Dit artikel beschrijft de verrijking van eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan door ultracentrifugatie op een discontinue sucrose gradiënt. De verdere uitwerking van postsynaptische dichtheid eiwit wordt ook beschreven. Eiwitpreparaten zijn geschikt voor western blotting of 2D DIGE analyse.
Neuronale subcellulaire fractionering technieken maken de kwantificering van eiwitten die worden verhandeld en naar de synaps. Zoals oorspronkelijk beschreven in de late 1960's kunnen eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan door ultracentrifugatie worden geïsoleerd op een sucrose dichtheidsgradiënt. Zodra synaptische membranen worden geïsoleerd, kan de macromoleculaire complex bekend als de post-synaptische dichtheid vervolgens worden geïsoleerd door zijn onoplosbaarheid detergent. De technieken om synaptische plasmamembranen en postsynaptische dichtheid isolaat blijft in wezen hetzelfde na 40 jaar, en worden veel gebruikt in de huidige neurologieonderzoek. Dit artikel beschrijft de fractionering van eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan en postsynaptische dichtheid met een discontinue sucrose gradiënt. Resulterende eiwit voorbereidingen zijn geschikt voor western blotting of 2D DIGE analyse.
Neuronen communiceren via synapsen, en de kwaliteit van deze communicatie wordt voor een groot deel gereguleerd door veranderingen in de samenstelling van eiwitten in de synaps. Met name de eiwitten in het postsynaptische dichtheid deelnemen neuronale communicatie door innig steigers neurotransmitter receptoren met hun signaaltransductiesystemen 1. Bovendien blijvende veranderingen in de sterkte van synaptische werkzaamheid worden gecontroleerd door toevoeging of verwijdering van receptoren op postsynaptische dichtheid 1-6. Daarom is de isolatie en kwantificering van synaptische eiwitten is een noodzakelijke en nuttige techniek om inzicht te krijgen in de manieren waarop neuronen reageren op prikkels en synaptische werkzaamheid 7 veranderen. Dit artikel beschrijft een gebruikelijke techniek synaptische eiwitten uit hersenweefsel van knaagdieren isoleren door ultracentrifugatie op discontinue sucrosegradiënten. De synaptische plasmamembraan fractie verrijkt kan worden en geïsoleerd op basisde dichtheid van sucrose, die is empirisch bepaald Soortgelijke 1,2 M sucrose is.
Afhankelijk van de biologische vraag kan subcellulaire fracties worden gescheiden door continue of discontinue gradiënten van hetzij sucrose of Percoll. Continue gradiënten kan een scheiding van eiwitten in meerdere fracties; Dit kan bijzonder nuttig zijn om de co-lokalisatie van eiwitten in een bepaalde fractie 8 demonstreren. De bereiding van continue gradiënten is bewerkelijker en behoeft voor vele toepassingen. Discontinue gradiënten relatief gemakkelijker te bereiden en kunnen worden gebruikt om proteïnen in een aantal, in hoofdzaak gedefinieerde fracties te scheiden. Discontinue gradiënten die bestaan uit drie lagen sucrose verhogen molariteit zijn op grote schaal gebruikt om eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan (SPM) te isoleren. Deze synaptische plasmamembraan fractie kan verder worden verwerkt om de postsynaptische dichtheid fractioneringn (PSD) van detergens behandeling en isolatie van het detergens-oplosbare fractie.
Wanneer dit proces eerst beschreven in 1960 9,10, elektronenmicroscopie werd gebruikt om de organellen en membranen die ongeveer synaptische plasmamembraan en postsynaptische dichtheid fracties 9-14 definiëren tonen. Deze studies toonden de opname vóór en postsynaptische membranen en synaptische blaasjes in de SPM fractie; na detergensbehandeling primair elektron-dichte, postsynaptische dichtheden zichtbaar. In de procedure wordt een hypotone shock gebruikt knijpen de synaptische processen van het cellichaam 10. Deze stap maakt gebruik van het feit dat mitochondriën zijn bestand tegen osmotische shock en intact blijven en zijn dus sedimenteren op de bodem van de sucrose gradiënt (figuur 1).
Met deze zelfde verrijking techniek SPM en de PSD fracties werden eerst biochemischbepaald door polyacrylamide gel elektroforese en sequentiebepaling van de belangrijkste eiwitbestanddelen 15-17. Vervolgens western blot analyse werd gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van de niveaus van synaptische eiwitten en definieert deze fracties verder (figuur 2). Wij hebben deze techniek in onze laboratoria veranderingen in de synaptische niveaus van de dopamine transporter die optreden wanneer de Slc6a3 locus gedupliceerd in muizen 18 kwantificeren. We hebben ook deze techniek NMDA receptor deficiënte muizen synaps-specifieke verlaging van eiwitten die deel uitmaken van de DISC1 interactoom 19 ontdekken.
Blijkens western blot analyse SPM fracties bevatten synaptische vesicles membraaneiwitten, endosoom markers, mitochondriale eiwitten, membraangeassocieerd synthetische enzymen en signaaltransductie moleculen, alsmede integrale componenten van de postsynaptische dichtheid en synaptische plasmamembranen 20-23. Even PSD fracties kan verontreiniging met overvloedige mitochondriale eiwitten en kan het nodig zijn een tweede gradiënt sedimentatie of extra zuiveringsstappen uitgevoerd dat ze 13 verwijderen. Onlangs heeft kwantitatieve massaspectrometrie een lijst van meer dan 100 eiwitten in het postsynaptische dichtheid alleen, alsmede een indicatie van de relatieve abundantie van deze componenten 24,25 ontvangen.
Er zijn verschillende stappen in de procedure die van cruciaal belang voor een succesvol resultaat zijn. In stap 3, is het belangrijk dat een consistente mate van homogenisatie wordt verkregen voor elk monster. Bij homogeniseren weefsel met de motor aangedreven homogenisator, wordt een constante snelheid niet alleen de rotatie van de stamper, maar ook het aantal slagen. De incubatietijd tijdens de osmotische shock dient precies te zijn, aangezien de verlenging van homogenisering of incubatie in de hypotone oplossing mit…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
EDTA | BioBasic | EB0185 | |
PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
1cc syringe | BD | 309659 | |
Name of Equipment | Company | Catalog number | |
Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |