Summary

इमेजिंग Intracellular सीए<sup> 2 +</sup> आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों का उपयोग वयस्क चूहों से Striatal astrocytes में सिग्नल

Published: November 19, 2014
doi:

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

Astrocytes मस्तिष्क की सर्वव्यापी और प्रचुर मात्रा में glial कोशिकाओं हैं. यह अच्छी तरह से astrocytes महत्वपूर्ण समर्थन और बाह्य अंतरिक्ष में + K एकाग्रता की बफरिंग, तेज न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपलब्ध कराने के पोषक तत्वों सहित समस्थिति भूमिकाओं कि सेवा स्थापित है. हालांकि, हाल के अध्ययनों से वे भी अनायास होते हैं और neuronal गतिविधि 1 से बढ़ रहे हैं जो [सीए 2 +] मैं संकेतों को प्रदर्शित करता है. astrocyte का अस्तित्व [सीए 2 +] मैं संकेतन तेजी न्यूरॉन्स के साथ अपने संचार को गति प्रदान करने के लिए लगा दिया गया है, और इस तरह के रूप astrocytes के भीतर "सीए 2 + excitability के" के रूप में व्याख्या की गई है. पिछले दो दशकों में उपलब्ध डेटा astrocytes और न्यूरॉन्स शायद एक द्विदिश ढंग से संवाद कर सकते हैं, जिसमें दो सेटिंग्स सुझाव है. सबसे पहले, astrocytes अक्सर मैं जब न्यूरोट्रांसमीटर और से सक्रिय [सीए 2 +] में वृद्धि के साथ प्रतिक्रियान्यूरॉन्स 2 से जारी neuromodulators. दूसरा, [सीए 2 +] astrocytes के भीतर मैं बढ़ जाती बारी में न्यूरॉन्स और रक्त वाहिकाओं को प्रभावित कर सकता है कि astrocytes से संकेतन अणुओं की रिहाई के कारण. साक्ष्य astrocytes से जारी अणुओं astrocyte करने वाली न्यूरॉन संकेत के माध्यम से अन्तर्ग्रथन, सर्किट और अंततः व्यवहार 3-5 के कार्यों में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कि पता चलता है. बहरहाल, यह एक तेजी से विकसित अनुसंधान क्षेत्र बना हुआ है, और यह astrocyte का एक बेहतर और विस्तृत समझ [सीए 2 +] मैं मौजूदा अनिश्चितताओं 6 में से कुछ को हल करने के लिए आवश्यक है कि तर्क दिया गया है.

पिछले काम में, यह astrocytes में जैविक सीए 2 + सूचक रंगों के थोक लोड हो रहा है मज़बूती का पता लगाने में विफल रहता है कि प्रदर्शन किया गया [सीए 2 +] संस्कृति में और सीटू 7-10 में पूरे astrocytes के भीतर मैं संकेत. इन निष्कर्षों को हमें और दूसरों 6,11,12 से चर्चा की गई है. में emerginजी चित्र [सीए 2 +] मैं न्यूरॉन्स और रक्त वाहिकाओं के साथ बातचीत के लिए प्राथमिक साइट्स हैं जो astrocyte प्रक्रियाओं (जैसे, शाखाओं और टहनियों), भीतर का संकेत है, शायद ही कभी विस्तार से पता लगाया गया है कि है. हाल ही में, इस तरह के साइटोसोलिक GCaMP3, GCaMP5G और GCaMP6 और प्लाज्मा झिल्ली के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs) का उपयोग सीमित संस्करण (जैसे, Lck-GCaMP3) astrocytes इस तरह के छोटे डिब्बों में [सीए 2 +] मैं संकेतों के अध्ययन की अनुमति दी है के रूप में पतली प्रक्रियाओं, प्लाज्मा झिल्ली के पास और पूरे प्रदेशों 7,8 भीतर. हालांकि, GECIs जैविक सीए 2 + सूचक रंगों के ऊपर एक नुकसान है और GECIs उचित होना व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक तरीकों सप्ताह की अवधि के लिए विवो में astrocytes के लिए चुनिंदा एन्कोडिंग जीन देने के लिए कि आवश्यकता है. विवो में अभिव्यक्ति आमतौर पर दस्तक में चूहों या वायरस आधारित वितरण अनुप्रयोग के साथ, ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर हासिल की हैroaches. वर्तमान जौव लेख में हम एडिनो से जुड़े वायरस का उपयोग striatal astrocytes को GECIs देने के लिए नियोजित तरीके और प्रक्रियाओं की रिपोर्ट. हम एक उदाहरण के रूप cyto-GCaMP3 पर ध्यान देते हैं, लेकिन एक ही मूल प्रक्रिया अन्य GECI या फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित रिपोर्टर किसी के लिए काम करता है.

Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार थे और यूसीएलए में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. …

Representative Results

स्ट्रिएटम में cyto-GCaMP3 की astrocyte विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए, हम पहले से मजबूत GCaMP3 और पत्रकार जीन ड्राइव करने के लिए दिखाया गया है जो एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) 5 सीरोटाइप की, और GFAP GfaABC 1 डी प्रमोटर (चित्रा 1 ए)</stro…

Discussion

इस के साथ साथ वर्णित विधि हमें बगल में बाद [सीए 2 +] मैं इमेजिंग के लिए vivo में striatal astrocytes में cyto-GCaMP3 व्यक्त करने की अनुमति दी है. इस विधि ट्रांसजेनिक या मजबूत लक्षित प्रोटीन, तेज़ी की अभिव्यक्ति और ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

काम के बहुमत और शामिल कर्मियों एनआईएच अनुदान NS060677 से और आंशिक रूप से एनआईएच MH099559 और (BSK के लिए) MH104069 अनुदान द्वारा समर्थित थे. काम से कुछ भी CHDI फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Syringe Pump Harvard Apparatus 704506
Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Narishige PC-10
Micropipette grinder Narishige EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 Addgene 44331 a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe BD 309628
syringe needle BD 305109
AAV2/5 virus UPenn vector core NA
Sudan red IV Sigma-Aldrich 67386
Mineral oil CVS Pharmacy 152355
Cryostat Leica CM3050 S
Stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit FOREDOM K.1070
Paraformaldehyde Santa cruz biotechnology sc-281692
Super Glue Krazy®Glue KG925
Microslicer Ted Pella DTK-Zero 1
Confocal microscopes Olympus FV300 and FV1000
Normal goat serum Vector S-1000
chicken anti-GFP Abcam ab13970
mouse anti-s100β Sigma-Aldrich S2532
mouse anti-NeuN Millipore MAB377
mouse anti-glutamine synthetase Millipore MAB302
goat anti-mouse-Alexa546 Invitrogen A11003
goat anti-chicken-Alexa488 Invitrogen A11039
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5J
Mounting Medium Vector H-1000

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Jiang, R., Haustein, M. D., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (93), e51972, doi:10.3791/51972 (2014).

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