Denne artikel beskriver berigelsen af proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembran ved ultracentrifugering på en diskontinuerlig saccharosegradient. Den efterfølgende udarbejdelse af postsynaptiske tæthed proteiner er også beskrevet. Protein præparater er egnede til western blotting eller 2D DIGE analyse.
Neuronale subcellulære fraktioneringsteknikker tillader kvantificering af proteiner, der er handlet til og fra synapsen. Som oprindeligt beskrevet i slutningen af 1960'erne, kan proteiner, der er forbundet med den synaptiske plasmamembran isoleres ved ultracentrifugering på en sucrosemassefyldegradient. Når synaptiske membraner er isoleret, kan det makromolekylære kompleks kendt som den postsynaptiske tæthed efterfølgende isoleres på grund af sin vaskemiddel uopløselighed. De anvendte teknikker til at isolere synaptiske plasmamembraner og postsynaptiske tæthed proteiner forbliver stort set den samme efter 40 år, og er meget udbredt i de nuværende neurovidenskabelig forskning. Denne artikel beskriver fraktionering af proteiner, der er forbundet med det synaptiske plasmamembranen og postsynaptiske densitet ved hjælp af en diskontinuerlig saccharosegradient. Resulterende proteinpræparater er egnede til western blotting eller 2D DIGE analyse.
Neuroner kommunikerer gennem synapser, og kvaliteten af denne meddelelse reguleres i vid udstrækning af ændringer i sammensætningen af proteiner ved synapsen. Især de proteiner, der ligger i den postsynaptiske tæthed deltage i neuronal kommunikation ved intim stilladser neurotransmitterreceptorer med deres signaltransduktionssystemer 1. Desuden er varige ændringer i styrken af synaptisk effektivitet kontrolleres ved tilsætning eller fjernelse af receptorer på den postsynaptiske tæthed 1-6. Derfor isolation og kvantificering af synaptiske proteiner er en nødvendig og nyttig teknik til at få indsigt i de måder, som neuroner reagerer på stimuli og ændre synaptisk effektivitet 7. Denne artikel beskriver en fælles teknik til at isolere synaptiske proteiner fra hjernevæv hos gnavere ved ultracentrifugering på diskontinuerte saccharosegradienter. Fraktionen Synaptic plasmamembran kan beriges og isoleres baseret pådens massefylde i saccharose, som er blevet empirisk bestemt til at være lig 1,2 M saccharose.
Afhængigt af den biologiske spørgsmål kan subcellulære fraktioner separeres ved kontinuerlige eller diskontinuerlige gradienter af enten saccharose eller Percoll. Kontinuerlige gradienter mulighed for adskillelse af proteiner i flere fraktioner; Dette kan især være nyttigt at påvise co-lokalisering af proteiner i en given fraktion 8. Men forberedelsen af kontinuerte gradienter er mere besværlig og er unødvendig for mange anvendelser. Diskontinuerlige gradienter er forholdsvis lettere at fremstille og kan anvendes til at separere proteiner ind i et par, generelt definerede fraktioner. Diskontinuerlige gradienter, der er sammensat af tre saccharose lag af stigende molaritet er ofte blevet brugt til at isolere proteiner associeret med synaptiske plasmamembranen (SPM). Denne fraktion synaptisk plasmamembran kan forarbejdes yderligere til den postsynaptiske tæthed fraction (PSD) med vaskemiddel behandling og isolation af fraktionen vaskemiddel-uopløselig.
Når denne fremgangsmåde blev først beskrevet i 1960 9,10 blev elektronmikroskopi anvendes til at vise organeller og membraner, der omtrent definerer synaptiske plasmamembranen og postsynaptiske tæthed fraktionerne 9-14. Disse undersøgelser viste, at medtage før og postsynaptiske membraner og synaptiske vesikler i fraktionen SPM; efter detergentbehandling primært elektron-tætte, postsynaptiske densiteter var synlige. I forbindelse med proceduren, er en hypotonisk chok bruges til at knibe off synaptiske processer fra cellen kroppen 10. Dette trin drager fordel af det faktum, at mitokondrier er mere modstandsdygtige over for osmotisk chok og forblive intakt, og så de sedimentere på bunden af saccharosegradienten (figur 1).
Brug af denne samme berigelse teknik, SPM og PSD fraktioner var først biokemiskdefineret ved polyacrylamidgelelektroforese og sekventering af de vigtigste proteinkomponenter 15-17. Efterfølgende western blot-analyse er blevet anvendt til at detektere og kvantificere niveauet af synaptiske proteiner, og yderligere at definere disse fraktioner (figur 2). Vi har anvendt denne teknik i vores laboratorier at kvantificere ændringer i de synaptiske niveauer af dopamin-transporteren, der opstår, når Slc6a3 locus duplikeret i mus 18. Vi har også brugt denne teknik i NMDA-receptor deficiente mus at afdække synapse-specifikke reduktioner i proteiner, der er en del af DISC1 interactome 19.
Det fremgår af western blot analyse, SPM fraktioner indeholder synaptiske vesikel membranproteiner, endosom markører, mitokondrielle proteiner, membranassocierede syntetiske enzymer og signaltransduktionsmolekyler samt integrerede komponenter i den postsynaptiske tæthed og synaptiske plasmamembraner 20-23. EVen PSD fraktioner kan have kontaminering med rigelige mitokondrielle proteiner, og det kan være nødvendigt at udføre en anden gradient sedimentering eller yderligere oprensningstrin for at fjerne dem 13. For nylig har kvantitativ massespektrometri en liste over mere end 100 proteiner i den postsynaptiske tæthed alene, samt en angivelse af den relative forekomst af disse komponenter 24,25.
Der er flere trin i proceduren, der er afgørende for et vellykket resultat. I trin 3, er det vigtigt, at en ensartet grad af homogenisering er opnået for hver prøve. Ved homogenisering af væv med motordrevet homogenisator er en konstant hastighed ikke kun anvendes til rotation af støderen, men også med antallet af slag. Inkubationstiden under osmotisk chok bør være præcis, da forlænget homogenisering eller inkubering i hypotonisk opløsning vil lysere mitokondrier og forurene SPM prøven.
<p class="jove_co…The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
EDTA | BioBasic | EB0185 | |
PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
1cc syringe | BD | 309659 | |
Name of Equipment | Company | Catalog number | |
Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |