इमेजिंग Intracellular सीए^{2 +} आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों का उपयोग वयस्क चूहों से Striatal astrocytes में सिग्नल

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca²⁺ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca²⁺ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca²⁺ concentration fluctuations ([Ca²⁺]_i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca²⁺]_i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca²⁺]_i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca²⁺]_i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca²⁺]_i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca²⁺]_i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca²⁺]_i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca²⁺]_i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

Astrocytes मस्तिष्क की सर्वव्यापी और प्रचुर मात्रा में glial कोशिकाओं हैं. यह अच्छी तरह से astrocytes महत्वपूर्ण समर्थन और बाह्य अंतरिक्ष में ⁺ K एकाग्रता की बफरिंग, तेज न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपलब्ध कराने के पोषक तत्वों सहित समस्थिति भूमिकाओं कि सेवा स्थापित है. हालांकि, हाल के अध्ययनों से वे भी अनायास होते हैं और neuronal गतिविधि ¹ से बढ़ रहे हैं जो [सीए ^{2 +]} _मैं संकेतों को प्रदर्शित करता है. astrocyte का अस्तित्व [सीए ^{2 +]} _मैं संकेतन तेजी न्यूरॉन्स के साथ अपने संचार को गति प्रदान करने के लिए लगा दिया गया है, और इस तरह के रूप astrocytes के भीतर "सीए ^{2 +} excitability के" के रूप में व्याख्या की गई है. पिछले दो दशकों में उपलब्ध डेटा astrocytes और न्यूरॉन्स शायद एक द्विदिश ढंग से संवाद कर सकते हैं, जिसमें दो सेटिंग्स सुझाव है. सबसे पहले, astrocytes अक्सर _मैं जब न्यूरोट्रांसमीटर और से सक्रिय [सीए ^{2 +]} में वृद्धि के साथ प्रतिक्रियान्यूरॉन्स ² से जारी neuromodulators. दूसरा, [सीए ^{2 +]} astrocytes के भीतर _मैं बढ़ जाती बारी में न्यूरॉन्स और रक्त वाहिकाओं को प्रभावित कर सकता है कि astrocytes से संकेतन अणुओं की रिहाई के कारण. साक्ष्य astrocytes से जारी अणुओं astrocyte करने वाली न्यूरॉन संकेत के माध्यम से अन्तर्ग्रथन, सर्किट और अंततः व्यवहार ^3-5 के कार्यों में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कि पता चलता है. बहरहाल, यह एक तेजी से विकसित अनुसंधान क्षेत्र बना हुआ है, और यह astrocyte का एक बेहतर और विस्तृत समझ [सीए ^{2 +]} _मैं मौजूदा अनिश्चितताओं ⁶ में से कुछ को हल करने के लिए आवश्यक है कि तर्क दिया गया है.

पिछले काम में, यह astrocytes में जैविक सीए ^{2 +} सूचक रंगों के थोक लोड हो रहा है मज़बूती का पता लगाने में विफल रहता है कि प्रदर्शन किया गया [सीए ^{2 +]} संस्कृति में और सीटू ^7-10 में पूरे astrocytes के भीतर _मैं संकेत. इन निष्कर्षों को हमें और दूसरों ^6,11,12 से चर्चा की गई है. में emerginजी चित्र [सीए ^{2 +]} _मैं न्यूरॉन्स और रक्त वाहिकाओं के साथ बातचीत के लिए प्राथमिक साइट्स हैं जो astrocyte प्रक्रियाओं (जैसे, शाखाओं और टहनियों), भीतर का संकेत है, शायद ही कभी विस्तार से पता लगाया गया है कि है. हाल ही में, इस तरह के साइटोसोलिक GCaMP3, GCaMP5G और GCaMP6 और प्लाज्मा झिल्ली के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs) का उपयोग सीमित संस्करण (जैसे, Lck-GCaMP3) astrocytes इस तरह के छोटे डिब्बों में [सीए ^{2 +]} _मैं संकेतों के अध्ययन की अनुमति दी है के रूप में पतली प्रक्रियाओं, प्लाज्मा झिल्ली के पास और पूरे प्रदेशों ^7,8 भीतर. हालांकि, GECIs जैविक सीए ^{2 +} सूचक रंगों के ऊपर एक नुकसान है और GECIs उचित होना व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक तरीकों सप्ताह की अवधि के लिए विवो में astrocytes के लिए चुनिंदा एन्कोडिंग जीन देने के लिए कि आवश्यकता है. विवो में अभिव्यक्ति आमतौर पर दस्तक में चूहों या वायरस आधारित वितरण अनुप्रयोग के साथ, ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर हासिल की हैroaches. वर्तमान जौव लेख में हम एडिनो से जुड़े वायरस का उपयोग striatal astrocytes को GECIs देने के लिए नियोजित तरीके और प्रक्रियाओं की रिपोर्ट. हम एक उदाहरण के रूप cyto-GCaMP3 पर ध्यान देते हैं, लेकिन एक ही मूल प्रक्रिया अन्य GECI या फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित रिपोर्टर किसी के लिए काम करता है.

Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार थे और यूसीएलए में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. …

Representative Results

स्ट्रिएटम में cyto-GCaMP3 की astrocyte विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए, हम पहले से मजबूत GCaMP3 और पत्रकार जीन ड्राइव करने के लिए दिखाया गया है जो एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) 5 सीरोटाइप की, और GFAP GfaABC 1 डी प्रमोटर (चित्रा 1 ए)</stro…

Discussion

इस के साथ साथ वर्णित विधि हमें बगल में बाद [सीए ^{2 +]} _मैं इमेजिंग के लिए vivo में striatal astrocytes में cyto-GCaMP3 व्यक्त करने की अनुमति दी है. इस विधि ट्रांसजेनिक या मजबूत लक्षित प्रोटीन, तेज़ी की अभिव्यक्ति और ?…

Materials

Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000