Men när man testar läkemedel, tänk på att andra faktorer kan påverka ett djurs beteende och i sin tur öppna fältaktivitetsmätningar. Droger kan ha CNS och eller andra kropps breda effekter och beteende kan också påverkas av en stressig miljö. Som ett resultat kan det vara svårt att särskilja om förändringar av lok eller beteendeaktivitetsnivåer är relaterade till förändringar i muskelfunktion, muskelstyrka, eller är en följd av biverkningar av läkemedlet. Därför bör ytterligare funktionella, histologiska och eller molekylära analyser genomföras också. Denna standardiserade protokoll har också med framgång användas i andra muskelsjukdomar 4,17; emellertid, som framgår av Figur 3, pilotstudier bör genomföras från början för att bedöma känsligheten för åtgärden i djuretmodell.
The authors have nothing to disclose.
Denna publikation finansieras genom Cure CMD, Franska Muskulös Distrophy Association (AFM), en translationell forskningsanslag från muskeldystrofi Association, National Institutes of Health (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06), försvarsdepartementet ( W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) och en pilotbidrag från Parent Project Muscular Distrophy ( PPMD).
Detta dokument är en av flera i en serie standardrutiner för rutinmässigt använda metoder inom den kongenitala fält muskelsjukdom. Det återspeglar de insatser diskuteras och fastställas med över 20 experter på området för medfödd muskelsjukdom vid det senaste Medfödd Muscle Disease Consortium Workshop, som hölls i April 2013 i Washington, DC
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equipment | |||
VersaMax Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA | Retired | |
Fusion Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA | Suggested system currently on the market | |
Computer | Dell, Inc. | ||
Materials | |||
Virkon-S Broad spectrum disinfectant (Potassium Peroxymonosulfate/ Sodium Chloride) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | ||
Mice | |||
B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J) | Jackson Lab | 000524 | |
C57BL/6J (BL6) | Jackson Lab | 000664 | |
SJL/J (SJL) | Jackson Lab | 000686 | |
C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) | Jackson Lab | 001801 | |
C57BL/10ScSnJ (BL10) | Jackson Lab | 000476 |