Summary

Imaging intracellulär Ca<sup> 2+</sup> Signaler i Striatal Astrocyter från vuxna möss använda genetiskt kodade kalcium indikatorer

Published: November 19, 2014
doi:

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

Astrocyter är allestädes närvarande och rikliga gliaceller i hjärnan. Det är väl etablerat att astrocyter tjänar ett viktigt stöd och homeostatiska roller inklusive buffring av K + koncentrationen i det extracellulära utrymmet, upptag av neurotransmittorer och ger näring. Men nya studier visar att de också visa [Ca2 +] i signaler, som uppträder spontant och ökade med nervaktivitet 1. Förekomsten av astrocyternas [Ca2 +] i signalering har i allt högre grad tänkt att utlösa sin kommunikation med nervceller, och som sådan har tolkats som en form av "Ca2 + retbarhet" i astrocyter. Tillgängliga data under de senaste två decennierna föreslå två miljöer där astrocyter och nervceller kan kommunicera, kanske i ett dubbelriktat sätt. Först astrocyter svarar ofta med en ökning av [Ca2 +] i när den aktiveras av signalsubstanser ochneuromodulatorer frigörs från neuroner 2. För det andra, [Ca2 +] i prishöjningarna astrocyter orsakar frisättningen av signalmolekyler från astrocyter som i sin tur kan påverka nervceller och blodkärl. Uppgifter tyder på att molekyler som frigörs från astrocyter leda till förändringar i funktioner synapser, kretsar och slutligen beteendet 3-5 via astrocyternas-to-neuron signalering. Dock återstår det en snabbt växande forskningsområde, och det har hävdats att en bättre och detaljerad förståelse av astrocyternas [Ca2 +] i behövs för att lösa en del av den rådande osäkerheten 6.

I tidigare arbete, visades att bulk lastning av organiska Ca 2 + indikator färgämnen i astrocyter inte tillförlitligt detektera [Ca2 +] i signaler inom hela astrocyter i kultur och in situ 7-10. Dessa fynd har diskuterats av oss och andra 6,11,12. Den emerging bilden är att [Ca2 +] i signaler inom astrocyternas processer (t.ex., grenar och grenarna), som är de främsta platser för interaktioner med nervceller och blodkärl, har sällan undersökts i detalj. Nyligen, användningen av genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) såsom cytosoliskt GCaMP3, GCaMP5G och GCaMP6 och plasmamembran bundna versioner (t.ex. Lek-GCaMP3) har gjort det möjligt att studera [Ca2 +] i signaler i små fack i astrocyter sådana som tunna processer, nära plasmamembranet och inom hela territorier 7,8. Men GECIs har en nackdel över organiska Ca 2 + indikator färgämnen och det är kravet på genetiska metoder för att leverera kodningsgener selektivt till astrocyter in vivo under perioder av veckor för GECIs vara lämpligt uttryck. Expression in vivo uppnås normalt genom att använda transgena möss, knock-in möss eller med virus baserad leverans appkackerlackor. I föreliggande JUPITER artikeln rapporterar vi metoder och förfaranden som används för att leverera GECIs till striatala astrocyter som använder adenoassocierade virus. Vi fokuserar på cyto-GCaMP3 som ett exempel, men samma grundläggande procedur fungerar för alla andra Geci eller fluorescerande protein baserad reporter.

Protocol

Alla djurprotokoll var enligt amerikanska National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur, och godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid UCLA. 1.1) Förbered Mikropipett och AAV2 / 5 Virus Loading Använd fin borosilikatglas mikropipetter för insprutning av viruset. Dra mikropipett med hjälp av en tvåstegs drar programmet med en vertikal avdragare. Bevel pipetten i en vinkel på 40 ° med hjälp av en pipett kvarn. …

Representative Results

För astrocyt specifikt uttryck av cyto-GCaMP3 i striatum, använde vi adeno-associerat virus (AAV) i 5 serotyp och GFAP GfaABC en D-promotorn (Figur 1 A), som tidigare har visat sig driva robust GCaMP3 och reportergen uttryck i hippocampus och kortikala astrocyter 8,14. Två veckor efter virusmikroinjektion i musen striatum, var musen (~ 10 veckor) perfusion och IHC utfördes på tunna hjärnan sektioner för att utvärdera cyto-GCaMP3 uttryck i striatum (Figur 1B).</stron…

Discussion

De metoder som beskrivs här har gett oss möjlighet att uttrycka cyto-GCaMP3 i striatala astrocyter in vivo för efterföljande [Ca2 +] i avbildning på plats. Denna metod har fördelar jämfört med att använda transgena eller knock-in möss, däribland robust uttryck av det riktade protein, snabbhet och flexibilitet i experimentell implementering och anatomiska specificitet. Uttrycket av GCaMP3 använder AAV2 / 5 befanns vara specifika och robust. Kombinationen av GFAP GfaABC …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Huvuddelen av arbetet och den personal som stöddes av NIH bidrag NS060677, dels av NIH bidrag MH099559 och MH104069 (BSK). En del av arbetet har också stöd av CHDI Foundation.

Materials

Syringe Pump Harvard Apparatus 704506
Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Narishige PC-10
Micropipette grinder Narishige EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 Addgene 44331 a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe BD 309628
syringe needle BD 305109
AAV2/5 virus UPenn vector core NA
Sudan red IV Sigma-Aldrich 67386
Mineral oil CVS Pharmacy 152355
Cryostat Leica CM3050 S
Stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit FOREDOM K.1070
Paraformaldehyde Santa cruz biotechnology sc-281692
Super Glue Krazy®Glue KG925
Microslicer Ted Pella DTK-Zero 1
Confocal microscopes Olympus FV300 and FV1000
Normal goat serum Vector S-1000
chicken anti-GFP Abcam ab13970
mouse anti-s100β Sigma-Aldrich S2532
mouse anti-NeuN Millipore MAB377
mouse anti-glutamine synthetase Millipore MAB302
goat anti-mouse-Alexa546 Invitrogen A11003
goat anti-chicken-Alexa488 Invitrogen A11039
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5J
Mounting Medium Vector H-1000

References

  1. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  2. Khakh, B. S., North, R. A. Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS. Neuron. 76, 51-69 (2012).
  3. Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
  4. Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice. J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).
  5. Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O’Dell, T. J., Khakh, B. S. TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release. J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).
  6. Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
  7. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).
  8. Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).
  9. Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes. J Vis Exp. 26, (2009).
  10. Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).
  11. Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).
  12. Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo. Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).
  13. Paxinos, G., Franklin, K. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).
  14. Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo. Nat Commun. 5, 3262 (2014).
  15. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).
  16. Eid, T., et al. Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy. Lancet. 363, 28-37 (2004).
  17. Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. Glutamate and astrocytes–key players in human mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).
  18. Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington’s disease model mice. Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).
  19. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).
  20. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
  21. Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat. Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).

Play Video

Cite This Article
Jiang, R., Haustein, M. D., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (93), e51972, doi:10.3791/51972 (2014).

View Video