Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Beredning av Synaptic plasmamembranet och Postsynaptiska Density Proteiner hjälp av en kontinuerliga sukrosgradient

doi: 10.3791/51896 Published: September 3, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Den här artikeln detaljer anrikningen av proteinerna som är associerade med synaptiska plasmamembran genom ultracentrifugering på en diskontinuerlig sackarosgradient. Den efterföljande beredningen av postsynaptiska densitet proteiner beskrivs också. Protein preparat är lämpliga för western blotting eller 2D Dige analys.

Abstract

Neuronala subcellulära fraktioneringstekniker tillåter kvantifiering av proteiner som trafikerade till och från synapsen. Som ursprungligen beskrivits i det sena 1960-talet, kan proteiner som är associerade med synaptiska plasmamembran isoleras genom ultracentrifugering på en sackarosdensitetsgradient. När synaptiska membran är isolerade, kan den makromolekylära komplex kallas postsynaptiska densitet därefter isoleras på grund av dess tvättmedel olöslighet. De tekniker som används för att isolera synaptiska plasmamembran och postsynaptiska densitet proteiner är i princip desamma efter 40 år, och används ofta i aktuell neurovetenskaplig forskning. Den här artikeln detaljer fraktionering av proteiner som är associerade med synaptiska plasmamembranet och postsynaptiska densitet med hjälp av en diskontinuerlig sackarosgradient. Resulteproteinpreparat är lämpliga för western blotting eller 2D Dige analys.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nervceller kommunicerar genom synapser, och kvaliteten på detta meddelande regleras till stor del av förändringar i sammansättningen av proteiner i synapsen. Särskilt proteinerna ligger i den postsynaptiska densitet deltar i neuronal kommunikation genom intim byggnadsställningar neurotransmittorreceptorer med deras signalöverföringssystem 1. Dessutom är bestående förändringar i styrkan i synaptiska effekten regleras genom tillsats eller borttagande av receptorer på postsynaptiska densitet 1-6. Därför är isolering och kvantifiering av synaptiska proteiner en nödvändig och användbar teknik för att få insikt i de sätt som nervceller reagerar på stimuli och förändra synaptisk effekt 7. Den här artikeln beskriver en vanlig teknik för att isolera synaptiska proteiner från gnagare hjärnvävnad genom ultracentrifugering på diskontinuerliga sackarosgradienter. Den synaptiska plasmamembranfraktionen kan berikas och isolerade utifråndess densitet i sackaros, som har empiriskt bestämts att vara liknande 1,2 M sackaros.

Beroende på den biologiska frågan, kan subcellulära fraktioner separeras genom kontinuerliga eller diskontinuerliga gradienter av antingen sackaros eller Percoll. Kontinuerliga gradienter möjliggöra separation av proteiner i flera fraktioner; detta kan vara särskilt användbara för att påvisa sam-lokalisering av proteiner inom en given fraktion 8. Emellertid är framställningen av kontinuerliga gradienter mer arbetskrävande och är onödigt för många tillämpningar. Diskontinuerliga gradienter är jämförelsevis enklare att framställa och kan användas för att separera proteiner i ett fåtal, vanligen definierade fraktioner. Diskontinuerliga gradienter som är sammansatta av tre sackaros-skikt av ökande molaritet har ofta använts för att isolera proteiner som är associerade med synaptiska plasmamembran (SPM). Denna synaptiska plasmamembran fraktionen kan bearbetas vidare till den postsynaptiska densitet FRACTIOn (PSD) av detergent behandling och isolering av den detergent-olösliga fraktionen.

När denna process beskrevs först på 1960-talet 9,10, var elektronmikroskopi som används för att demonstrera organeller och membran som grovt definierar synaptiska plasmamembranet och post-synaptiska densitet fraktionerna 9-14. Dessa studier visade att inkludera pre-och postsynaptiska membran och synaptiska vesiklar i SPM fraktion; efter detergentbehandling främst elektron-täta, postsynaptiska tätheter var synliga. I förfarandet används en hypotonisk chock används för att nypa av de synaptiska processerna från cellkroppen 10. Detta steg tar fördel av det faktum att mitokondrierna är mer resistenta mot osmotisk chock och förbli intakt, och så att de sedimenterar vid botten av den sackaros gradient (figur 1).

Genom att använda samma anrikningsteknik, var SPM och PSD fraktioner först biokemisktdefinieras genom polyakrylamidgelelektrofores och sekvensering av de större proteinkomponenter 15-17. Därefter western blot-analys har använts för att detektera och kvantifiera halterna av synaptiska proteiner och ytterligare definiera dessa fraktioner (Figur 2). Vi har använt denna teknik i våra laboratorier för att kvantifiera förändringar i de synaptiska nivåerna av dopamintransportören som inträffar när Slc6a3 lokuset dupliceras i möss 18. Vi har också använt denna teknik i NMDA-receptorfattiga möss för att avslöja synaps specifika minskningar av proteiner som är en del av DISC1 interactome 19.

Det framgår av western blot-analys som SPM fraktioner innehåller synaptiska vesikler membranproteiner, endosom markörer, mitokondriella proteiner, membranassocierade syntetiska enzymer och signaltransduktionsmolekyler samt integrerade delar av den postsynaptiska densitet och synaptiska plasmamembran 20-23. ÖVen PSD fraktioner kan ha kontaminering med rikliga mitokondriella proteiner och det kan vara nödvändigt att utföra en andra gradient sedimentation eller ytterligare reningssteg för att avlägsna dem 13. Nyligen har kvantitativ masspektrometri lämnat en lista med över 100 proteiner i postsynaptiska densitet ensam, samt en indikation på den relativa förekomsten av dessa komponenter 24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Följande protokoll överensstämmer med riktlinjerna i den kanadensiska Rådets Animal Care och har godkänts av fakulteten för medicin och farmaci Animal Care kommittén vid University of Toronto.

1 Förbered Obligatorisk reagenser som beskrivs i tabell 1

  1. Lägg proteas och fosfatas (om nödvändigt) inhibitorer till samtliga sackaroslösningar, buffertar och DDH 2 O vid koncentrationer som anges i tabell 1. VIKTIGT: Utför alla stegen vid 4 ° C och pre-cool alla reagenser och utrustning före starten av experimentet. Märk alla rör, inklusive ultracentrifugrör, med märkpenna.

2 Dissektion av lämplig Brain Regionen

  1. Offra djuret genom halsdislokation eller halshuggning. Hus och avliva djur i enlighet med institutionella och statliga politiken för djurvård.
  2. Snabbt avlägsnande the hjärnan från skallen och placera på en kyld dissektion block.
  3. Dissekera lämplig hjärnregionen från färsk vävnad och gå vidare till steg 3.

3 Tissue Homogenisering med Motor Driven Glass-Teflon Homogenizer

  1. Placera 50-100 mg (för SPM), eller 100-200 mg (för PSD) av dissekerade vävnad i en märkt 13 ml polypropylen rör innehållande 4 ml 0,32 M HEPES-buffrad sackaros lösning. Överför provet till ett 15 ml konisk glas Teflon vävnadskvarn / homogenisator, ställ in motordriften till 900 rpm (inställning 7) och homogenisera provet med 12 slag under en 30 sek period. Använd en annan glas-Teflon homogenisator mellan prover, eller skölj homogeniseringsanordningen med kallt destillerat vatten mellan prover och torka torrt med en Kimwipe. OBS: Upp till 4 g vävnad kan homogeniseras i 4 ml 0,32 M HEPES-buffrad sackaros lösning, men det är lämpligt att använda mindre vävnad för att säkerställa korrekt fraktionering.
  2. Transfer tillbaka homogeniserade provet to samma 13 ml polypropylenrör. Reserv 100 | il homogenat och förvara vid -80 ° C för efterföljande protein kvantifiering och western blot-analys av den totala proteinfraktionen.

4 låghastighetscentrifugering att ta bort Nuclear Fraktion (Utbyten Supernatant S1)

  1. Centrifugera homogenatet i en fixerad vinkelrotor vid 900 xg under 10 min vid 4 ° C. Överför supernatanten (S1) till ett nytt, märkt 13 ml rör och återsuspendera den nukleära fraktionen pelleten (P1) i 500 ul av 0,32 M HEPES-buffrad sackaros. ANMÄRKNING: (P1) fraktionen kan lagras vid -80 ° C och användes för western blot-analys av den nukleära fraktionen.

5. berikning av rå Synaptosomal Fraktion (Utbyten Pellet P2)

  1. Centrifugera supernatanten (S1) vid 10.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten (S2) och reserv 500 | il i ett mikrocentrifugrör att lagra vid -80 ° C för efterföljande proteinkvantumläggande och western blot-analys av det cytosoliska / ljus membranfraktion. Resuspendera den återstående råa synaptosomala fraktionen pellet (P2) i 1 ml av 0,32 M HEPES-buffrad sackaros-lösning och tillsätt sedan ytterligare 3 ml 0,32 M HEPES-buffrad sackaros-lösning.
  2. Centrifugera vid 10.000 x g under 15 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten (S2 ') och kassa 500 | il i ett mikrocentrifugrör att lagra vid -80 ° C för efterföljande protein kvantifiering och western blot-analys av det cytosoliska / ljus membranfraktion. Spara den tvättade råa synaptosomala pelleten (P2) i polypropylen röret.

6. Lysing (hypoosmotisk Shock) av rå Synaptosomal Fraktion

  1. Lyse den råa synaptosomala pelleten (P2) i polypropylen röret genom återsuspendering den i 1 ml DDH 2 O. Lägg till ytterligare 3 ml DDH 2 O, överförs till ett glas-Teflon vävnadshomogenisator, och homogenisera för hand med 3 slag. OBS: Det är viktigtGör detta så snabbt som möjligt och snabbt vidare till steg 6.2.
  2. Överför proverna från homogenisatorn tillbaka in i samma 13 ml polypropylenrör och snabbt justera provet tillbaka till 4 mM HEPES med 16 pl av 1 M HEPES-lösning, invertera att blanda.
  3. Rotera prover vid 4 ° C under 30 min för att säkerställa fullständig lyse.

7 Berikning av Synaptosomal membranfraktionen (P3)

  1. Centrifugera vid 25.000 x g under 20 min vid 4 ° C. Ta bort den råa vesikulär fraktion supernatant (S3) och reservera det i ett 5 ml rör för att lagra vid -80 ° C för efterföljande protein kvantifiering och western blot-analys. Resuspendera synaptosomal membranfraktion (P3) i 1 ml av 0,32 M HEPES-buffrad sackaros-lösning.

8. Beredning av Diskontinuerlig sackarosgradient

  1. Pipettera exakt 3,5 ml av 1,2 M HEPES-buffrad sackaros-lösning och exakt 3,0 ml vardera av 1,0 M och 0,8 M HEPES-buffrad sackaros-lösning i separata 6 ml snap cap rör. OBS: Detta görs för att för-mäta volymerna av de buffertar som används för att göra sukrosgradienten. Exakt mätning av volymerna är viktigt att se till att de resulterande lutningar kommer att balanseras för ultracentrifugering.
  2. Med hjälp av en glas Pasteur pipett och glödlampa, överföra 1,2 M HEPES-buffrad sackaros lösning på 12 ml polyallomer ultracentrifugrör. Skikt försiktigt 1,0 M HEPES-buffrad sackaros-lösning ovanpå 1,2 M HEPES-buffrad sackaros-lösning. Slutligen lagra den 0,8 M HEPES-buffrad sackaros-lösning ovanpå 1,0 M HEPES-buffrad sackaros-lösning. Använd en ny Pasteur pipett för varje sackaros lösning och se till att inte störa sackarosgradienten. Vibrationer från en bänk virvel eller mikro stör integritet gradienten.
  3. Med användning av en Pasteur-pipett, lagra den återsuspenderades synaptosomal membranfraktion (P3) på toppen av den förberedda diskontinuerlig sackarosgradient.Se till att lutningar balanseras genom att väga dem i hinken av svängrotor. Om skoporna inte är balanserade, använd en P200 pipett för att försiktigt 0,32 M HEPES-buffrad sackaros till toppen av gradienten och balansera rotor hinkar.

9. Fraktione av Synaptic plasmamembran (SPM)

  1. Ultracentrifugera i en svängrotor vid 150.000 xg under 2 h vid 4 ° C. Ta försiktigt bort sackarosgradienter från ultracentrifugen hinkar. Med användning av en 18 G nål och en 1 ml spruta, punktera röret vid botten på 1,0 M / 1,2 M HEPES-buffrad sackaros-lösning interfas och dra tillbaka den synaptiska plasmamembranskiktet (SPM).
  2. Anteckna volymen att varje SPM prov upptar i 1 ml sprutan. Placera den insamlade SPM skiktet i 3,5 ml tjocka väggar ultracentrifugrör, lägger exakt 2,5 volymer 4 mM HEPES att justera sackaroskoncentrationen från 1,2 M till 0,32 M. När varje prov har varit justeraed till 0,32 M sackaros, balansera rören med 0,32 M HEPES-buffrad sackaros lösning.
  3. Ultracentrifugera i en fixerad vinkelrotor vid 200.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C. Avlägsna och kassera supernatanten. Resuspendera den synaptiska plasmamembran pellet (SPM) i 300 ul av 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-lösning. Förvara proverna vid -80 ° C tills de användes för western blotting.

10 Beredning av de postsynaptiska Density Fraktion (PSD)

  1. Tina SPM prover på is.
  2. Gör en lösning av 0,54% Triton X-100 i 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-lösning.
  3. I en 5 ml polystyrenrör, kombinera 2,7 ml Triton X-100 / HEPES / EDTA-lösning och 300 ^ il SPM fraktion och rotera provet under 15 min vid 4 ° C
  4. Överför prover till 3,5 ml tjocka vägg ultracentrifugrör och centrifugera proverna vid 32.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C.
  5. Boka supernatanten (Triton X-100 löslig fraktion [TS]) och förvara vid -80, ° C. OBS: I detta skede utgör pelleten på "PSD-1T" fraktionen. En andra behandling med rengöringsmedel kommer att producera en "PSD-2T" fraktionen. Om en PSD-1T fraktion önskas, gå vidare till steg 10,6.
    1. För framställning av en PSD-2T fraktion, resuspendera pelleten i 3 ml 0,5% Triton X-100 i 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-lösning. Rotera prover för 15 min vid 4 ° C. Centrifugera proverna vid 32.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C och gå vidare till steg 10,6.
  6. Kasta bort supernatanten och återsuspendera den postsynaptiska (PSD) pelleten i 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-lösning. OBS: resuspension volymen kan bero på storleken av pelleten; en volym av 50-75 pl rekommenderas. Eftersom PSD fraktion är en detergent-olösliga fraktionen, är det ofta nödvändigt att tillsätta 1-2 pl av 0,5% SDS för att möjliggöra fullständig resuspension av proteinet. Förvara proverna vid -80 ° C tills de användes för western blotting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Beredningen av sackarosdensitetsgradient bör leda till en tydlig åtskillnad mellan de tre molära lösningar av sackaros (0,8, 1,0 och 1,2 M sackaros). Se Figur 3A för ett exempel på gradienten innan proteinprovet tillsättes. Om gradienten är beredd för mycket i förväg, eller om den är beredd på en bänk yta med vibrationer från annan utrustning, kommer gradienten äventyras och åtskillnad kommer inte att uppnås. Om en klar åtskillnad mellan de tre lösningarna inte syns, är det lämpligt att göra en ny gradient innan du lägger proteinprovet. Se figur 3B för ett exempel på sackarosgradient när proteinprovet sättes (svart pil).

Efter centrifugering, bör det finnas tydliga band av proteinfraktioner vid varje inter (0,32 / 0,8, 0,8 / 1,0, 1,0 / 1,2). Förutom en pellet skall vara synliga på botten av röret. Se Figur 3C för ett exempelav andelbanden efter ultracentrifugering. Om fraktioner är bara diffust närvarande vid inter, är det troligt att gradienten äventyras och vidare bearbetning rekommenderas inte.

Western blotting av totala, SPM och PSD1T proteinprover från mus striatum demonstreras i figur 2. Berikning av synaptiska proteiner som GluR1, PSD95 och CaMKII, kan visualiseras genom att ladda en konstant mängd av protein (10 | ig) från totalt, SPM och PSD fraktioner. Perisynaptic proteiner som dopamintransportören (DAT) anrikas i SPM fraktionen, men elimineras i efterföljande tvättmedels steg i PSD anrikningsprocessen.

För att garantera likvärdig belastning, kan proteinnivåer visualiseras på den västra blot membranet genom färgning med Ponceau Red 26. Antikropp-baserade "hackkontroller" är ofta rapporterats i litteraturen, men detta kan vara en felaktig benämning, eftersom synaptiska proteiner kan vara differentially regleras i experimentella behandlingsgrupper. Om en antikroppsbaserad "laststyrning" önskas, är det lämpligt att först bestämma ekvivalent protein lastning av Ponceau färgning, och sedan testa flera referens proteiner för att identifiera de som inte förändras i de olika försöksgrupperna.

Figur 1
Figur 1 Arbetsflöde för subcellulär fraktione att berika SPM och PSD proteinfraktioner.

Figur 2
Figur 2 Representant western blot av totalt, SPM och PSD1T protein från mus striatum. 10 pg av proteinextrakt upplöstes på SDS-denaturering, 10% akrylamid-geler och överfördes till PVDF-membran. Därefter dessa blottar inkuberades med primära antikroppar för αCaMKII, GluR1, PSD-93, och PSD-95, som är alla komponenter i postsynaptiska densitet. Följaktligen är dessa proteiner anrikas i SPM och PSD fraktioner. Alternativt var blottar inkuberades med en primär antikropp för DAT, som ligger i presynaptiska membraner i striatum. Medan DAT anrikas i SPM fraktionen, det är inte en del av PSD komplex och immunreaktivitet observeras inte i PSD fraktionen. Antikroppar mot aktin eller natrium / kalium ATPas (Na / K pumpen) kan användas som lastkontroller, även om vissa experimentella betingelser kan påverka nivåerna av dessa proteiner också och så en lämplig laddningskontroll måste bestämmas empiriskt.

Figur 3
Figur 3. Representativa exempel på sackarosgradient före och efter ultracentrifugering. A. Efter gradienten är beredd, bör det finnas tre faser som syns när röret hålls upp mot ljuset. De vita pilar indikerar interfas mellan 0,8 / 1,0 M sackaroslösningar och 1,0 / 1,2 M sackaroslösningar. B. När provet laddas på toppen av gradienten, det är i en 0,32 M sackaroslösning och kommer att vila på toppen av 0,8 M sackaros lagret. C. Efter centrifugering, kommer homogenatet separeras i flera fraktioner. Den fraktion som flyter på inter på 0,8 / 1,0 M sackaroslösningar kommer att anrikas i myelinmembran. Fraktionen vid interfas av 1,0 / 1,2 M sackaroslösningar representerar SPM fraktion som samlas in med en nål och spruta. Den pellet på botten av röret är anrikad för mitokondriella proteiner.

Solutioner HEPES-buffrad sackaros Proteashämmare * fosfatas-inhibitorer
1 M HEPES pH 7,4 0,32 M sackaros i 4 mM HEPES (pH 7,4) 0,25 mM PMSF (lager 250 mM i etanol, 1,000x) 10 mM natriumfluorid (lager 500 mM, 50x)
4 mM HEPES pH 7,4 0,8 M sackaros i 4 mM HEPES (pH 7,4) 1,5 ^ g / ml Aprotinin (lager 1,5 mg / ml, 1,000x) 2,5 mM natriumpyrofosfat (lager 250 mM, 100x)
DDH 2 O 1,0 M sackaros i 4 mM HEPES (pH 7,4) 10 | ig / ml leupeptin (lager 10 mg / ml, 1,000x) 1,0 mM b-glycerofosfat (lager 200 mM, 200x)
50 mM HEPES (pH 7,4) 2 mM EDTA 1,2 M sackaros i 4 mM HEPES (pH 7,4) 0,1 mg / ml bensamidin (lager 100 mg / ml, 1,000x) 5,0mM natriumortovanadat (lager 500 mM, 100x)
10 | ig / ml pepstatin (lager 5 mg / ml i etanol, 500x)

Tabell 1. Nödvändiga Reagens

ight: 43px; "> PSD-2T
Fraktion Proteinfraktion Protein markör
P1 nukleär histon H1 27
S1 cytosol / membran kalnexin 28 (endoplasmatiska nätverket), a-tubulin 29 (cytoskelettet), GAPDH 30 (cytosolen), 58K golgi proTein 31 (Golgi-apparaten)
P2 och P2 ' råa synaptosomer AMPA och NMDA-receptorunderenheterna 32
S2 och S2 ' cytosol / lätta membran nNOS1 29 (cytosol), GAPDH (cytosol), LAMP1 33 (lysosom), PEX14 34 (peroxisom)
P3 synaptosom / mitokondrier VDAC 35 (mitokondrier), AMPA och NMDA-receptor subenheter (synaptosom)
S3 synaptisk vesikel SV2 8, synaptophysin 8
0,8 M / 1,0 M m Yelin basiskt myelinprotein 36
1,0 M / 1,2 M SPM AMPA och NMDA-receptorunderenheter, presynaptiska markör (SNAP25 8), neurexin 32, neuroligin 32
1,2 MP mitokondrier VDAC 35
PSD (1T) PSD PSD93 32, PSD95 32, AMPA och NMDA-receptorsubenheter, neuroligin, PICK1 32, CaMKII 32
TS presynaptiska membraner SNAP25, Munc18 37, fagott 38, neurexin
anrikat PSD PSD95, AMPA och NMDA-receptorsubenheter, PICK1, CaMKII

Tabell 2 Förteckning över proteinmarkörer för att skilja subcellulära fraktioner

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det finns flera steg i förfarandet som är kritiska för ett framgångsrikt resultat. I steg 3 är det viktigt att en konsekvent grad av homogenisering uppnås för varje prov. Vid homogenisering vävnad med motordriven homogenisator, är en konstant hastighet används inte bara för rotation av mortelstöten, men också med antal slag. Inkubationstiden under osmotisk chock bör vara exakt, eftersom förlängd homogenisering eller inkubation i hypoton lösning kommer att lysera mitokondrier och förorena SPM provet.

Ett annat viktigt steg är i beredningen av reagens, särskilt sackaroslösningar; Om molaritet sackaroslösningen är felaktig förfarandet inte kommer att fungera. Därför bör sackaroslösningar beredas genom vägning sackaros, upplösning i 4 mM HEPES-lösning sedan tillsätta 4 mM HEPES till den exakta slutvolymen. Felsökningstips: bygga en test gradient med de förberedda sackaroslösningar till enSe till att lutningen är korrekt monterad. Lägg varierande koncentrationer av bromfenolblått (t.ex. slutlig koncentration av 0,005% -0,02% vikt / volym) till två av de tre sackaros-lösningar för att bistå vid visualiseringen av tre distinkta skikt.

Det är viktigt att begränsa mängden tid mellan när gradienten är hopsatt och när rören centrifugeras. Normal diffusion förstör gradienten över tiden, och det är snabbare om det finns vibrationer på bänken där gradienten är lagrad. Förhands pipettering av lösningar i enskilda portioner tillåter precisa volymer som ska pipetteras med ett glas Pasteur pipett. Detta minskar också tiden mellan gradienten montering och ultracentrifugering. Felsökning tips: bygga en "test gradient" med bromfenolblått färgämne såsom beskrivits ovan på samma gång som de sackarosgradienter för experimentet. Integriteten av gradienten kan således följas över tid. Test gradienten kommer att fungera som enindikator på diffusion om gradienter är monterade för långt i förväg eller utsätts för vibrationer.

Slutligen är det viktigt att samla SPM provet i en så liten volym som möjligt, eftersom det är nödvändigt att därefter späda provet med 2,5 volymer vatten. Helst provet bör samlas i en volym av 0,4 till 0,7 ml med en 1 cc spruta. Det är lämpligt att bygga de diskontinuerliga gradienter under den sista 20 min spinn i steg 7 för att begränsa tiden mellan lutning montering och ultracentrifugering.

Protokollet innehåller rekommendationen att reservera alla de olika fraktionerna och lagra dem vid -80 ° C för efterföljande analys. Vi har visat att anrikningen av postsynaptiska proteiner i Figur 2 i endast ett fåtal av dessa fraktioner. Emellertid är det tillrådligt att mäta nivån av ett protein av intresse i var och en av fraktionerna för att förstå dess fördelning. Jämföra distribmepannor av ett protein i fraktionerna med andra subcellulära markörproteiner bidrar också till att bekräfta att de experimentella förhållandena har uppnått önskad fraktionering. Tabell 2 sammanfattar ofta använda proteinmarkörer som kan användas som indikatorer för de olika stadierna i fraktione 8,27- 38.

Utnyttjande av den diskontinuerliga sukrosgradient används ofta för att berika synaptiska plasmamembran. Denna metod har fördelen framför kontinuerliga Percoll gradienter i att diskontinuerliga sackarosgradienter är lättare att göra och inte kräver specialutrustning. Dock kan denna metod inte vara tillräcklig för att exakt lokalisera ett protein av intresse, och för dessa applikationer en Percoll gradient kan vara att föredra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M HEPES, pH 7.4 BioShop HEP003.100
HEPES BioShop HEP001.500 
Sucrose  BioShop SUC507.1
EDTA BioBasic EB0185
PMSF BioShop PMS123.5
Aprotinin BioShop APR600.1
Leupeptin BioShop LEU001.1
Pepstatin BioShop PEP605.5
Benzamidine BioShop BEN601.25
Sodium fluoride BioShop SFL001.100
Sodium pyrophosphate BioShop SPP310.100
Sodium orthovanadate BioShop SOV664.10
β-glycerophosphate BioShop GYP001.10
Triton X-100 BioShop TRX506.500
18 G x 1 ½” needle BD 305196
1 cc syringe BD 309659
Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 VWR KT885450-0023
IKA Model RW 16 basic stirrer IKA Works 2572100
Sorvall SM-24 fixed angle rotor ThermoScientific 29017
Sorvall RC 6 Plus centrifuge ThermoScientific 46910
Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml) Beckman Coulter 331372
SW 41 Ti rotor swinging bucket Beckman Coulter 331362
Beckman L-80 floor ultracentrifuge Beckman Coulter
Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml) Beckman Coulter 349622
TLA-100.3 fixed angle rotor Beckman Coulter 349481
Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
  2. Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
  3. Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
  4. Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
  5. Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
  6. Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
  7. Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
  8. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  9. Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
  10. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
  11. Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
  12. Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
  13. Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
  14. Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
  15. Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density protein" is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
  16. Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
  17. Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
  18. Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
  19. Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
  20. Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
  21. Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
  22. Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
  23. Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
  24. Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
  25. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  26. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a Laboratory Manual. 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  27. Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
  28. Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
  29. Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
  30. Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
  31. Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
  32. Neff, R. A. 3rd, Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
  33. Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
  34. Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
  35. Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
  36. Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
  37. Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
  38. Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).
Beredning av Synaptic plasmamembranet och Postsynaptiska Density Proteiner hjälp av en kontinuerliga sukrosgradient
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. J. Vis. Exp. (91), e51896, doi:10.3791/51896 (2014).More

Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. J. Vis. Exp. (91), e51896, doi:10.3791/51896 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter