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Medicine

全身及肝脏血流动力学参数的监测小鼠

doi: 10.3791/51955 Published: October 4, 2014

Summary

这部影片展示了如何获取小鼠全身及肝脏血流动力学。整个监视包括采集的重要参数,全身血压,中心静脉压,肝总动脉流量,和门静脉压,以及门户网站流量小鼠。

Abstract

在实验研究中使用的小鼠模型是对肝脏的生理和病理障碍的研究有着重要意义。然而,由于鼠标的体积小,适合于鼠标术监测过程的技术细节很少说明。此前我们已经报道了监控程序,以获取血流动力学参数的影响。现在,我们适应的程序来获取小鼠全身及肝脏血流动力学参数,一个物种的10倍,比老鼠更小。该薄膜显示出动物的仪表以及评估在小鼠中的全身和肝血流动力学所需要的数据采集过程。重要的参数,包括体温,呼吸率和心脏速率,记录整个过程。全身血流动力学参数,包括颈动脉压(CAP)和中心静脉压(CVP)的。肝脏灌注参数包括门户vEIN压力(PVP),门脉流量以及肝总动脉(表1)的流量。仪器仪表和数据采集,记录的正常值是在1.5小时内完成。在此过程中的全身和肝血流动力学参数保持在正常范围内。

这个过程是具有挑战性的,但可行的。我们已经应用这个程序,以评估在正常小鼠以及在70%部分肝切除和肝瓣合模实验肝脏血流动力学。意思是PVP切除后(N = 20),为11.41±2.94 水柱这是显著高于对照组(P <0.05)切除术(6.87±2.39 水柱 )之前。肝叶夹紧实验的结果表明,该监视过程是敏感的,并适合于检测在入口压力和入口流速的微小变化。总之,这个过程是可靠的一个有经验的微型外科医生的手,但应限制为experiments地方是绝对需要的小鼠。

Introduction

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这部影片的总体目标是要证明一个实时监控程序,用于获取系统和肝脏血流动力学参数。开发这个程序的基本原理是在需要获得系统和肝脏血流动力学参数老鼠实验干预其巨大的价值。该过程可以应用于幼稚动物和期间或之后给定的肝胆实验外科干预,如肝部分切除,门静脉结扎和肝脏移植。

收购肝血流动力学数据,啮齿动物,需要提出的侵入性手术。肝脏灌注不能获得非侵入性。不过,也有收购全身血压的替代品。如尾袖套法8监测技术已被用于获取在大鼠和小鼠的血压。尾袖套法可以在有良知施加项动物。当测量血压时,动物需要被放置并固定在一个特定的不舒服的位置。在尾套设备的说明书,厂商指出,老鼠可能会变得紧张,并强调这可能削弱流通的尾巴。该种情况下,在尾巴获得的外周血压力可以比中央的血压低得多。

使用一系列传感器进行数据采集的集成多通道监测器进行全程监控程序。通过将导管插入后,在显微镜下仔细显微解剖和曝光的各容器中得到的血压。流速通过将跨音速流动探头每个容器周围测定。

我们已经报道了类似的术中监测程序导致了全面的一系列生理血流动力学数据堪比SINGL的老鼠来自其他团体7日报道E数据。因此,我们认为这个过程代表了良好的基础,使之适应鼠标,一个物种的10倍,比老鼠更小。在关键的区别与大鼠程序是利用Millar的导管,用于获取血压数据,而不是基于流体的导管系统。流动数据也获得了跨声速流动探头,只是很多小的比相应的大鼠血管。

由于动物的体积小,小鼠仪器在技术上是有挑战性的,但可行的。一旦仪器完成时,数据采集与主寿命数据分析是简单的,因为可以使用预定义的设置文件。设置文件,必须在一系列的实验中,开始一次定义,并且可以被存储并用于所有后续实验。

到现在为止,我们应用这个程序,以评估急性肝的实验血流动力学的影响。我们测得的CAP和PVP之前和紧接之后的70%部分肝切除(PH)和在夹紧/去夹紧的实验。我们夹在右叶表示质量接着位数的简短(5分钟)的夹紧和左外叶肝较完全的90%肝脏质量的20%的肝十二指肠韧带。去夹紧开始释放,从肝右叶后释放的中位数和左外叶夹。最大合模时间低于10分钟。

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Protocol

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住房和进行的所有程序均按照德国动物福利立法。

1,传感器校准(按照制造商的说明进行传感器校准)

1.1)米勒导管校准。预浸泡在导管的尖端在无菌水或盐水的前30分钟,以平衡(归零)和校准。

  1. 在米勒传感器连接到桥式放大器的millar1通道,插入米勒传感器尖端插入水柱。
  2. 设置水柱值:0水柱2 O在数据分析软件窗口中,选择桥放大和零吧。基线值0 水柱可以设置。
  3. 设置水柱值到20水柱2 O运行数据分析软件窗口的进展,并停止。选择在桥的窗口“单位”放大,2 O相应地设置为0和20水柱基线。调整“单元”,以水柱<子> 2 O。
  4. 校准millar2用于测量CAP中相同的方式(设置两个基准线90和110 水柱 )。

1.2),血流量探头校准

  1. 将探头置于去离子水。连接探头与跨音速流动探头系统。
  2. 在数据分析软件窗口中,选择输入放大到零流量探头。调整单元。
  3. 按下按钮“测试信道”来收集信号:如果信号具有3-4条,这意味着该信号是好的。如果一个好的信号获取,程序可以继续。
  4. 按下按钮,以“零通道”和规模频道看到的值是否已经校准与否。
  5. 按下按钮“测量通道”后测量。

2,准备好鼠标的手术过程

  1. 鼠标放置在一个感应室和麻醉小鼠,用2%异氟醚和0.3ml /分钟的氧气。该操作可以在鼠标的脚趾捏撤回反射不存在下进行。
  2. 剃手术区域,其包括左颈部和腹部的毛。
  3. 把鼠标放在手术台上,并用胶带固定。使用对眼睛的兽医药膏,以防在操作期间干燥。
  4. 将脖子下纱布垫在脖子上的操作领域的最佳曝光。
  5. 消毒操作领域,并把消毒纱布覆盖鼠标只留下手术视野打开。

3,重要参数的测量

  1. 将心针进入皮下小鼠的爪子。
  2. 将呼吸传感器下的小鼠的背部。
  3. 将温度探头插入鼠标的直肠。
  4. 记录温度,心电图和鼠标在数据分析软件的呼吸频率。

4,颈部操作局长ystemic心血管监测

4.1)血管夹层

  1. 确定中线颈,中间点锁骨,下颌骨的角度。
  2. 使从下颌到锁骨的中间点是0.5厘米到中线的左边的角2cm的纵向切口。
  3. 解剖颌下腺,翻过来,并用生理盐水浸泡的纱布覆盖。
  4. 找出颈内静脉,解剖它,把静脉结扎后并固定在三个6-0丝线缝合。
  5. 确定胸锁乳突肌,它从二腹肌肩胛舌骨和后腹优越的​​肚子分开,并用拉钩容易暴露颈动脉的拉动。
  6. 解剖颈动脉,将动脉购买结扎并固定在三个6-0丝缝合线。

4.2)颈动脉的血流量测量

  1. 将跨音速探头颈动脉周围,保持它的稳定,并使用超声波凝胶或盐水优化接触。
  2. 颈动脉作为使用数据分析软件的跨音速设备的小屏幕上显示记录的血流速度
  3. 在完成测量后拆除探头

4.3)颈动脉压测量(CAP)

  1. 结扎颈总动脉的远端和夹持其近端。
  2. 将颈动脉周围2个固定缝合。用10-0的聚丙烯为入住的缝线。
  3. 使在容器的前壁的小切口。
  4. 将米勒导管,并修复它与预置缝线。
  5. 记录在数据分析软件瓶盖。

4.4)颈静脉血流测定

  1. 解除颈静脉并放置跨音速气流探测器来测量流速。
  2. 记录流率数据分析软件。

4.5)中心静脉压测定(CVP)

  1. 夹住颈静脉的近端和结扎的远端。
  2. 切使用microscissors在容器的前壁的小切口。
  3. 插入的填充流体的导管,并与预先放置缝合线固定。
  4. 记录在数据分析软件的CVP。

5,腹部手术的收购肝血流动力学的影响

5.1)船只识别

  1. 使上腹部横切口。
  2. Eventerate肠内到左侧,并盖上湿纱布。
  3. 辨认下腔静脉,门静脉,肝总动脉和肝固有动脉。
  4. 整个监视过程中减少一些温生理盐水,在腹部和肠子每5分钟的表面上。

门脉血流5.2)测量

  1. 解剖门静脉。
  2. 放置在门静脉6-0丝线将所述流量探针时,以方便容器的升降。
  3. 把跨音速气流探测器周围的门静脉,并测量其血流量。
  4. 记录门静脉的血流量。

常见的肝动脉血流5.3)测量

  1. 小心翼翼的解剖肝总动脉。
  2. 放置在容器中围绕一个6-0丝线缝合,以方便容器的升降。
  3. 放置在动脉周围的气流探测器。
  4. 测量其血流量和获取数据。

门静脉压力5.4)测量(PVP)

  1. 选择肠系膜静脉一些偏科,这水渠直接进入门静脉的一个分支。
  2. 结扎所选肠系膜静脉的远端。确保结扎是接近肠道管。结扎的小分支
  3. 将2 Fixing使用静脉周围6-0普理灵缝线。这个过程的关键是避免结扎静脉时,触摸肠系膜动脉。
  4. 夹住门静脉的近端。
  5. 将用10-0的聚丙烯2逗留缝合。会出现一些出血,因为留缝线应穿过细肠系膜静脉的血管壁。
  6. 就用microscissor倾斜成45度角的静脉小切口。
  7. 将通过肠系膜静脉导管米拉尔进入门静脉和修复
  8. 记录门静脉压力。在该过程结束时,通过放血牺牲小鼠麻醉下。

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Representative Results

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小鼠的重要参数,例如呼吸速率和心脏速率明显高于对大鼠高得多。平均全身血压和颈静脉压力类似于鼠值甚至类似于人的数据。

肝脏血流动力学的数据有明显的不同。我们从8只获得正常的值。在正常小鼠门脉血流之间的1.6〜2.3毫升/分钟之间。流入肝总动脉介于0.10至0.35毫升/分钟。在正常动物门静脉压力在大范围从4.4到11.2 水柱与8.09±2.47的平均值水柱 (表1)。比较小的组正常动物的平均值,当这个宽范围可能导致小但不显著差异。

因为我们观察到大量的个体间的差异尤其是门静脉压力,我们测试无论是小个体内差异可能与此技术可检测NIQUE。我们评估了此过程中两种不同的实验设置:肝部分切除术和肝叶夹紧/去夹紧。门静脉压力后立即前70%部分肝切除组(n = 20),在相同的动物( 图1)从6.87±2.39和11.41±2.94增加了2倍水柱 (P = <0.001)。这些结果是类似的范围如7人观察到其他物种5,12和也。

正常门静脉压力,门静脉压力切除术之前,从两个不同的群体(一个正常监控参数组外,其余70%PH组)收购。由于广泛的正常小鼠门静脉压力(4〜11 水柱 ),三五成群动物的平均值可能会略有不同,因为在我们的实验中观察到(8.09±2.47 水柱与6.87±2.39水柱2 O)。然而,在分析数据时,我们发现,没有STATIS这两个组(P = 0.237)之间的角度讲显著差异。

夹紧/去夹紧实验的目的是要表明,该方法是足够敏感拿起在门脉压力更小的变化。肝右叶代表肝脏质量的20%的夹紧导致增加了约17%。中位数的进一步夹紧和左外叶造成增加至少2-3倍相比起始门脉压力。门脉压力返回逐渐起始压力,释放从肝右叶导致的肝的70%的夹紧夹紧时。除去从左侧门静脉供给的中位数和左外叶( 图2表2)夹紧时的压力恢复到初始水平。打开腹部后1h内假手术组的MAP保持稳定。小鼠对照组的映射,在可比的时间点获得的在夹紧试验,无显著差异的实验组地图相比。两个实验的结果表明,小于20%,甚至小个体内的变化可以与该程序进行检测。

在手术过程中可能会出现的典型并发症,如严重出血和淤血。由于严重失血会导致显著降低MAP,以及PVP,小鼠用这种并发症的结果应该被消除。要进行肝叶夹紧实验时,我们建议注射小剂量肝素(500单位/公斤)避免静脉淤血及血栓形成夹紧之前手术中。肝总动脉后,能处理诸如起重器,并把探头经过短暂的血管痉挛。这可能会导致肝脏的瞬间短暂缺血。在一般情况下,痉挛可能在几分钟内自行解决。在查短血管痉挛是不是构成了严重的问题对动物的寿命,但可能与实验结果干扰,着眼于肝缺血再灌注损伤时。

总之,这个过程是具有挑战性的,但可行的。它要求即使是经验丰富的微型外科医生的一些培训。由于前和干预后在不同的动物中获得的压力数据的高个体间变异性的比较可能不会导致结论性的结果。因此,我们建议这个程序通过前,同样的动物在干预后获得的数据,研究在急性实验肝脏血流动力学的短期调控。

参数获得自己的数据参数报告
重要参数心脏率(N = 8) 418±55 BPM 389(353-566)的BPM 1
162±11 BPM 254±28 BPM 2
温度(N = 8) 33.56±0.54℃, 36.1-36.6℃,11
全身血压(CAP)(N = 8) 130.54±20.47 水柱
(= 96.02±15.06毫米汞柱)
94±15毫米汞柱9
中心静脉压(CVP)(N = 2) 8.90±3.25 水柱 5.9±2.0 水柱 11
肝脏血流动力学门静脉流(N = 6) 2.03±0.24毫升/分 3.0(2.5-3.1)ml / min的1
3.3毫升/分1
肝动脉血流组(n = 6) 0.20±0.09毫升/分不缶 ND
PVP(N = 8) 8.09±2.47 水柱 (= 5.95±1.82mmHg) 5.3±1.4厘米生理盐水3
8.7±2.1毫米汞柱4
4mmHg 6

。小鼠使用这种监控程序获得的CAP 表1一般全身及肝脏血流动力学参数 :颈动脉压力;地图:平均动脉压; CVP:中心静脉压; PVP:门静脉压力。

图1
图1。之前的PVP和70%PH后,前,后70%的部分被切除门静脉压力(N = 20)6.87±2.39和11.41±2.94水柱2 O。www.jove.com/files/ftp_upload/51955/51955fig1highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。

参数(公分水柱) 剖腹手术后夹紧肝的20%后(RL) 夹紧90%的肝脏后(L + ML + LLL) 夹紧肝的70%后(ML + LLL) 在端(释放所有夹具)
PVP - 夹紧EXP组(n = 10) 9.59±4.00 10.45±3.89 25.78±8.99 16.91±9.86 11.14±4.48
平均CAP - 钳位EXP组(n = 10) 121.50±18.67 95.89±32.76 74.41±35.35 93.88±42.96 89.44±44.20
平均CAP - 深水组(n = 3) 123.33±12.42 121.0±5.57 124.00±8。66 127.33±7.23 123.00±8.89

表2。血流动力学反应夹紧和不同的肝叶开放后(N = 10)RL:右叶,ML:中叶(包括右中叶和左中叶),LLL:左外叶。

图2
夹紧和不同肝叶开放后图2。血流动力学反应(动物编号:CHI-108) PVP插入米勒导管后立即为8.8水柱2 O。夹紧20%肝叶后,PVP为10.8水柱2 OBPVP上升至17.5 水柱夹紧90%肝叶后。 C. PVP释放肝右叶的夹子时下降到10.3 水柱 。 D.PVP回到8.7水柱2 请点击这里查看该图的放大版本。

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Discussion

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肝脏血流动力学监测是一项重要的研究工具,在肝病和肝胆外科。收购肝血流动力学数据有助于表征循环系统肝胆程序的影响。还需要采集的肝血流动力学数据,研究了影响门脉压力和流量的门户, 药物的疗效,需要在研究评估血管活性药物。

尽管小尺寸的重要参数,系统性和肝血流动力学可以在小鼠中进行监测。分别在协议中的关键步骤如下:首先,以放置在一个加热垫的动物在整个过程中,以避免低温可能导致循环功能障碍是很重要的。第二,它是至关重要的解剖小鼠的血管时,要非常谨慎,因为鼠标血管壁很脆弱,薄。看来最好的抓在th一些脂肪组织修复血管壁E面,而不是抓住血管壁本身。第三,它是重要的,以避免肠系膜动脉的偶然结扎用于放置所述固定缝线周围的肠系膜静脉时不损害动脉供应。

然而,侵入性的指导技术具有一定的局限性。 一个是它的侵袭力本身。此监测技术是一种侵入性的方法,这需要外科介入。因此监控程序本身可能会引起副作用的动物。因此,我们仅使用此过程来获得在正常动物和在急性实验血液动力学参数,而不是在存活实验。在下一步,我们要探讨该技术在生存实验。这个过程的第二个限制是,它需要大量的显微经验。血流动力学监测小鼠只能由经过专门培训的microsurgeons进行。最困难的标准杆此监视过程的t是米勒导管在小肠系膜静脉的插入,因为这个脉是极其脆弱的。在我们的手中,还需要一个有经验的microsurgeon技术上掌握此过程之前,约10培训业务。经验是定义在成功进行了超过50吻合血管(颈总动脉,颈内静脉)的大鼠或小鼠。 第三个限制是,用这种方法得到的门脉压力可以低于生理范围内对于正常动物。肠系膜静脉结扎导管插入可以通过估计10%降低血液引流到门静脉的总量。然而,这种生理范围,不能利用当前可用的装置获得的。同样,麻醉本身对PVP的影响,不能排除13。然而,因为所有的动物进行相同的干预下,潜在的误差将是一个系统误差。因此,DATA解释应谨慎专注于动物内的相对变化的,不一定对动物​​之间的绝对差来完成。

但是,也有小的替代侵袭性血液动力学监测在啮齿类动物。非侵入性的监控仅限于收购全身血压。门脉压力或门脉血流不能非侵入性地在小鼠中测定。遥测监控也只限于收购全身血压。报告没有发现关于遥测采集等血流动力学参数。

这充分术中监护的过程是需要了解肝脏的生理过程,如肝脏灌注,肝再生,肝胆外科,全面的监管。在实时监测和收集实验动物的数据术的能力因此代表在肝二研究的一个显著预先sea​​se门静脉高压症。

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Disclosures

作者宣称,他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项研究是由德国联邦Ministery教育与研究部(BMBF)资助的“虚拟肝络”的支持。我要感谢弗兰克·舒伯特和刘若英贡佩尔特从耶拿大学医院为他们生产的视频和创建动画和伊莎贝尔JANK录制音频帮助媒体中心。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PowerLab 16/30  ADInstruments PL3516
Quad Bridge Amp ADInstruments FE224 Bridge amplifier 
Animal Bio Amp ADInstruments FE136
Needle Electrodes for FE136 (3 pk) ADInstruments MLA1213
Perivascular Flowmeter Module Transonic TS420
Flowprobe MA0.5PSB/MA1PSB Transonic MA0.5PSB/MA1PSB
SPR-1000 Mouse Pressure Catheter Millar instruments 841-0001
fluid filled catheter  Terumo SR+DU2619PX 26G, 0.64×19mm
micro scissors F·S·L No. 14058-09
micro serrefine F·S·L No.18055-05
Micro clamps applicator F·S·L No. 18057-14
Straight micro forceps F·S·L No. 00632-11
Curved micro forceps F·S·L No. 00649-11
needle-holder F·S·L No. 12061-01
6-0 silk ethicon
6-0 prolene ethicon
7-0 prolene ethicon
10-0 prolene ethicon
Tail cut-off device  Kent Scientific www.kentscientific.com
LabChart7 ADInstruments data  analysis software 

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References

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Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of Systemic and Hepatic Hemodynamic Parameters in Mice. J. Vis. Exp. (92), e51955, doi:10.3791/51955 (2014).More

Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of Systemic and Hepatic Hemodynamic Parameters in Mice. J. Vis. Exp. (92), e51955, doi:10.3791/51955 (2014).

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