Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Fremstilling af Synaptic plasmamembranen og postsynaptiske Density Proteiner hjælp af en Diskontinuerlig sucrosegradient

doi: 10.3791/51896 Published: September 3, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikel beskriver berigelsen af ​​proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembran ved ultracentrifugering på en diskontinuerlig saccharosegradient. Den efterfølgende udarbejdelse af postsynaptiske tæthed proteiner er også beskrevet. Protein præparater er egnede til western blotting eller 2D DIGE analyse.

Abstract

Neuronale subcellulære fraktioneringsteknikker tillader kvantificering af proteiner, der er handlet til og fra synapsen. Som oprindeligt beskrevet i slutningen af ​​1960'erne, kan proteiner, der er forbundet med den synaptiske plasmamembran isoleres ved ultracentrifugering på en sucrosemassefyldegradient. Når synaptiske membraner er isoleret, kan det makromolekylære kompleks kendt som den postsynaptiske tæthed efterfølgende isoleres på grund af sin vaskemiddel uopløselighed. De anvendte teknikker til at isolere synaptiske plasmamembraner og postsynaptiske tæthed proteiner forbliver stort set den samme efter 40 år, og er meget udbredt i de nuværende neurovidenskabelig forskning. Denne artikel beskriver fraktionering af proteiner, der er forbundet med det synaptiske plasmamembranen og postsynaptiske densitet ved hjælp af en diskontinuerlig saccharosegradient. Resulterende proteinpræparater er egnede til western blotting eller 2D DIGE analyse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Neuroner kommunikerer gennem synapser, og kvaliteten af ​​denne meddelelse reguleres i vid udstrækning af ændringer i sammensætningen af ​​proteiner ved synapsen. Især de proteiner, der ligger i den postsynaptiske tæthed deltage i neuronal kommunikation ved intim stilladser neurotransmitterreceptorer med deres signaltransduktionssystemer 1. Desuden er varige ændringer i styrken af synaptisk effektivitet kontrolleres ved tilsætning eller fjernelse af receptorer på den postsynaptiske tæthed 1-6. Derfor isolation og kvantificering af synaptiske proteiner er en nødvendig og nyttig teknik til at få indsigt i de måder, som neuroner reagerer på stimuli og ændre synaptisk effektivitet 7. Denne artikel beskriver en fælles teknik til at isolere synaptiske proteiner fra hjernevæv hos gnavere ved ultracentrifugering på diskontinuerte saccharosegradienter. Fraktionen Synaptic plasmamembran kan beriges og isoleres baseret pådens massefylde i saccharose, som er blevet empirisk bestemt til at være lig 1,2 M saccharose.

Afhængigt af den biologiske spørgsmål kan subcellulære fraktioner separeres ved kontinuerlige eller diskontinuerlige gradienter af enten saccharose eller Percoll. Kontinuerlige gradienter mulighed for adskillelse af proteiner i flere fraktioner; Dette kan især være nyttigt at påvise co-lokalisering af proteiner i en given fraktion 8. Men forberedelsen af ​​kontinuerte gradienter er mere besværlig og er unødvendig for mange anvendelser. Diskontinuerlige gradienter er forholdsvis lettere at fremstille og kan anvendes til at separere proteiner ind i et par, generelt definerede fraktioner. Diskontinuerlige gradienter, der er sammensat af tre saccharose lag af stigende molaritet er ofte blevet brugt til at isolere proteiner associeret med synaptiske plasmamembranen (SPM). Denne fraktion synaptisk plasmamembran kan forarbejdes yderligere til den postsynaptiske tæthed fraction (PSD) med vaskemiddel behandling og isolation af fraktionen vaskemiddel-uopløselig.

Når denne fremgangsmåde blev først beskrevet i 1960 9,10 blev elektronmikroskopi anvendes til at vise organeller og membraner, der omtrent definerer synaptiske plasmamembranen og postsynaptiske tæthed fraktionerne 9-14. Disse undersøgelser viste, at medtage før og postsynaptiske membraner og synaptiske vesikler i fraktionen SPM; efter detergentbehandling primært elektron-tætte, postsynaptiske densiteter var synlige. I forbindelse med proceduren, er en hypotonisk chok bruges til at knibe off synaptiske processer fra cellen kroppen 10. Dette trin drager fordel af det faktum, at mitokondrier er mere modstandsdygtige over for osmotisk chok og forblive intakt, og så de sedimentere på bunden af saccharosegradienten (figur 1).

Brug af denne samme berigelse teknik, SPM og PSD fraktioner var først biokemiskdefineret ved polyacrylamidgelelektroforese og sekventering af de vigtigste proteinkomponenter 15-17. Efterfølgende western blot-analyse er blevet anvendt til at detektere og kvantificere niveauet af synaptiske proteiner, og yderligere at definere disse fraktioner (figur 2). Vi har anvendt denne teknik i vores laboratorier at kvantificere ændringer i de synaptiske niveauer af dopamin-transporteren, der opstår, når Slc6a3 locus duplikeret i mus 18. Vi har også brugt denne teknik i NMDA-receptor deficiente mus at afdække synapse-specifikke reduktioner i proteiner, der er en del af DISC1 interactome 19.

Det fremgår af western blot analyse, SPM fraktioner indeholder synaptiske vesikel membranproteiner, endosom markører, mitokondrielle proteiner, membranassocierede syntetiske enzymer og signaltransduktionsmolekyler samt integrerede komponenter i den postsynaptiske tæthed og synaptiske plasmamembraner 20-23. EVen PSD fraktioner kan have kontaminering med rigelige mitokondrielle proteiner, og det kan være nødvendigt at udføre en anden gradient sedimentering eller yderligere oprensningstrin for at fjerne dem 13. For nylig har kvantitativ massespektrometri en liste over mere end 100 proteiner i den postsynaptiske tæthed alene, samt en angivelse af den relative forekomst af disse komponenter 24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Følgende protokol er i overensstemmelse med retningslinjerne fra den canadiske Råd i Animal Care og er blevet godkendt af Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet og Farmaci Animal Care udvalget ved University of Toronto.

1. Forbered den nødvendige reagenser som beskrevet i tabel 1

  1. Tilføj protease og phosphatase (om nødvendigt) inhibitorer til alle saccharose opløsninger, buffere og Hedeselskabet 2 O ved koncentrationer, der er skitseret i tabel 1. VIGTIGT: Udfør alle trinnene ved 4 ° C og præ-cool samtlige reagenser og udstyr forud for forsøgets start. Mærk alle rør, herunder ultracentrifugerør, med permanent markør.

2. dissektion af passende område af hjernen

  1. Sacrifice dyret ved cervikal dislokation eller halshugning. Hus og aflive dyr i overensstemmelse med de institutionelle og statslige politikker om dyrs pleje.
  2. Fjern hurtigt the hjerne fra kraniet og sted på en afkølet dissektion blok.
  3. Dissekere passende område af hjernen fra frisk væv og gå videre til Trin 3.

3. Tissue Homogenisering med motordrevet Glas-teflonhomogenisator

  1. Placer 50-100 mg (SPM), eller 100-200 mg (til PSD) af det dissekerede væv i et mærket 13 ml polypropylenrør indeholdende 4 ml 0,32 M HEPES-pufret saccharose opløsning. Overfør prøven til et 15 ml konisk glas-Teflon vævsformaler / homogenisator indstille motordrevet til 900 rpm (indstilling 7) og homogeniseres prøven med 12 slag over en 30 sek periode. Brug en anden glas-teflonhomogenisator mellem prøverne, eller skyl homogenisatoren med koldt destilleret vand mellem prøverne og tør efter med en Kimwipe. Kan homogeniseres Op til 4 g væv i 4 ml 0,32 M HEPES-buffered sucroseopløsning, men det er tilrådeligt at bruge mindre væv for at sikre korrekt fraktionering: BEMÆRK.
  2. Overfør den homogeniserede proeve tilbage to samme 13 ml polypropylenrør. Reserve 100 ul homogenat og opbevares ved -80 ° C til efterfølgende protein kvantificering og western blot-analyse af den samlede proteinfraktion.

4. lavhastighedscentrifugering at fjerne den nukleare fraktion (Udbytter Supernatant S1)

  1. Centrifugeres homogenatet i en fast vinkel rotor ved 900 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Overfør supernatanten (S1) til en ny, mærket 13 ml rør og resuspender kernefraktionen pellet (P1) i 500 pi af 0,32 M HEPES-pufret saccharose. BEMÆRK: (P1) fraktion kan opbevares ved -80 ° C og anvendt til Western blot-analyse af den nukleare fraktion.

5. berigelse af Rå synaptosomale fraktion (Udbytter Pellet P2)

  1. Centrifugeres supernatanten (S1) ved 10.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten (S2) og reserve 500 pi i et mikrocentrifugerør at opbevare ved -80 ° C til efterfølgende protein Quantverifikationsprogrammet og western blot analyse af / fraktionen cytosoliske lys membran. Resuspender resterende rå synaptosomale fraktion pellet (P2) i 1 ml 0,32 M HEPES-pufret saccharose-opløsning og derefter tilsættes yderligere 3 ml 0,32 M HEPES-pufret saccharose opløsning.
  2. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten (S2) og reserve 500 pi i et mikrocentrifugerør at opbevare ved -80 ° C til efterfølgende protein kvantificering og western blot-analyse af fraktionen cytosoliske / lys membran. Gem den vaskede rå synaptosomale pellet (P2) i røret polypropylen.

6. Lysing (hypoosmotisk Shock) af den rå synaptosomale Fraktion

  1. Lyse den rå synaptosomale pellet (P2) i polypropylenrør ved resuspendering det i 1 ml Hedeselskabet 2 O. Tilføj en 3 ml Hedeselskabet 2 O, overførsel til en glas-Teflon vævshomogenisator, og homogeniseres i hånden med 3 slag. BEMÆRK: Det er vigtigtat udføre dette trin så hurtigt som muligt og hurtigt videre til trin 6.2.
  2. Overfør prøver fra homogenisatoren til den samme 13 ml polypropylenrør og hurtigt at tilpasse prøven tilbage til 4 mM HEPES med 16 ul 1 M HEPES opløsning, bland for at blande.
  3. Roter prøver ved 4 ° C i 30 minutter for at sikre fuldstændig lysering.

7. Tilsætning til synaptosomale membranfraktion (P3)

  1. Der centrifugeres ved 25.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Fjern det rå vesikulær supernatantfraktionen (S3) og reservere det i et 5 ml rør til at opbevare ved -80 ° C til efterfølgende protein kvantificering og western blot-analyse. Resuspender synaptosomale membranfraktion (P3) den i 1 ml 0,32 M HEPES-pufret saccharose opløsning.

8. Fremstilling af Diskontinuerlig saccharosegradient

  1. Pipetter nøjagtigt 3,5 ml 1,2 M HEPES-pufret saccharose-opløsning og nøjagtigt 3,0 ml hver af 1,0 M og 0,8 M HepeS-pufret saccharose opløsning i separate 6 ml snap cap rør. BEMÆRK: Dette er gjort for at pre-måle mængden af ​​pufferne, der bruges til at gøre saccharosegradienten. Præcis måling af de mængder, er vigtigt at sikre, at de resulterende stigninger vil være afbalanceret for ultracentrifugering.
  2. Ved hjælp af en Pasteur-pipette og pære glas, overføre 1,2 M HEPES pufret sucroseopløsning de 12 ml polyallomer ultracentrifugerør. Forsigtigt lag 1,0 M HEPES-pufret saccharose opløsning på toppen af ​​1,2 M HEPES-pufret saccharose opløsning. Endelig lag 0,8 M HEPES-pufret saccharose opløsning på toppen af ​​1,0 M HEPES-pufret saccharose opløsning. Brug en frisk Pasteur pipette for hver saccharoseopløsningen og passe på ikke at forstyrre saccharosegradienten. Vibrationer fra en bænk vortex eller mikrocentrifuge vil forstyrre integriteten af ​​gradienten.
  3. Ved hjælp af en Pasteur-pipette, lag membranfraktion resuspenderet synaptosomale (P3) oven på den forberedte diskontinuerlig saccharosegradient.Sørg for, at gradienter afbalanceret afvejning dem inde i spand af svingende spand rotor. Hvis spande ikke er afbalanceret, bruge en P200 pipette til tilsættes forsigtigt 0,32 M HEPES-pufret saccharose til toppen af ​​gradienten og afbalancere rotoren spande.

9. Fraktionering af Synaptic plasmamembranen (SPM)

  1. Ultracentrifugér i en svingende spand rotor ved 150.000 xg i 2 timer ved 4 ° C. Fjern forsigtigt saccharosegradienter fra ultracentrifuge spande. Ved anvendelse af en 18 G kanyle og 1 ml sprøjte, punktere røret ved bunden af ​​1,0 M / 1,2 M HEPES-pufret saccharose opløsning interfase og trække den synaptiske plasmamembran lag (SPM).
  2. Notér af den mængde, som hver SPM prøve indtager i 1 ml sprøjte. Placer indsamlede SPM lag i 3,5 ml tyk væg ultracentrifugerør, tilføje præcis 2,5 volumener 4 mM HEPES at justere saccharosekoncentrationen fra 1,2 M til 0,32 M. Når hver prøve har været justereed til 0,32 M saccharose, balance rørene med 0,32 M HEPES-buffered sucroseopløsning.
  3. Ultracentrifugér i en fast vinkel rotor ved 200.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Fjern og kassér supernatanten. Resuspender synaptiske plasmamembran pellet (SPM) i 300 pi 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-opløsning. Store prøver ved -80 ° C indtil anvendt til Western blotting.

10. Forberedelse af den postsynaptiske Density Fraktion (PSD)

  1. Tø SPM prøver på is.
  2. Lav en opløsning af 0,54% Triton X-100 i 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-opløsning.
  3. I et 5 ml polystyrenrør kombinere 2,7 ml Triton X-100 / HEPES / EDTA-opløsning og 300 pi SPM fraktion og rotere prøven i 15 minutter ved 4 ° C
  4. Overfør prøver til 3,5 ml tyk væg ultracentrifugerør og centrifugeres prøverne ved 32.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
  5. Forbeholder supernatanten (Triton X-100 opløselige fraktion [TS]) og opbevares ved -80; ° C. BEMÆRK: På dette tidspunkt, pillen repræsenterer "PSD-1T" fraktion. En anden behandling med vaskemiddel vil producere en "PSD-2T" fraktion. Hvis der ønskes en PSD-1T fraktion, fortsæt til trin 10.6.
    1. Til fremstilling af en PSD-2T fraktion pellet resuspenderes i 3 ml 0,5% Triton X-100 i 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-opløsning. Drej prøver i 15 min ved 4 ° C. Centrifugér prøver på 32.000 xg i 20 min ved 4 ° C, og fortsæt til trin 10.6.
  6. Supernatanten fjernes, og resuspender postsynaptiske (PSD) pellet i 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-opløsning. BEMÆRK: resuspension mængde kan afhænge af størrelsen af ​​pelleten; anbefales et volumen på 50-75 ul. Fordi PSD fraktion er et vaskemiddel-uopløselig fraktion, er det ofte nødvendigt at tilføje 1-2 pi 0,5% SDS at muliggøre fuldstændig resuspension af protein. Store prøver ved -80 ° C indtil anvendt til Western blotting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Udarbejdelsen af ​​sucrosemassefyldegradient bør resultere i en klar adskillelse af de tre molære opløsninger af saccharose (0,8, 1,0, og 1,2 M saccharose). Se figur 3A et eksempel på gradienten før tilsættes protein prøven. Hvis gradienten er forberedt for meget i forvejen, eller hvis det er forberedt på en bænk overflade med vibrationer fra andet udstyr, vil gradienten blive kompromitteret og korrekt adskillelse ikke vil blive nået. Hvis en klar adskillelse af de tre løsninger ikke er synligt, er det tilrådeligt at lave en ny gradient før du tilføjer protein prøven. Se figur 3B et eksempel på saccharosegradient når der tilsættes protein prøven (sort pil).

Efter centrifugering skal der være klare bånd af protein fraktioner på hver interfase (0,32 / 0,8, 0,8 / 1,0, 1,0 / 1,2). Ud over en pellet skal være synlig på bunden af ​​glasset. Se figur 3C et eksempelaf de enkelte bands efter ultracentrifugering. Hvis fraktioner er kun diffust til stede ved interfasen, er det sandsynligt, at gradienten var kompromitteret og yderligere behandling kan ikke anbefales.

Western-blotting af total, SPM og PSD1T protein prøver fra mus striatum demonstreret i figur 2. Tilsætning af synaptiske proteiner som GluR1, PSD95 og CaMKII, kan visualiseres ved at indlæse en konstant mængde af protein (10 ug) fra alt SPM og PSD fraktioner. Perisynaptic proteiner som dopamin-transporteren (DAT) er beriget i fraktionen SPM, men elimineres i de efterfølgende vaskemiddel trin af PSD berigelse processen.

For at sikre en tilsvarende belastning, kan protein niveauer kan visualiseres på western blot membran ved farvning med Ponceau Red 26. Antistof-baserede "loading kontrol" er ofte rapporteret i litteraturen, men det kan være misvisende, da synaptiske proteiner kan være forskelerentially reguleret i eksperimentelle behandlingsgrupper. Hvis et antistof-baserede "loading kontrol" er ønsket, er det tilrådeligt at først afgøre tilsvarende protein lastning af Ponceau farvning, og derefter teste flere referencepunkter proteiner til at identificere dem, der ikke ændre sig i de forskellige eksperimentelle grupper.

Figur 1
Figur 1. Arbejdsgang af subcellulær fraktionering at berige SPM og PSD proteinfraktioner.

Figur 2
Figur 2. repræsentant western blot af den samlede, SPM og PSD1T protein fra mus striatum. 10 ug proteinekstrakt blev opløst på SDS-denaturering, 10% acrylamid geler og overført til PVDF-membraner. Efterfølgende disse blots blev inkuberet med primære antistoffer for αCaMKII, GluR1, PSD-93, og PSD-95, som er alle komponenter i den postsynaptiske tæthed. Følgelig er disse proteiner beriget med SPM og PSD fraktioner. Alternativt blev blots inkuberet med et primært antistof DAT, som er beliggende i præsynaptiske membraner i striatum. Mens DAT er beriget i fraktionen SPM, er det ikke en del af PSD kompleks, og immunoreaktivitet ikke overholdes i PSD fraktion. Antistoffer mod actin eller natrium / kalium-ATPase (Na / K-pumpen) kan de bruges som kontrol, selv om nogle eksperimentelle betingelser kan påvirke niveauet af disse proteiner samt og så passende påsætningskontrol skal bestemmes empirisk.

Figur 3
Figur 3. Repræsentative eksempler på saccharosegradient før og efter ultracentrifugering. A. Efter gradienten fremstilles, bør der være tre faser, der er synlige, når røret holdes op mod lyset. De hvide pile angiver interfasen mellem 0,8 / 1,0 M saccharose løsninger og 1,0 / 1,2 M sucrose løsninger. B. Når prøven er lagt på toppen af gradienten, er det i en 0,32 M saccharoseopløsning, og vil hvile på toppen af 0,8 M saccharose lag. C. Efter centrifugering vil homogenatet adskilt i flere fraktioner. Fraktionen flyder ved interfasen på 0,8 / 1,0 M sucrose løsninger vil blive beriget i myelin membraner. Fraktionen ved interfasen på 1,0 / 1,2 M saccharose løsninger repræsenterer SPM fraktion, der opsamles med en nål og sprøjte. Pelleten ved bunden af ​​røret beriget for mitokondrielle proteiner.

Solutioner HEPES-pufret saccharose Proteaseinhibitorer * phosphatase hæmmere
1 M HEPES, pH 7,4 0,32 M sucrose i 4 mM HEPES (pH 7,4) 0,25 mM PMSF (lager 250 mM i ethanol, 1.000 x) 10 mM natriumfluorid (lager 500 mM, 50x)
4 mM HEPES, pH 7,4 0,8 M saccharose i 4 mM HEPES (pH 7,4) 1,5 ug / ml Aprotinin (lager 1,5 mg / ml, 1.000 x) 2,5 mM natriumpyrophosphat (lager 250 mm, 100x)
Hedeselskabet 2 O 1,0 M saccharose i 4 mM HEPES (pH 7,4) 10 pg / ml Leupeptin (lager 10 mg / ml, 1.000 x) 1,0 mM B-glycerophosphat (lager 200 mM, 200x)
50 mM HEPES (pH 7,4) 2 mM EDTA 1,2 M sucrose i 4 mM HEPES (pH 7,4) 0,1 mg / ml Benzamidin (lager 100 mg / ml, 1.000 x) 5.0mM natriumorthovanadat (lager 500 mM, 100x)
10 ug / ml pepstatin (lager 5 mg / ml i ethanol, 500x)

Tabel 1. Nødvendige reagenser

øjre: 43px; "> PSD-2T
Fraktion Proteinfraktion Proteinmarkør
P1 nukleare histon H1 27
S1 cytosol / membraner calnexin 28 (endoplasmatiske reticulum), a-tubulin 29 (cytoskelettet) GAPDH 30 (cytosol), 58k Golgi proTEIN 31 (Golgi apparatet)
P2 og P2 ' rå synaptosomer AMPA og NMDA-receptorunderenheder 32
S2 og S2 ' cytosol / let membraner nNOS1 29 (cytosol), GAPDH (cytosol), lamp1 33 (lysosom) PEX14 34 (peroxisomal)
P3 synaptosom / mitokondrier VDAC 35 (mitokondrier), AMPA og NMDA-receptorunderenheder (synaptosomer)
S3 synaptiske vesikel SV2 8, synaptophysin 8
0,8 M / 1,0 M m Yelin myelin basisk protein 36
1,0 M / 1,2 M SPM AMPA og NMDA receptorunderenheder, præsynaptiske markør (SNAP25 8), neurexin 32, neuroligin 32
1.2 MP mitokondrier VDAC 35
PSD (1T) PSD PSD93 32, PSD95 32, AMPA og NMDA-receptor-underenheder, neuroligin, PICK1 32, CaMKII 32
TS præsynaptiske membraner SNAP25, Munc18 37, Fagot 38, neurexin
beriget PSD PSD95, AMPA og NMDA-receptor-underenheder, PICK1, CaMKII

Tabel 2. Liste over proteinmarkører at skelne subcellulære fraktioner

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Der er flere trin i proceduren, der er afgørende for et vellykket resultat. I trin 3, er det vigtigt, at en ensartet grad af homogenisering er opnået for hver prøve. Ved homogenisering af væv med motordrevet homogenisator er en konstant hastighed ikke kun anvendes til rotation af støderen, men også med antallet af slag. Inkubationstiden under osmotisk chok bør være præcis, da forlænget homogenisering eller inkubering i hypotonisk opløsning vil lysere mitokondrier og forurene SPM prøven.

Et andet afgørende trin er til fremstilling af reagenser, især saccharose løsninger; hvis molariteten af ​​rørsukkeropløsningen er forkert procedure vil ikke fungere. Derfor bør saccharose opløsninger fremstilles ved at afveje saccharose, opløses i 4 mM HEPES-opløsning og derefter tilsætning af 4 mM HEPES den præcise slutvolumen. Fejlfinding tip: bygge en test gradient med de præparerede saccharoseopløsninger ENsikker på, at gradienten er samlet korrekt. Tilføj varierende koncentrationer af bromphenolblåt (f.eks slutkoncentration på 0,005% -0,02% w / v) til to af de tre saccharose løsninger for at hjælpe med visualisering af tre forskellige lag.

Det er vigtigt at begrænse mængden af ​​tid mellem, når gradienten er samlet, og når rørene centrifugeret. Normal diffusion vil ødelægge gradient i løbet af tiden, og det accelereres, hvis der er vibrationer på bænken, hvor gradienten er lagret. Pre-pipettering af løsninger i individuelle portioner giver mulighed for præcise mængder, der skal pipetteres med et glas Pasteur-pipette. Dette mindsker også tiden mellem gradient montage og ultracentrifugering. Fejlfinding tip: opbygge en "prøve-gradient" med bromphenolblåt-farvestof som beskrevet ovenfor på samme tid som de saccharosegradienter for eksperimentet. Integriteten af ​​gradienten kan således overvåges over tid. Testen gradient vil tjene som enindikator for diffusion hvis gradienterne er samlet for langt i forvejen, eller er udsat for vibrationer.

Endelig er det vigtigt at indsamle SPM prøven i så lille et volumen som muligt, da det er nødvendigt efterfølgende at fortynde prøven med 2,5 rumfang vand. Ideelt prøven skal indsamles i et volumen på 0,4-0,7 ml ved anvendelse af en 1 ml sprøjte. Det er tilrådeligt at bygge diskontinuerlige stigninger i løbet af sidste 20 min spin i trin 7 for at begrænse tiden mellem gradient montage og ultracentrifugering.

Protokollen indeholder anbefalingen om at forbeholde alle de forskellige fraktioner og opbevare disse på -80 ° C til efterfølgende analyse. Vi har vist, at berigelse af post-synaptiske proteiner i figur 2 kun nogle få af disse fraktioner. Det er dog tilrådeligt at måle niveauerne af et protein-af-interesse i hver af fraktionerne at forstå dens fordeling. Sammenligning af distribution af et protein i fraktionerne med andre subcellulære markørproteiner vil også bidrage til at bekræfte, at de eksperimentelle forhold har opnået den ønskede fraktionering. Tabel 2 opsummerer almindeligt anvendte proteinmarkører, der kan bruges som indikatorer for de faser af fraktionering 8,27- 38.

Udnyttelse af diskontinuerlig saccharosegradient er almindeligt anvendt til at berige synaptiske plasmamembraner. Denne fremgangsmåde har den fordel i forhold til kontinuerlig Percoll-gradienter i at diskontinuerte saccharosegradienter er lettere at fremstille og ikke kræver specialiseret udstyr. Dog kan denne metode ikke være tilstrækkelige til præcist at lokalisere et protein af interesse, og for disse applikationer en Percoll gradient kan være at foretrække.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M HEPES, pH 7.4 BioShop HEP003.100
HEPES BioShop HEP001.500 
Sucrose  BioShop SUC507.1
EDTA BioBasic EB0185
PMSF BioShop PMS123.5
Aprotinin BioShop APR600.1
Leupeptin BioShop LEU001.1
Pepstatin BioShop PEP605.5
Benzamidine BioShop BEN601.25
Sodium fluoride BioShop SFL001.100
Sodium pyrophosphate BioShop SPP310.100
Sodium orthovanadate BioShop SOV664.10
β-glycerophosphate BioShop GYP001.10
Triton X-100 BioShop TRX506.500
18 G x 1 ½” needle BD 305196
1 cc syringe BD 309659
Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 VWR KT885450-0023
IKA Model RW 16 basic stirrer IKA Works 2572100
Sorvall SM-24 fixed angle rotor ThermoScientific 29017
Sorvall RC 6 Plus centrifuge ThermoScientific 46910
Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml) Beckman Coulter 331372
SW 41 Ti rotor swinging bucket Beckman Coulter 331362
Beckman L-80 floor ultracentrifuge Beckman Coulter
Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml) Beckman Coulter 349622
TLA-100.3 fixed angle rotor Beckman Coulter 349481
Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
  2. Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
  3. Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
  4. Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
  5. Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
  6. Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
  7. Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
  8. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  9. Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
  10. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
  11. Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
  12. Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
  13. Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
  14. Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
  15. Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density protein" is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
  16. Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
  17. Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
  18. Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
  19. Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
  20. Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
  21. Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
  22. Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
  23. Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
  24. Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
  25. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  26. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a Laboratory Manual. 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  27. Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
  28. Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
  29. Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
  30. Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
  31. Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
  32. Neff, R. A. 3rd, Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
  33. Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
  34. Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
  35. Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
  36. Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
  37. Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
  38. Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).
Fremstilling af Synaptic plasmamembranen og postsynaptiske Density Proteiner hjælp af en Diskontinuerlig sucrosegradient
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. J. Vis. Exp. (91), e51896, doi:10.3791/51896 (2014).More

Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. J. Vis. Exp. (91), e51896, doi:10.3791/51896 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter