Imaging intracellulär Ca²⁺ Signaler i Striatal Astrocyter från vuxna möss använda genetiskt kodade kalcium indikatorer

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca²⁺ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca²⁺ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca²⁺ concentration fluctuations ([Ca²⁺]_i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca²⁺]_i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca²⁺]_i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca²⁺]_i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca²⁺]_i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca²⁺]_i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca²⁺]_i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca²⁺]_i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

Astrocyter är allestädes närvarande och rikliga gliaceller i hjärnan. Det är väl etablerat att astrocyter tjänar ett viktigt stöd och homeostatiska roller inklusive buffring av K ⁺ koncentrationen i det extracellulära utrymmet, upptag av neurotransmittorer och ger näring. Men nya studier visar att de också visa [Ca2 ^+] _i signaler, som uppträder spontant och ökade med nervaktivitet ^1. Förekomsten av astrocyternas [Ca2 ^+] _i signalering har i allt högre grad tänkt att utlösa sin kommunikation med nervceller, och som sådan har tolkats som en form av "Ca2 ⁺ retbarhet" i astrocyter. Tillgängliga data under de senaste två decennierna föreslå två miljöer där astrocyter och nervceller kan kommunicera, kanske i ett dubbelriktat sätt. Först astrocyter svarar ofta med en ökning av [Ca2 ^+] _i när den aktiveras av signalsubstanser ochneuromodulatorer frigörs från neuroner ^2. För det andra, [Ca2 ^+] _i prishöjningarna astrocyter orsakar frisättningen av signalmolekyler från astrocyter som i sin tur kan påverka nervceller och blodkärl. Uppgifter tyder på att molekyler som frigörs från astrocyter leda till förändringar i funktioner synapser, kretsar och slutligen beteendet ^3-5 via astrocyternas-to-neuron signalering. Dock återstår det en snabbt växande forskningsområde, och det har hävdats att en bättre och detaljerad förståelse av astrocyternas [Ca2 ^+] _i behövs för att lösa en del av den rådande osäkerheten ^6.

I tidigare arbete, visades att bulk lastning av organiska Ca ^{2 +} indikator färgämnen i astrocyter inte tillförlitligt detektera [Ca2 ^+] _i signaler inom hela astrocyter i kultur och in situ ^7-10. Dessa fynd har diskuterats av oss och andra ^6,11,12. Den emerging bilden är att [Ca2 ^+] _i signaler inom astrocyternas processer (t.ex., grenar och grenarna), som är de främsta platser för interaktioner med nervceller och blodkärl, har sällan undersökts i detalj. Nyligen, användningen av genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) såsom cytosoliskt GCaMP3, GCaMP5G och GCaMP6 och plasmamembran bundna versioner (t.ex. Lek-GCaMP3) har gjort det möjligt att studera [Ca2 ^+] _i signaler i små fack i astrocyter sådana som tunna processer, nära plasmamembranet och inom hela territorier ^7,8. Men GECIs har en nackdel över organiska Ca ^{2 +} indikator färgämnen och det är kravet på genetiska metoder för att leverera kodningsgener selektivt till astrocyter in vivo under perioder av veckor för GECIs vara lämpligt uttryck. Expression in vivo uppnås normalt genom att använda transgena möss, knock-in möss eller med virus baserad leverans appkackerlackor. I föreliggande JUPITER artikeln rapporterar vi metoder och förfaranden som används för att leverera GECIs till striatala astrocyter som använder adenoassocierade virus. Vi fokuserar på cyto-GCaMP3 som ett exempel, men samma grundläggande procedur fungerar för alla andra Geci eller fluorescerande protein baserad reporter.

Protocol

Alla djurprotokoll var enligt amerikanska National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur, och godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid UCLA. 1.1) Förbered Mikropipett och AAV2 / 5 Virus Loading Använd fin borosilikatglas mikropipetter för insprutning av viruset. Dra mikropipett med hjälp av en tvåstegs drar programmet med en vertikal avdragare. Bevel pipetten i en vinkel på 40 ° med hjälp av en pipett kvarn. …

Representative Results

För astrocyt specifikt uttryck av cyto-GCaMP3 i striatum, använde vi adeno-associerat virus (AAV) i 5 serotyp och GFAP GfaABC en D-promotorn (Figur 1 A), som tidigare har visat sig driva robust GCaMP3 och reportergen uttryck i hippocampus och kortikala astrocyter 8,14. Två veckor efter virusmikroinjektion i musen striatum, var musen (~ 10 veckor) perfusion och IHC utfördes på tunna hjärnan sektioner för att utvärdera cyto-GCaMP3 uttryck i striatum (Figur 1B).</stron…

Discussion

De metoder som beskrivs här har gett oss möjlighet att uttrycka cyto-GCaMP3 i striatala astrocyter in vivo för efterföljande [Ca2 ^+] _i avbildning på plats. Denna metod har fördelar jämfört med att använda transgena eller knock-in möss, däribland robust uttryck av det riktade protein, snabbhet och flexibilitet i experimentell implementering och anatomiska specificitet. Uttrycket av GCaMP3 använder AAV2 / 5 befanns vara specifika och robust. Kombinationen av GFAP GfaABC …

Materials

Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000