Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Utarbeidelse av Synaptic Plasma Membran og postsynaptiske Density Proteiner Ved hjelp av en Discontinuous sukrosegradient

doi: 10.3791/51896 Published: September 3, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikkelen beskriver anrikning av proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembranen ved ultrasentrifugering på en diskontinuerlig sukrosegradient. Den etterfølgende fremstilling av post-synaptiske tetthet proteiner er også beskrevet. Proteinpreparater er egnet for western blotting eller 2D DIGE analyse.

Abstract

Neuronal subcellulære fraksjoneringsteknikker tillater kvantifisering av proteiner som er trafikkert til og fra synapse. Som opprinnelig ble beskrevet i slutten av 1960-tallet, kan proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembranen bli isolert ved ultrasentrifugering i en sukrose-densitets-gradient. Når synaptiske membraner er isolert, kan det makromolekylære kompleks kjent som post-synaptiske densitet deretter isolert på grunn av sin uoppløselighet vaskemiddel. Teknikkene som brukes til å isolere synaptiske plasmamembraner og post-synaptiske tetthet proteiner forblir i hovedsak de samme etter 40 år, og er mye brukt i dagens nevrovitenskap forskning. Denne artikkelen beskriver fraksjonering av proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembranen og post-synaptiske tetthet ved hjelp av en diskontinuerlig sukrosegradient. Resulterende proteinpreparater er egnet for western blotting eller 2D DIGE analyse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Neuroner kommuniserer gjennom synapser, og kvaliteten av denne kommunikasjonen er regulert i stor grad ved endringer i sammensetningen av proteiner i synapsen. Spesielt proteiner som ligger i den postsynaptiske tetthet delta i neuronal kommunikasjon ved intimt stillasnevrotransmitterreseptorer med sine signaltransduksjonsveiene systemer en. Videre er varige endringer i styrken av synaptisk effektivitet kontrollert ved tilsetning eller fjerning av reseptorer på postsynaptiske tetthet 1-6. Derfor er isolering og kvantifisering av synaptiske proteiner en nødvendig og nyttig teknikk for å få innsikt i de måter som nevronene reagerer på stimuli og endre synaptiske effekt 7. Denne artikkelen beskriver en vanlig teknikk for å isolere synaptiske proteiner fra gnagere hjernevev etter ultracentrifugation på diskontinuerlige sakkarosegradienter. Den synaptiske plasmamembran brøkdel kan bli beriket og isolert basert pådens tetthet på sukrose, som er empirisk bestemt til å være lik 1,2 M sukrose.

Avhengig av den biologiske spørsmålet kan subcellulære fraksjoner separeres ved kontinuerlige eller diskontinuerlige gradienter av enten sukrose eller Percoll. Kontinuerlige gradienter tillate separasjon av proteiner i flere fraksjoner; Dette kan være spesielt nyttig for å demonstrere den ko-lokalisering av proteinene i løpet av en gitt fraksjon 8. Imidlertid er fremstillingen av kontinuerlige graderinger mer arbeidskrevende og er ikke nødvendig for mange anvendelser. Diskontinuerlige gradienter er forholdsvis lettere å forberede og kan brukes til å separere proteiner i et par, generelt definerte fraksjoner. Diskontinuerlige gradienter som er sammensatt av tre lag av sucrose øker molaritet har blitt mye brukt for å isolere proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembranen (SPM). Dette synaptiske plasmamembran brøkdel kan behandles videre til den postsynaptiske tetthet fraction (PSD) av vaskemiddelbehandling og isolering av vaskemiddel-uløselige fraksjonen.

Når denne prosessen ble først beskrevet i 1960 9,10, ble elektronmikroskopi brukes til å demonstrere de organeller og membraner som grovt definerer den synaptiske plasmamembranen og post-synaptiske tetthet fraksjoner 9-14. Disse studiene viste inkludering av pre-og post-synaptiske membraner og synaptiske vesikler i SPM fraksjon; etter at vaskemiddelbehandling primært elektrontette, post-synaptiske tettheter var synlig. I fremgangsmåten, blir en hypotonisk sjokk som brukes til å klemme ut de synaptiske prosesser fra cellelegemet 10. Dette trinnet tar fordel av det faktum at mitokondriene er mer motstandsdyktig overfor osmotisk sjokk og forbli intakt, og slik at de sedimentere på bunnen av sukrose gradient (figur 1).

Ved hjelp av denne samme berikelse teknikk, var de SPM og PSD fraksjoner første biokjemiskdefinert ved polyakrylamidgel-elektroforese, og sekvensering av de store protein-komponenter 15-17. Deretter western blot-analyse ble brukt for å påvise og kvantifisere nivåene av synaptiske proteiner, og videre definere disse fraksjoner (figur 2). Vi har brukt denne teknikken i våre laboratorier for å kvantifisere endringer i de synaptiske nivåer av dopamin transporter som oppstår når Slc6a3 locus er duplisert i mus 18. Vi har også brukt denne teknikken i NMDA reseptor mangelfull mus å avdekke synapse spesifikke reduksjoner i proteiner som er en del av DISC1 interactome 19.

Det er tydelig fra western blot analyse at SPM fraksjoner inneholder synaptiske vesikkel membranproteiner, endosome markører, mitokondrie protein, membran assosiert syntetiske enzymer og signaltransduksjon molekyler, så vel som integrerte komponenter av den postsynaptiske tetthet og synaptiske plasmamembraner 20-23. Even PSD fraksjoner kan ha forurensning med rikelig mitokondrie protein, og det kan være nødvendig å utføre en andre gradient sedimentasjon eller flere rensetrinn for å fjerne dem 13. Nylig er kvantitative massespektrometri ga en liste over 100 proteinene i den postsynaptiske densitet alene, så vel som en indikasjon på den relative overflod av disse komponentene 24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Følgende protokoll er i samsvar med retningslinjene i den kanadiske Council of Animal Care og er godkjent av Det medisinske fakultet og Pharmacy Animal Care Utvalget ved Universitetet i Toronto.

1. Utarbeide nødvendig reagenser som beskrevet i Tabell 1.

  1. Legg protease og fosfatase (om nødvendig) inhibitorer for alle løsningene sukrose, buffere og DDH 2 O i konsentrasjoner som er skissert i Tabell 1. Viktig utføre alle trinnene ved 4 ° C og pre-kul alle reagenser og utstyr før starten av forsøket. Merke alle rør, inkludert ultrasentrifuge rør, med permanent tusj.

2. Disseksjon av Passende Brain Region

  1. Ofre dyret ved halshugging eller halshogging. Hus og avlive dyr i henhold til institusjonelle og statlige politikk på dyr omsorg.
  2. Raskt fjerne the hjerne fra skallen og sted på en kjølt disseksjon blokk.
  3. Dissekere den aktuelle hjernen regionen fra frisk vev og gå videre til trinn tre.

3. Tissue Homogenisering med motordrevet Glass-Teflon Homogenizer

  1. Plasser 50-100 mg (for SPM) eller 100-200 mg (for PSD) av det dissekerte vev i en merket 13 ml polypropylenrør inneholdende 4 ml av 0,32 M HEPES-bufret sukroseløsning. Overfør prøven til et 15 ml konisk glass-Teflon tissue grinder / homogenisator, sett motordriften til 900 rpm (innstilling 7) og homogenisere prøven med 12 slag i løpet av en 30 s periode. Bruk en annen glass-Teflon homogenisator mellom prøvene, eller skyll homogenisatoren med kaldt destillert vann mellom prøvene og tørk av med en Kimwipe. MERK: Opp til 4 g vev kan homogeniseres i 4 ml 0,32 M HEPES-bufret sukrose-løsning, men det er tilrådelig å bruke mindre vev for å sikre tilfredsstillende fraksjonering.
  2. Overfør homogenisert prøve tilbake to det samme 13 ml polypropylenrør. Reserve 100 pl homogenat og oppbevar ved -80 ° C for påfølgende kvantifisering protein og western blot-analyse av det totale proteinfraksjon.

4. Low Speed ​​Sentrifuge å fjerne Nuclear Fraction (Rentene supernatantmediet S1)

  1. Sentrifuger homogenatet i en rotor med fast vinkel ved 900 xg i 10 min ved 4 ° C. Overfør supernatanten (S1) til en ny, merket 13 ml rør og resuspender den nukleære fraksjonen pellet (P1) i 500 pl av 0,32 M HEPES-bufret sukrose. MERK: (P1) fraksjon kan lagres ved -80 ° C og brukt for western blot-analyse av den nukleære fraksjonen.

5. berikelse av Crude synaptosomale Fraction (Rentene Pellet P2)

  1. Sentrifuger supernatanten (S1) ved 10.000 xg i 15 min ved 4 ° C. Fjern supernatant (S2), og reserve 500 ul i et mikrosentrifugerør til å lagre ved -80 ° C for etterfølgende protein quantreduser fuktighet og western blot analyse av cytosolisk / lys membran brøkdel. Resuspender den gjenværende rå synaptosomal fraksjon pellet (P2) i 1 ml 0,32 M HEPES-bufret sukrose-løsning, og deretter legge til en annen 3 ml av 0,32 M HEPES-bufret sukroseløsning.
  2. Sentrifuger ved 10000 x g i 15 min ved 4 ° C. Fjern supernatant (S2 ') og reserve 500 ul i et mikrosentrifugerør til å lagre ved -80 ° C for påfølgende kvantifisering protein og western blot analyse av det cytosoliske / lys membranfraksjon. Lagre den vaskede rå synaptosomal pellet (P2 ') i polypropylenrør.

6. Lysing (Hypoosmotic Shock) av Crude synaptosomale Fraction

  1. Lyse det rå synaptosomal pellet (P2 ') i polypropylenrør ved å oppslemme den i 1 ml av DDH 2 O. Legg til en annen 3 ml DDH 2 O, overføring til et glass-Teflon vevshomogenisator, og homogen for hånd med tre slag. MERK: Det er viktigå utføre dette trinnet så raskt som mulig og raskt gå videre til trinn 6.2.
  2. Overfør prøver fra homogenisatoren tilbake til det samme 13 ml polypropylenrør og raskt justere prøven tilbake til 4 mM HEPES med 16 pl av 1 M HEPES-løsning, invertere for å blande.
  3. Roter prøver ved 4 ° C i 30 minutter for å sikre fullstendig lysering.

7. Anrikning av den synaptosomale membran Fraksjon (P3)

  1. Sentrifuger ved 25000 x g i 20 min ved 4 ° C. Fjern det urene vesikulær fraksjon supernatant (S3), og reservere det i et 5 ml rør for lagring ved -80 ° C for påfølgende kvantifisering protein og western blot analyse. Resuspender synaptosomalt membranfraksjonen (P3) i 1 ml 0,32 M HEPES-bufret sukroseløsning.

8. Fremstilling av den diskontinuerlige sukrosegradient

  1. Pipetter nøyaktig 3,5 ml av 1,2 M HEPES-bufret sukroseløsning og nøyaktig 3,0 ml hver av 1,0 M og 0,8 M HEPES-bufret sukroseløsning i separate 6 ml snap cap rør. MERK: Dette er gjort for å pre-måle volumet av de buffere som brukes for å gjøre sukrosegradient. Nøyaktig måling av volumene er viktig å sikre at den resulterende gradienter vil bli balansert for-ultrasentrifugering.
  2. Ved hjelp av en glass Pasteur pipette og pære, overføre 1,2 M HEPES-bufrede sukroseløsning til de 12 ml polyallomer ultrasentrifugerør. Lag forsiktig 1,0 M HEPES-bufret sukroseløsning på toppen av 1,2 M HEPES-bufret sukroseløsning. Til slutt, lag den 0,8 M HEPES-bufret sukroseløsning på toppen av 1,0 M HEPES-bufret sukroseløsning. Bruk en frisk Pasteur pipette for hver sukroseløsning og tar seg ikke å forstyrre sukrosegradient. Vibrasjoner fra en benk vortex eller mikro vil forstyrre integriteten til gradient.
  3. Ved hjelp av en Pasteur-pipette, lag den resuspenderte synaptosomalt membranfraksjon (P3) på toppen av den preparerte diskontinuerlig sukrose-gradient.Pass på at graderinger er balansert ved å veie dem inne i bøtte med svingende bøtte rotor. Hvis bøtter er ikke balansert, bruk en P200 pipette å nøye legge 0,32 M HEPES-bufret sukrose til toppen av gradient og balansere rotor bøtter.

9. Fraksjonering of Synaptic Plasma Membrane (SPM)

  1. Ultrasentrifuge i en svingende spannrotor ved 150,000 x g i 2 timer ved 4 ° C. Fjern forsiktig sakkarosegradienter fra ultrasentrifugerør bøtter. Ved å bruke en 18 G nål og en 1 ml sprøyte, punktering av røret ved bunnen av 1,0 M / 1,2 M HEPES-bufret sukroseløsning interfase og trekke den synaptiske plasmamembranlaget (SPM).
  2. Noter volumet at hver SPM prøve opptar i en ml sprøyte. Sett samlet SPM laget i 3,5 ml tykk-vegg ultrasentrifuge-rør, tilsett nøyaktig 2,5 volumer av 4 mM HEPES å justere sukrose konsentrasjon fra 1,2 M til 0,32 M. Når hver prøve har vært å justereed til 0,32 M sukrose, balansere rørene med 0,32 M HEPES-bufret sukroseløsning.
  3. Ultrasentrifuge i en rotor med fast vinkel ved 200.000 xg i 30 min ved 4 ° C. Fjern og kast supernatanten. Resuspender den synaptiske plasmamembranen pellet (SPM) i 300 ul 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-oppløsning. Oppbevar prøver ved -80 ° C til det brukes for western blotting.

10. Utarbeidelse av den postsynaptiske Density Fraction (PSD)

  1. Tine svevestøvsprøvene på is.
  2. Gjør en oppløsning av 0,54% Triton X-100 i 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-oppløsning.
  3. I en 5 ml polystyren-rør, kombinere 2,7 ml Triton X-100 / HEPES / EDTA-løsning og 300 pl SPM fraksjon og rotere prøven i 15 min ved 4 ° C.
  4. Overfør prøvene til 3,5 ml tykk vegg ultrasentrifugerør rør og sentrifuger prøvene ved 32 000 xg i 20 min ved 4 ° C.
  5. Forbeholder supernatanten (Triton X-100 løselige fraksjonen [TS]) og oppbevar ved -80, ° C. MERK: På dette stadiet, representerer pellets den "PSD-1T" brøk. En annen behandling med vaskemiddel vil produsere en "PSD-2T" brøk. Hvis en PSD-1T fraksjonen er ønsket, fortsett til trinn 10.6.
    1. For å produsere en PSD-2T-fraksjon, resuspender pelleten i 3 ml 0,5% Triton X-100 i 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-oppløsning. Roter prøvene i 15 min ved 4 ° C. Sentrifuger prøvene på 32.000 xg i 20 min ved 4 ° C og fortsett til trinn 10.6.
  6. Kast supernatanten og resuspender postsynaptiske (PSD) pelleten i 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-oppløsning. MERK: resuspensjon volumet kan avhenge av størrelsen av pelleten; et volum på 50-75 pl anbefales. Fordi PSD fraksjon er et vaskemiddel-uløselig fraksjon, er det ofte nødvendig å tilsette 1-2 ul av 0,5% SDS for å muliggjøre fullstendig resuspendering av protein. Oppbevar prøver ved -80 ° C til det brukes for western blotting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fremstillingen av sukrose tetthetsgradient bør resultere i en klar separering av de tre molare oppløsninger av sukrose (0,8, 1,0, og 1,2 M sukrose). Se figur 3A for et eksempel på gradienten før proteinprøve ble tilsatt. Hvis gradienten er forberedt for mye på forhånd, eller om det er forberedt på en benk overflate med vibrasjoner fra annet utstyr, vil gradient bli kompromittert og riktig separasjon vil ikke oppnås. Hvis et klart skille mellom de tre løsningene ikke er synlig, er det tilrådelig å gjøre en ny gradient før du legger proteinprøven. Se figur 3B for et eksempel på en sukrosegradient når proteinprøve ble tilsatt (sort pil).

Etter sentrifugering, bør det være klare band av proteinfraksjoner ved hver inter (0,32 / 0,8, 0,8 / 1,0, 1,0 / 1,2). I tillegg er en pellet bør være synlig ved bunnen av røret. Se Figur 3C for et eksempeli brøken band etter ultracentrifugation. Hvis fraksjoner er bare diffust tilstede på inter, er det sannsynlig at graderingen ble kompromittert og videre behandling anbefales ikke.

Western blotting av de samlede, SPM og PSD1T proteinprøver fra mus striatum er vist i figur 2. Anriking av synaptiske proteiner som GluR1, PSD95, og CaMKII, kan visualiseres ved å laste inn en konstant mengde av protein (10 pg) fra total, SPM og PSD fraksjoner. Perisynaptic proteiner som dopamin transporter (DAT) er anriket i SPM brøkdel, men er eliminert i senere vaskemiddel trinnene i PSD berikelse prosessen.

For å sikre tilsvarende lasting, kan proteinnivåer bli visualisert på den vestlige blot membran ved farging med Ponceau Red 26. Antistoff-basert "loading kontroller" blir ofte rapportert i litteraturen, men dette kan være en misvisende benevnelse fordi synaptiske proteiner kan være differentially regulert i eksperimentelle behandlingsgruppene. Hvis et antistoff-basert "loading kontroll" er ønsket, er det lurt å først finne tilsvarende protein lasting av Ponceau flekker, og deretter teste flere referanse proteiner for å identifisere de som ikke endres i de ulike forsøksgrupper.

Figur 1
Figur 1. Arbeidsflyt av subcellulære fraksjone å berike SPM og PSD proteinfraksjoner.

Figur 2
Figur 2. Representant western blot av total, SPM, og PSD1T protein fra mus striatum. 10 mikrogram av proteinekstrakt ble løst på SDS-denaturering, 10% akrylamid-geler, og overført til PVDF-membraner. Deretter disse blotter ble inkubert med primære antistoffer for αCaMKII, GluR1, PSD-93, og PSD-95, som er alle komponenter av den postsynaptiske tetthet. Følgelig er disse proteinene anriket i SPM og PSD fraksjoner. Alternativt blots ble inkubert med et primært antistoff til DAT, som ligger i presynaptiske membraner i striatum. Mens DAT er anriket på SPM-fraksjon, er det ikke en del av PSD-komplekset, og immunoreaktivitet er ikke observert i PSD-fraksjonen. Antistoffer mot aktin eller natrium / kalium-ATPase (Na / K pumpe) kan brukes som lastende kontroller, selv om noen forsøksbetingelsene kan påvirke nivåene av disse proteiner i tillegg, og slik at den aktuelle lastkontrollen, må bestemmes empirisk.

Figur 3
Figur 3. Representative eksempler på sukrose-gradient før og etter ultrasentrifugering. A. Etter graderingen er forberedt, bør det være tre faser som er synlige når røret holdes opp mot lyset. De hvite piler indikerer den interfase mellom 0,8 / 1,0 M sukrose-løsninger og 1,0 / 1,2 M sukrose-løsninger B.. Når prøven er lastet på toppen av gradienten, er det i en 0,32 M sukroseoppløsning og vil hvile på toppen av 0,8 M sukrose sjikt. C. Etter sentrifugering blir homogenatet skilles i flere fraksjoner. Fraksjonen flytende på inter på 0,8 / 1,0 M sukrose løsninger vil bli beriket i myelin membraner. Fraksjonen ved interfase på 1,0 / 1,2 M sukrose-løsninger representerer SPM-fraksjonen som er oppsamlet med en nål og sprøyte. Den pellet på bunnen av røret er anriket for mitokondrielle proteiner.

Solusjoner HEPES-bufret sukrose Proteasehemmere * fosfatase hemmere
1 M HEPES pH 7.4 0,32 M sukrose i 4 mM HEPES (pH 7,4) 0,25 mm PMSF (stock 250 mm i etanol, 1,000x) 10 mM natriumfluorid (stock 500 mm, 50x)
4 mM HEPES pH 7.4 0,8 M sukrose i 4 mM HEPES (pH 7,4) 1,5 mikrogram / ml Aprotinin (stock 1,5 mg / ml, 1,000x) 2,5 mM Sodium Pyrofosfat (stock 250 mm, 100x)
DDH 2 O 1,0 M sukrose i 4 mM HEPES (pH 7,4) 10 mikrogram / ml Leupeptin (lager 10 mg / ml, 1,000x) 1.0 mM b-glycerophosphate (stock 200 mm, 200x)
50 mM HEPES (pH 7,4), 2 mM EDTA 1.2 M sukrose i 4 mM HEPES (pH 7,4) 0,1 mg / ml Benzamidine (stock 100 mg / ml, 1,000x) 5.0mM Sodium orthovanadate (stock 500 mm, 100x)
10 ug / ml Pepstatin (lager 5 mg / ml i etanol, 500x)

Tabell 1. Nødvendige reagenser

ight: 43px; "> PSD-2T
Fraksjon Protein fraksjon Protein markør
P1 kjernekraft histon H1 27
S1 cytosol / membraner calnexin 28 (endoplasmatiske retikulum), a-tubulin 29 (cytoskjelettet), GAPDH 30 (cytosol), 58K Golgi proprotein 31 (Golgi apparatur)
P2 og P2 ' råolje synaptosomer AMPA og NMDA reseptor subenheter 32
S2 og S2 ' cytosol / lys membraner nNOS1 29 (cytosol), GAPDH (cytosol), lamp1 33 (lysosome), PEX14 34 (peroxisome)
P3 synaptosom / mitokondrier VDAC 35 (mitokondrier), AMPA og NMDA reseptor subenheter (synaptosom)
S3 synaptisk vesikkel SV2 8, synaptophysin 8
0.8 M / 1,0 M m Yelin myelin basisk protein 36
1,0 M / 1,2 M SPM AMPA-og NMDA-reseptor-subenheter, presynaptisk markør (SNAP25 8), neurexin 32, 32 neuroligin
1.2 MP mitokondrier VDAC 35
PSD (1T) PSD PSD93 32, PSD95 32, AMPA og NMDA reseptor subenheter, neuroligin, PICK1 32, CaMKII 32
TS presynaptiske membraner SNAP25, Munc18 37, fagott 38, neurexin
beriket PSD PSD95, AMPA og NMDA reseptor subenheter, PICK1, CaMKII

Tabell 2. Liste over protein markører for å skille subcellulære fraksjoner

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det er flere trinn i prosedyren som er kritiske for et vellykket resultat. I trinn 3, er det viktig at en ensartet grad av homogenisering er oppnådd for hver prøve. Når homogenisere vevet med motordrevet homogenisator, blir en konstant hastighet brukes ikke bare for rotasjon av stampe, men også med det antall slag. Inkubasjonstiden løpet av osmotisk sjokk bør være nøyaktig, siden utvidet homogenisering eller inkubering i hypoton løsning vil lyserer mitokondrier og forurense SPM prøven.

Et annet kritisk punkt er ved fremstilling av reagenser, spesielt sukrose-løsninger; hvis molaritet av sukrose-løsning er feil prosedyren ikke vil fungere. Derfor bør sukrose-løsninger fremstilles ved å veie sukrose, oppløsning i 4 mM HEPES-løsning og deretter tilsette 4 mM HEPES til den nøyaktige sluttvolum. Feilsøking tips: bygge en test gradient med oppkjørte sukrose løsninger til ensikker på at graderingen er riktig montert. Legg varierende konsentrasjoner av bromfenolblå (for eksempel sluttkonsentrasjon på 0,005% -0,02% w / v) i to av de tre sukrose-løsninger for å bistå i visualisering av tre forskjellige lag.

Det er viktig å begrense mengden av tiden mellom når gradienten er montert og når rørene sentrifugert. Normal diffusjon vil ødelegge gradient over tid, og dette er akselerert hvis det er vibrasjon på benken der gradienten er lagret. Pre-pipettering av løsninger i individuelle porsjoner muliggjør presise volumer som skal pipetteres med et glass Pasteur pipette. Dette reduserer også tiden mellom gradient ultrasentrifugering og montering. Problemløsning spissen: å bygge en "test gradient" med bromfenol blått fargestoff som beskrevet ovenfor på samme tid som de sakkarosegradienter for eksperimentet. Integriteten av gradienten kan således overvåkes over tid. Testen gradient vil tjene som enindikator for diffusjon hvis gradienter er montert for langt på forhånd eller er utsatt for vibrasjon.

Endelig er det viktig å samle opp SPM prøven i et så lite volum som mulig, siden det er nødvendig å etterfølgende fortynne prøven med 2,5 volumdeler vann. Ideelt prøven skal samles i et volum på 0,4-0,7 ml ved hjelp av en 1 cc sprøyte. Det anbefales å bygge de diskontinuerlige gradienter under finalen 20 min spinn i trinn 7 for å begrense tiden mellom gradient montering og ultrasentrifugering.

Protokollen omfatter anbefaling om å reservere alle de forskjellige fraksjoner, og disse lagre ved -80 ° C for etterfølgende analyse. Vi har vist at anrikning av post-synaptiske proteiner i figur 2 i bare noen få av disse fraksjonene. Imidlertid er det tilrådelig å måle nivåene av et protein-av-interesse i hver av fraksjonene for å forstå dens fordeling. Sammenligning av distribution av et protein i fraksjoner med andre subcellulære markørproteiner vil også bidra til å bekrefte at de eksperimentelle betingelser har oppnådd den ønskede fraksjonering. Tabell 2 oppsummerer vanlig brukte proteinmarkører som kan brukes som indikatorer for stadier av fraksjone 8,27- 38.

Utnyttelse av diskontinuerlige sukrosegradient er mye brukt til å berike synaptiske plasmamembraner. Denne metoden har den fordelen over kontinuerlige Percoll gradienter i at diskontinuerlige sakkarosegradienter er lettere å lage og ikke krever spesialisert utstyr. Imidlertid kan denne metoden ikke være tilstrekkelig til å lokalisere nøyaktig et protein av interesse, og for disse anvendelser en Percoll-gradient kan være foretrukket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M HEPES, pH 7.4 BioShop HEP003.100
HEPES BioShop HEP001.500 
Sucrose  BioShop SUC507.1
EDTA BioBasic EB0185
PMSF BioShop PMS123.5
Aprotinin BioShop APR600.1
Leupeptin BioShop LEU001.1
Pepstatin BioShop PEP605.5
Benzamidine BioShop BEN601.25
Sodium fluoride BioShop SFL001.100
Sodium pyrophosphate BioShop SPP310.100
Sodium orthovanadate BioShop SOV664.10
β-glycerophosphate BioShop GYP001.10
Triton X-100 BioShop TRX506.500
18 G x 1 ½” needle BD 305196
1 cc syringe BD 309659
Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 VWR KT885450-0023
IKA Model RW 16 basic stirrer IKA Works 2572100
Sorvall SM-24 fixed angle rotor ThermoScientific 29017
Sorvall RC 6 Plus centrifuge ThermoScientific 46910
Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml) Beckman Coulter 331372
SW 41 Ti rotor swinging bucket Beckman Coulter 331362
Beckman L-80 floor ultracentrifuge Beckman Coulter
Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml) Beckman Coulter 349622
TLA-100.3 fixed angle rotor Beckman Coulter 349481
Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
  2. Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
  3. Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
  4. Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
  5. Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
  6. Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
  7. Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
  8. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  9. Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
  10. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
  11. Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
  12. Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
  13. Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
  14. Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
  15. Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density protein" is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
  16. Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
  17. Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
  18. Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
  19. Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
  20. Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
  21. Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
  22. Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
  23. Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
  24. Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
  25. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  26. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a Laboratory Manual. 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  27. Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
  28. Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
  29. Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
  30. Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
  31. Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
  32. Neff, R. A. 3rd, Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
  33. Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
  34. Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
  35. Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
  36. Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
  37. Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
  38. Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).
Utarbeidelse av Synaptic Plasma Membran og postsynaptiske Density Proteiner Ved hjelp av en Discontinuous sukrosegradient
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. J. Vis. Exp. (91), e51896, doi:10.3791/51896 (2014).More

Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. J. Vis. Exp. (91), e51896, doi:10.3791/51896 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter