Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Voorbereiding van Synaptic plasmamembraan en Postsynaptische Density eiwitten met behulp van een discontinue sucrosegradiënt

doi: 10.3791/51896 Published: September 3, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Dit artikel beschrijft de verrijking van eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan door ultracentrifugatie op een discontinue sucrose gradiënt. De verdere uitwerking van postsynaptische dichtheid eiwit wordt ook beschreven. Eiwitpreparaten zijn geschikt voor western blotting of 2D DIGE analyse.

Abstract

Neuronale subcellulaire fractionering technieken maken de kwantificering van eiwitten die worden verhandeld en naar de synaps. Zoals oorspronkelijk beschreven in de late 1960's kunnen eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan door ultracentrifugatie worden geïsoleerd op een sucrose dichtheidsgradiënt. Zodra synaptische membranen worden geïsoleerd, kan de macromoleculaire complex bekend als de post-synaptische dichtheid vervolgens worden geïsoleerd door zijn onoplosbaarheid detergent. De technieken om synaptische plasmamembranen en postsynaptische dichtheid isolaat blijft in wezen hetzelfde na 40 jaar, en worden veel gebruikt in de huidige neurologieonderzoek. Dit artikel beschrijft de fractionering van eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan en postsynaptische dichtheid met een discontinue sucrose gradiënt. Resulterende eiwit voorbereidingen zijn geschikt voor western blotting of 2D DIGE analyse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Neuronen communiceren via synapsen, en de kwaliteit van deze communicatie wordt voor een groot deel gereguleerd door veranderingen in de samenstelling van eiwitten in de synaps. Met name de eiwitten in het postsynaptische dichtheid deelnemen neuronale communicatie door innig steigers neurotransmitter receptoren met hun signaaltransductiesystemen 1. Bovendien blijvende veranderingen in de sterkte van synaptische werkzaamheid worden gecontroleerd door toevoeging of verwijdering van receptoren op postsynaptische dichtheid 1-6. Daarom is de isolatie en kwantificering van synaptische eiwitten is een noodzakelijke en nuttige techniek om inzicht te krijgen in de manieren waarop neuronen reageren op prikkels en synaptische werkzaamheid 7 veranderen. Dit artikel beschrijft een gebruikelijke techniek synaptische eiwitten uit hersenweefsel van knaagdieren isoleren door ultracentrifugatie op discontinue sucrosegradiënten. De synaptische plasmamembraan fractie verrijkt kan worden en geïsoleerd op basisde dichtheid van sucrose, die is empirisch bepaald Soortgelijke 1,2 M sucrose is.

Afhankelijk van de biologische vraag kan subcellulaire fracties worden gescheiden door continue of discontinue gradiënten van hetzij sucrose of Percoll. Continue gradiënten kan een scheiding van eiwitten in meerdere fracties; Dit kan bijzonder nuttig zijn om de co-lokalisatie van eiwitten in een bepaalde fractie 8 demonstreren. De bereiding van continue gradiënten is bewerkelijker en behoeft voor vele toepassingen. Discontinue gradiënten relatief gemakkelijker te bereiden en kunnen worden gebruikt om proteïnen in een aantal, in hoofdzaak gedefinieerde fracties te scheiden. Discontinue gradiënten die bestaan ​​uit drie lagen sucrose verhogen molariteit zijn op grote schaal gebruikt om eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan (SPM) te isoleren. Deze synaptische plasmamembraan fractie kan verder worden verwerkt om de postsynaptische dichtheid fractioneringn (PSD) van detergens behandeling en isolatie van het detergens-oplosbare fractie.

Wanneer dit proces eerst beschreven in 1960 9,10, elektronenmicroscopie werd gebruikt om de organellen en membranen die ongeveer synaptische plasmamembraan en postsynaptische dichtheid fracties 9-14 definiëren tonen. Deze studies toonden de opname vóór en postsynaptische membranen en synaptische blaasjes in de SPM fractie; na detergensbehandeling primair elektron-dichte, postsynaptische dichtheden zichtbaar. In de procedure wordt een hypotone shock gebruikt knijpen de synaptische processen van het cellichaam 10. Deze stap maakt gebruik van het feit dat mitochondriën zijn bestand tegen osmotische shock en intact blijven en zijn dus sedimenteren op de bodem van de sucrose gradiënt (figuur 1).

Met deze zelfde verrijking techniek SPM en de PSD fracties werden eerst biochemischbepaald door polyacrylamide gel elektroforese en sequentiebepaling van de belangrijkste eiwitbestanddelen 15-17. Vervolgens western blot analyse werd gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van de niveaus van synaptische eiwitten en definieert deze fracties verder (figuur 2). Wij hebben deze techniek in onze laboratoria veranderingen in de synaptische niveaus van de dopamine transporter die optreden wanneer de Slc6a3 locus gedupliceerd in muizen 18 kwantificeren. We hebben ook deze techniek NMDA receptor deficiënte muizen synaps-specifieke verlaging van eiwitten die deel uitmaken van de DISC1 interactoom 19 ontdekken.

Blijkens western blot analyse SPM fracties bevatten synaptische vesicles membraaneiwitten, endosoom markers, mitochondriale eiwitten, membraangeassocieerd synthetische enzymen en signaaltransductie moleculen, alsmede integrale componenten van de postsynaptische dichtheid en synaptische plasmamembranen 20-23. Even PSD fracties kan verontreiniging met overvloedige mitochondriale eiwitten en kan het nodig zijn een tweede gradiënt sedimentatie of extra zuiveringsstappen uitgevoerd dat ze 13 verwijderen. Onlangs heeft kwantitatieve massaspectrometrie een lijst van meer dan 100 eiwitten in het postsynaptische dichtheid alleen, alsmede een indicatie van de relatieve abundantie van deze componenten 24,25 ontvangen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het volgende protocol voldoet aan de richtlijnen van de Canadese Raad van Animal Care en is goedgekeurd door de faculteit Geneeskunde en Farmacie Animal Care Committee aan de Universiteit van Toronto goedgekeurd.

1 Bereid Benodigde reagentia zoals beschreven in Tabel 1

  1. Protease en fosfatase (eventueel) remmers Naar alle sucrose oplossingen, buffers en DDH 2 O concentraties aangegeven in tabel 1. Belangrijk: Voer alle stappen bij 4 ° C en pre-cool alle reagentia en apparatuur voor het begin van het experiment. Label alle buizen, waaronder ultracentrifugebuizen, met permanent marker.

2 Dissectie van de Passende Brain Gewest

  1. Offer het dier door cervicale dislocatie of onthoofding. Huis en euthanaseren dieren in overeenstemming met de institutionele en overheidsbeleid op de verzorging van dieren.
  2. Voor het snel verwijderen the hersenen uit de schedel en plaats op een gekoelde dissectie blok.
  3. Ontleden de juiste hersengebied van verse weefsel en ga verder met stap 3.

3 Tissue homogenisering met Motor Driven Glas-Teflon Homogenizer

  1. Plaats 50-100 mg (SPM) of 100-200 mg (voor PSD) van de ontleed weefsel in een gelabelde 13 ml polypropyleen buis met 4 ml 0,32 M HEPES-gebufferde sucrose oplossing. Breng het monster op een 15 ml conische glas-Teflon weefsel molen / homogenisator, zet de motor rijden tot 900 rpm (instelling 7) en homogeniseren van het monster met 12 slagen over een 30 sec periode. Gebruik een ander glas-Teflon homogenisator tussen de monsters, of spoel de homogenisator met koud gedestilleerd water tussen de monsters en wrijf droog met een Kimwipe. OPMERKING: tot 4 g weefsel kunnen worden gehomogeniseerd in 4 ml 0,32 M HEPES-gebufferde sucrose-oplossing, maar het is wenselijk minder weefsel te gebruiken om het fractionering waarborgen.
  2. Terug Breng het gehomogeniseerd monster to dezelfde 13 ml polypropyleen buis. Reserve 100 pl homogenaat en bewaar bij -80 ° C voor daaropvolgende proteïne kwantificering en Western blot analyse van de totale eiwitfractie.

4 lage snelheid centrifugeren de nucleaire Fraction Verwijder (Opbrengsten Supernatant S1)

  1. Centrifugeer het homogenaat in een vaste hoek rotor bij 900 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Breng het supernatans (S1) naar een nieuwe gelabelde 13 ml buis en resuspendeer de nucleaire fractie pellet (P1) in 500 ui 0,32 M HEPES-gebufferde sucrose. NB: The (P1) fractie kan worden opgeslagen bij -80 ° C en gebruikt voor western blot analyse van de nucleaire fractie.

5 Verrijking van de Crude Synaptosomale Fraction (Opbrengsten Pellet P2)

  1. Centrifugeer het supernatant (S1) bij 10.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant (S2) en reserve 500 ul in een microcentrifugebuis te bewaren bij -80 ° C voor daaropvolgende proteïne quantification en western blot analyse van het cytosol / licht membraan fractie. Resuspendeer de overblijvende onzuivere synaptosomale fractie pellet (P2) in 1 ml 0,32 M HEPES-gebufferde sucrose oplossing en voeg nog 3 ml 0,32 M HEPES-gebufferde sucrose oplossing.
  2. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant (S2) en reserve 500 ul in een microcentrifugebuis te bewaren bij -80 ° C voor daaropvolgende proteïne kwantificering en Western blot analyse van het cytosolische / licht membraanfractie. Sla de gewassen ruwe synaptosomale pellet (P2) in de polypropyleen buis.

6 Lysing (Hypoosmotic Shock) van de ruwe Synaptosomale Fraction

  1. Lyse de ruwe synaptosomale pellet (P2) in de polypropyleen buis door resuspenderen in 1 ml van DDH 2 O. Voeg nog een 3 ml van DDH 2 O, over te dragen aan een glas-Teflon weefsel homogenisator en homogeniseren met de hand met 3 slagen. OPMERKING: Het is belangrijkom deze stap zo snel mogelijk uit te voeren en snel ga verder met stap 6.2.
  2. Transfer monsters van de homogenisator terug in dezelfde 13 ml polypropyleen buis en snel aan te passen de sample 4 mM HEPES met 16 gl 1 M HEPES-oplossing, zwenken om te mengen.
  3. Draai monsters bij 4 ° C gedurende 30 minuten om volledige lysis te verzekeren.

7 Verrijking van de Synaptosomale membraanfractie (P3)

  1. Centrifugeer bij 25.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het ruwe vesiculaire supernatant fractie (S3) en reserve in een 5 ml buisje te bewaren bij -80 ° C voor daaropvolgende proteïne kwantificering en western blot analyse. Resuspendeer de synaptosomale membraanfractie (P3) in 1 ml 0,32 M HEPES-gebufferde sucrose oplossing.

8 Bereiding van de discontinue sucrosegradiënt

  1. Pipetteer precies 3,5 ml van 1,2 M HEPES-gebufferde sucrose oplossing en precies 3,0 ml van 1,0 M en 0,8 M HEPE-S gebufferde sucrose-oplossing in afzonderlijke 6 ml snap cap buizen. OPMERKING: Dit wordt gedaan om de volumes van de buffers die worden gebruikt om de sucrosegradiënt maken pre-meet. Exacte de volumemeting is belangrijk dat de resulterende gradiënten worden afgewogen voor ultracentrifugatie.
  2. Met behulp van een glas Pasteur pipet en Bollenstreek, overdragen 1,2 M HEPES-gebufferde sucrose oplossing voor de 12 ml polyallomer ultracentrifuge buis. Laag het 1,0 M HEPES-gebufferde sucrose oplossing boven de 1,2 M HEPES-gebufferde sucrose oplossing voorzichtig. Tenslotte laag het 0,8 M HEPES-gebufferde sucrose oplossing boven de 1,0 M HEPES-gebufferde sucrose oplossing. Gebruik een nieuw Pasteur pipet voor elke sucrose-oplossing en zorg dat u de sucrosegradiënt verstoren. Trillingen van een bank vortex of microcentrifuge de integriteit van het verloop verstoren.
  3. Met een Pasteur pipet, lagen de geresuspendeerde synaptosomale membraanfractie (P3) bovenop de bereide discontinue sucrose gradiënt.Zorg ervoor dat de hellingen worden in evenwicht gehouden door het wegen ze in de emmer van de swingende emmer rotor. Als de emmers zijn niet in balans, gebruik dan een P200 pipet om zorgvuldig toe te voegen 0,32 M HEPES-gebufferd sucrose naar de top van de helling en de balans van de rotor emmers.

9 Fractionering van de Synaptic plasmamembraan (SPM)

  1. Ultracentrifuge in een swinging bucket rotor bij 150.000 g gedurende 2 uur bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig de sucrosegradiënten van de ultracentrifuge emmers. Met behulp van een 18 G naald en een spuit 1 ml, doorboren de buis aan de onderzijde van de 1,0 M / 1,2 M HEPES-gebufferde sucrose oplossing interfase en de synaptische plasma membraanlaag (SPM) trekken.
  2. Noteer het volume dat elke SPM monster inneemt in de 1 ml spuit. Plaats de verzamelde SPM laag in 3,5 ml dikwandige ultracentrifugebuizen, voeg precies 2,5 volumes van 4 mM HEPES aan de sucrose concentratie van 1,2 M aan te passen aan 0,32 M. Nadat elk monster is geweest aan te passened naar 0,32 M sucrose, de balans van de buizen met 0,32 M HEPES-gebufferde sucrose-oplossing.
  3. Ultracentrifuge in een vaste hoek rotor bij 200.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de pellet synaptische plasmamembraan (SPM) in 300 ui 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-oplossing. WINKEL monsters bij -80 ° C tot gebruik voor western blotting.

10 Voorbereiding van de Postsynaptische Density Fraction (PSD)

  1. Ontdooien SPM monsters op ijs.
  2. Voeg een oplossing van 0,54% Triton X-100 in 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-oplossing.
  3. In een 5 ml polystyreen buis combineren 2,7 ml Triton X-100 / HEPES / EDTA-oplossing en 300 pi SPM fractie en bij 4 ° C gedraaid het monster gedurende 15 min
  4. Transfer monsters 3,5 ml dikwandige ultracentrifuge en centrifugeer monsters bij 32.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
  5. Behouden ons het supernatant (Triton X-100 oplosbare fractie [TS]) en bewaar bij -80; ° C. Opmerking: In dit stadium, de pellet vertegenwoordigt de "PSD-1T" fractie. Een tweede behandeling met detergent zal een "PSD-2T" fractie te produceren. Als een PSD-1T fractie gewenst is, ga dan naar stap 10.6.
    1. Een PSD-2T breuk vormen, resuspendeer de pellet in 3 ml 0,5% Triton X-100 in 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-oplossing. Draai monsters gedurende 15 min bij 4 ° C. Centrifugeer monsters bij 32.000 xg gedurende 20 minuten bij 4 ° C en ga verder met stap 10.6.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de postsynaptische (PSD) pellet in 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-oplossing. OPMERKING: De resuspensie volume kan afhangen van de grootte van de pellet; Een volume van 50-75 gl aanbevolen. Omdat de PSD fractie een detergens-onoplosbare fractie, is het vaak noodzakelijk om 1-2 gl 0,5% SDS In volledige resuspensie eiwit mogelijk. WINKEL monsters bij -80 ° C tot gebruik voor western blotting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De voorbereiding van de sucrose dichtheid moet resulteren in een duidelijke scheiding van de drie molaire oplossing van sucrose (0,8, 1,0, en 1,2 M sucrose). Zie figuur 3A een voorbeeld van de gradiënt voor het eiwit monster wordt toegevoegd. Als de helling te veel wordt voorbereid, of als het wordt bereid op een bankje oppervlak met trillingen van andere apparatuur, zal de gradiënt in het gedrang komen en een goede scheiding zal niet worden gehaald. Als een duidelijke scheiding van de drie oplossingen niet zichtbaar is, is het raadzaam om een ​​nieuwe verloop voordat het toevoegen van het eiwitmonster. Zie Figuur 3B een voorbeeld van de sucrose gradiënt wanneer het eiwit monster wordt toegevoegd (zwarte pijl).

Na het centrifugeren, moet er duidelijke banden van eiwitfracties zijn op ieder interfase (0,32 / 0,8, 0,8 / 1,0, 1,0 / 1,2). Voorts moet een pellet zichtbaar onderin de buis. Zie Figuur 3C voor een voorbeeldvan de fractie bands na ultracentrifuge. Als fracties zijn alleen diffuus aanwezig op de interfase, is het waarschijnlijk dat de gradiënt werd gecompromitteerd en verdere verwerking wordt afgeraden.

Western blotting van de totale, SPM en PSD1T eiwit monsters van muis striatum wordt getoond in figuur 2. Verrijking van synaptische proteïnen zoals GluR1, PSD95 en CaMKII, kan worden gevisualiseerd door het laden van een constante hoeveelheid eiwit (10 ug) van totaal SPM , en PSD fracties. Perisynaptic eiwitten zoals de dopamine transporter (DAT) worden verrijkt in de SPM fractie, maar worden geëlimineerd in de daaropvolgende detergent stappen van de PSD verrijkingsproces.

Om gelijke lading te verzekeren, kan eiwitniveaus worden gevisualiseerd op de western blot membraan door kleuring met Ponceau Red 26. Antilichamen gebaseerde "loading controles" worden vaak in de literatuur, maar dit kan een verkeerde benaming, omdat synaptische eiwitten diff kan zijnerentially geregeld in experimentele behandeling groepen. Als een op antilichamen gebaseerde "loading control" gewenst is, is het raadzaam om eerst te bepalen gelijkwaardig eiwitbelading door Ponceau vlekken, en test een aantal referentie-eiwitten aan degenen die niet veranderen in de verschillende experimentele groepen te identificeren.

Figuur 1
Figuur 1 Workflow van subcellulaire fractionering aan SPM en PSD eiwit fracties verrijken.

Figuur 2
Figuur 2 Representatieve western blot van totaal, SPM en PSD1T eiwit van muis striatum. 10 ug eiwit extract werden gescheiden op SDS-denaturatie, 10% acrylamide gels en overgebracht naar PVDF-membranen. Vervolgens worden deze blots werden geïncubeerd met primaire antilichamen voor αCaMKII, GluR1, PSD-93, en PSD-95, waarbij alle componenten van de postsynaptische dichtheid. Dienovereenkomstig zijn deze eiwitten verrijkt in de SPM en PSD fracties. Anders, werden blots geïncubeerd met een primair antilichaam DAT, die is gelegen in presynaptische membraan in het striatum. Terwijl DAT is verrijkt in de SPM fractie, is het geen deel van de PSD complex en immunoreactiviteit wordt niet waargenomen in de PSD fractie. Antilichamen tegen actine of natrium / kalium-ATPase (Na / K pomp) kunnen worden gebruikt als lading controles, hoewel sommige experimentele omstandigheden beïnvloeden de niveaus van deze eiwitten en en zo de juiste belastingsbegrenzing moet empirisch worden bepaald.

Figuur 3
Figuur 3. Representatieve voorbeelden van sucrosegradiënt voor en na de ultracentrifuge. A. Na de gradiënt wordt bereid, moet er drie fasen die zichtbaar zijn wanneer de buis wordt tegen het licht gehouden. De witte pijlen geven de interfase tussen 0,8 / 1,0 M sucrose oplossing en 1,0 / 1,2 M sucrose oplossingen. B. Wanneer het monster bovenop de gradiënt geladen is in een 0,32 M sucrose-oplossing en zal rusten bovenop de 0,8 M sucrose layer. C. Na centrifugatie wordt het homogenaat scheiden in verschillende fracties. De fractie drijvend op de tussenfase van 0,8 / 1,0 M sucrose oplossingen worden verrijkt in myeline membranen. De fractie van de interfase van 1,0 / 1,2 M sucrose oplossingen ligt de SPM fractie die verzameld met een naald en injectiespuit. De pellet op de bodem van de buis is verrijkt mitochondriale eiwitten.

Soluties HEPES-gebufferde sucrose Proteaseremmers * Fosfatase-remmers
1 M HEPES pH 7,4 0,32 M sucrose in 4 mM HEPES (pH 7.4) 0,25 mM PMSF (voorraad 250 mM in ethanol, 1000x) 10 mM Sodium Fluoride (voorraad 500 mm, 50x)
4 mM HEPES pH 7,4 0,8 M sucrose in 4 mM HEPES (pH 7.4) 1,5 ug / ml aprotinine (voorraad 1,5 mg / ml, 1000x) 2,5 mM Natriumpyrofosfaat (voorraad 250 mM, 100x)
DDH 2 O 1,0 M sucrose in 4 mM HEPES (pH 7.4) 10 ug / ml leupeptine (voorraad 10 mg / ml, 1000x) 1.0 mM b-glycerofosfaat (voorraad 200 mm, 200x)
50 mM HEPES (pH 7.4) 2 mM EDTA 1.2 M sucrose in 4 mM HEPES (pH 7.4) 0,1 mg / ml Benzamidine (voorraad 100 mg / ml, 1000x) 5.0mM natriumorthovanadaat (voorraad 500 mM, 100x)
10 ug / ml pepstatine (voorraad 5 mg / ml in ethanol, 500x)

Tabel 1 Benodigde reagentia

echts: 43px; "> PSD-2T
Fractie Eiwitfractie Protein marker
P1 nucleaire histon H1 27
S1 cytosol / membranen calnexin 28 (endoplasmatisch reticulum), a-tubuline 29 (cytoskelet), GAPDH 30 (cytosol), 58K pro golgiTein 31 (Golgi-apparaat)
P2 en P2 ' ruwe synaptosomen AMPA en NMDA receptor subunits 32
S2 en S2 ' cytosol / lichte membranen nNOS1 29 (cytosol), GAPDH (cytosol), LAMP1 33 (lysosoom), PEX14 34 (peroxisome)
P3 synaptosome / mitochondriën VDAC 35 (mitochondria), AMPA en NMDA receptor subeenheden (synaptosome)
S3 synaptischeblaasjeseiwit SV2 8, synaptofysine 8
0.8 M / 1,0 M m Yelin myeline basisch eiwit 36
1,0 M / 1,2 M SPM AMPA en NMDA receptor subunits, presynaptische marker (SNAP25 8), neurexin 32, neuroligin 32
1.2 MP mitochondriën VDAC 35
PSD (1T) PSD PSD93 32, PSD95 32, AMPA en NMDA receptor subunits, neuroligin, PICK1 32, CaMKII 32
TS presynaptische membranen SNAP25, Munc18 37, Fagot 38, neurexin
verrijkte PSD PSD95, AMPA en NMDA receptor subunits, PICK1, CaMKII

Tabel 2 Lijst van eiwit markers om subcellulaire fracties onderscheiden

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Er zijn verschillende stappen in de procedure die van cruciaal belang voor een succesvol resultaat zijn. In stap 3, is het belangrijk dat een consistente mate van homogenisatie wordt verkregen voor elk monster. Bij homogeniseren weefsel met de motor aangedreven homogenisator, wordt een constante snelheid niet alleen de rotatie van de stamper, maar ook het aantal slagen. De incubatietijd tijdens de osmotische shock dient precies te zijn, aangezien de verlenging van homogenisering of incubatie in de hypotone oplossing mitochondriën zal lyseren en verontreinigen de SPM monster.

Een kritische stap in de bereiding van reagentia, met name de sucrose-oplossingen; als de molariteit van de sucrose-oplossing is onjuist de procedure niet zal werken. Daarom moet sucrose oplossingen worden bereid door het afwegen sucrose, opgelost in 4 mM HEPES oplossing vervolgens toevoegen 4 mM HEPES naar specifieke eindvolume. Probleemoplossing tip: bouw een test verloop met de geprepareerde sucrose oplossingen enervoor dat de gradiënt de montage. Voeg variërende concentraties broomfenolblauw (bijvoorbeeld eindconcentratie van 0,005% -0,02% w / v) aan de twee van de drie sucrose oplossingen te helpen bij het visualiseren van drie verschillende lagen.

Het is belangrijk om de hoeveelheid te beperken tussen wanneer de gradiënt is gemonteerd en wanneer de buizen gecentrifugeerd. Normaal zal de diffusie gradiënt tijd vernietigen, en dit wordt versneld als er trillingen op de bank waar de gradiënt wordt opgeslagen. Pre-oplossingen pipetteren in afzonderlijke porties zorgt voor nauwkeurige volumes worden gepipetteerd met een glazen Pasteur pipet. Dit vermindert ook de tijd tussen gradiëntsamenstel en ultracentrifugatie. Problemen tip: bouw een "test gradiënt" met broomfenolblauw kleurstof zoals hierboven beschreven tegelijk als sucrose gradiënten voor het experiment. De integriteit van de gradiënt kan dus de tijd gevolgd. De test gradiënt zal dienen als eenindicator van diffusie, indien de gradiënten te ver vooraf samengestelde of worden blootgesteld aan trillingen.

Tenslotte is het belangrijk om de SPM monster in een zo klein mogelijk volume te verzamelen, aangezien het noodzakelijk om het monster vervolgens verdund met 2,5 volumina water. Idealiter zou de steekproef moet worden verzameld in een volume van 0,4-0,7 ml met behulp van een 1 cc spuit. Het is raadzaam om de discontinue gradiënten bouwen tijdens de laatste 20 min centrifugeren in stap 7 om tussen gradiëntsamenstel en ultracentrifugatie beperken.

Het protocol omvat de aanbeveling om alle verschillende fracties reserveren en bewaar deze bij -80 ° C voor daaropvolgende analyse. We hebben de verrijking van de post-synaptische eiwitten in figuur 2 blijkt in slechts een paar van deze fracties. Het is echter wenselijk om de niveaus van een eiwit van belang te meten in elk van de fracties om de distributie opleveren. Het vergelijken van de distribution van een eiwit in de fracties met andere subcellulaire markereiwitten zal ook bevestigen dat de experimentele omstandigheden de gewenste fractionering bereikt. Tabel 2 geeft gangbare eiwit markers die kunnen worden gebruikt als indicatoren voor de fasen van fractionering 8,27- 38.

Gebruik van de discontinue sucrose gradiënt wordt veel gebruikt om synaptische plasmamembranen verrijken. Deze werkwijze heeft het voordeel boven continue Percoll gradiënten in die discontinue sucrose gradiënten gemakkelijker uit te voeren en geen gespecialiseerde apparatuur vereisen. Echter, deze werkwijze niet voldoende om een ​​eiwit van belang precies te lokaliseren, en voor deze toepassingen een Percoll gradiënt de voorkeur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M HEPES, pH 7.4 BioShop HEP003.100
HEPES BioShop HEP001.500 
Sucrose  BioShop SUC507.1
EDTA BioBasic EB0185
PMSF BioShop PMS123.5
Aprotinin BioShop APR600.1
Leupeptin BioShop LEU001.1
Pepstatin BioShop PEP605.5
Benzamidine BioShop BEN601.25
Sodium fluoride BioShop SFL001.100
Sodium pyrophosphate BioShop SPP310.100
Sodium orthovanadate BioShop SOV664.10
β-glycerophosphate BioShop GYP001.10
Triton X-100 BioShop TRX506.500
18 G x 1 ½” needle BD 305196
1 cc syringe BD 309659
Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 VWR KT885450-0023
IKA Model RW 16 basic stirrer IKA Works 2572100
Sorvall SM-24 fixed angle rotor ThermoScientific 29017
Sorvall RC 6 Plus centrifuge ThermoScientific 46910
Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml) Beckman Coulter 331372
SW 41 Ti rotor swinging bucket Beckman Coulter 331362
Beckman L-80 floor ultracentrifuge Beckman Coulter
Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml) Beckman Coulter 349622
TLA-100.3 fixed angle rotor Beckman Coulter 349481
Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
  2. Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
  3. Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
  4. Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
  5. Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
  6. Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
  7. Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
  8. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  9. Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
  10. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
  11. Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
  12. Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
  13. Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
  14. Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
  15. Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density protein" is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
  16. Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
  17. Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
  18. Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
  19. Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
  20. Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
  21. Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
  22. Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
  23. Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
  24. Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
  25. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  26. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a Laboratory Manual. 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  27. Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
  28. Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
  29. Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
  30. Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
  31. Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
  32. Neff, R. A. 3rd, Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
  33. Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
  34. Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
  35. Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
  36. Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
  37. Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
  38. Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).
Voorbereiding van Synaptic plasmamembraan en Postsynaptische Density eiwitten met behulp van een discontinue sucrosegradiënt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. J. Vis. Exp. (91), e51896, doi:10.3791/51896 (2014).More

Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. J. Vis. Exp. (91), e51896, doi:10.3791/51896 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter