Denne artikkelen beskriver anrikning av proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembranen ved ultrasentrifugering på en diskontinuerlig sukrosegradient. Den etterfølgende fremstilling av post-synaptiske tetthet proteiner er også beskrevet. Proteinpreparater er egnet for western blotting eller 2D DIGE analyse.
Neuronal subcellulære fraksjoneringsteknikker tillater kvantifisering av proteiner som er trafikkert til og fra synapse. Som opprinnelig ble beskrevet i slutten av 1960-tallet, kan proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembranen bli isolert ved ultrasentrifugering i en sukrose-densitets-gradient. Når synaptiske membraner er isolert, kan det makromolekylære kompleks kjent som post-synaptiske densitet deretter isolert på grunn av sin uoppløselighet vaskemiddel. Teknikkene som brukes til å isolere synaptiske plasmamembraner og post-synaptiske tetthet proteiner forblir i hovedsak de samme etter 40 år, og er mye brukt i dagens nevrovitenskap forskning. Denne artikkelen beskriver fraksjonering av proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembranen og post-synaptiske tetthet ved hjelp av en diskontinuerlig sukrosegradient. Resulterende proteinpreparater er egnet for western blotting eller 2D DIGE analyse.
Neuroner kommuniserer gjennom synapser, og kvaliteten av denne kommunikasjonen er regulert i stor grad ved endringer i sammensetningen av proteiner i synapsen. Spesielt proteiner som ligger i den postsynaptiske tetthet delta i neuronal kommunikasjon ved intimt stillasnevrotransmitterreseptorer med sine signaltransduksjonsveiene systemer en. Videre er varige endringer i styrken av synaptisk effektivitet kontrollert ved tilsetning eller fjerning av reseptorer på postsynaptiske tetthet 1-6. Derfor er isolering og kvantifisering av synaptiske proteiner en nødvendig og nyttig teknikk for å få innsikt i de måter som nevronene reagerer på stimuli og endre synaptiske effekt 7. Denne artikkelen beskriver en vanlig teknikk for å isolere synaptiske proteiner fra gnagere hjernevev etter ultracentrifugation på diskontinuerlige sakkarosegradienter. Den synaptiske plasmamembran brøkdel kan bli beriket og isolert basert pådens tetthet på sukrose, som er empirisk bestemt til å være lik 1,2 M sukrose.
Avhengig av den biologiske spørsmålet kan subcellulære fraksjoner separeres ved kontinuerlige eller diskontinuerlige gradienter av enten sukrose eller Percoll. Kontinuerlige gradienter tillate separasjon av proteiner i flere fraksjoner; Dette kan være spesielt nyttig for å demonstrere den ko-lokalisering av proteinene i løpet av en gitt fraksjon 8. Imidlertid er fremstillingen av kontinuerlige graderinger mer arbeidskrevende og er ikke nødvendig for mange anvendelser. Diskontinuerlige gradienter er forholdsvis lettere å forberede og kan brukes til å separere proteiner i et par, generelt definerte fraksjoner. Diskontinuerlige gradienter som er sammensatt av tre lag av sucrose øker molaritet har blitt mye brukt for å isolere proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembranen (SPM). Dette synaptiske plasmamembran brøkdel kan behandles videre til den postsynaptiske tetthet fraction (PSD) av vaskemiddelbehandling og isolering av vaskemiddel-uløselige fraksjonen.
Når denne prosessen ble først beskrevet i 1960 9,10, ble elektronmikroskopi brukes til å demonstrere de organeller og membraner som grovt definerer den synaptiske plasmamembranen og post-synaptiske tetthet fraksjoner 9-14. Disse studiene viste inkludering av pre-og post-synaptiske membraner og synaptiske vesikler i SPM fraksjon; etter at vaskemiddelbehandling primært elektrontette, post-synaptiske tettheter var synlig. I fremgangsmåten, blir en hypotonisk sjokk som brukes til å klemme ut de synaptiske prosesser fra cellelegemet 10. Dette trinnet tar fordel av det faktum at mitokondriene er mer motstandsdyktig overfor osmotisk sjokk og forbli intakt, og slik at de sedimentere på bunnen av sukrose gradient (figur 1).
Ved hjelp av denne samme berikelse teknikk, var de SPM og PSD fraksjoner første biokjemiskdefinert ved polyakrylamidgel-elektroforese, og sekvensering av de store protein-komponenter 15-17. Deretter western blot-analyse ble brukt for å påvise og kvantifisere nivåene av synaptiske proteiner, og videre definere disse fraksjoner (figur 2). Vi har brukt denne teknikken i våre laboratorier for å kvantifisere endringer i de synaptiske nivåer av dopamin transporter som oppstår når Slc6a3 locus er duplisert i mus 18. Vi har også brukt denne teknikken i NMDA reseptor mangelfull mus å avdekke synapse spesifikke reduksjoner i proteiner som er en del av DISC1 interactome 19.
Det er tydelig fra western blot analyse at SPM fraksjoner inneholder synaptiske vesikkel membranproteiner, endosome markører, mitokondrie protein, membran assosiert syntetiske enzymer og signaltransduksjon molekyler, så vel som integrerte komponenter av den postsynaptiske tetthet og synaptiske plasmamembraner 20-23. Even PSD fraksjoner kan ha forurensning med rikelig mitokondrie protein, og det kan være nødvendig å utføre en andre gradient sedimentasjon eller flere rensetrinn for å fjerne dem 13. Nylig er kvantitative massespektrometri ga en liste over 100 proteinene i den postsynaptiske densitet alene, så vel som en indikasjon på den relative overflod av disse komponentene 24,25.
Det er flere trinn i prosedyren som er kritiske for et vellykket resultat. I trinn 3, er det viktig at en ensartet grad av homogenisering er oppnådd for hver prøve. Når homogenisere vevet med motordrevet homogenisator, blir en konstant hastighet brukes ikke bare for rotasjon av stampe, men også med det antall slag. Inkubasjonstiden løpet av osmotisk sjokk bør være nøyaktig, siden utvidet homogenisering eller inkubering i hypoton løsning vil lyserer mitokondrier og forurense SPM prøven.
<p class="jove_conte…The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
EDTA | BioBasic | EB0185 | |
PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
1cc syringe | BD | 309659 | |
Name of Equipment | Company | Catalog number | |
Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |