The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.
Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.
Astrocytter er allestedsnærværende og rikelig glialceller i hjernen. Det er godt etablert at astrocytter tjener avgjørende støtte og homeostatiske roller, inkludert bufring av K + konsentrasjon i det ekstracellulære rom, opptak av nevrotransmittere, så vel som å gi næringsstoffer. Men nyere studier viser at de også vise [Ca 2+] Jeg signaler, som oppstår spontant og er økt med nerveaktiviten en. Eksistensen av astrocyte [Ca 2+] i signalering har blitt stadig tenkt å utløse sin kommunikasjon med nerveceller, og som sådan har blitt tolket som en form for "Ca 2+ oppstemthet" innenfor astrocytter. De tilgjengelige data over de siste to tiårene foreslår to innstillinger der astrocytter og nevroner kan kommunisere, kanskje i en toveis måte. Først, astrocytter ofte reagere med en økning i [Ca2 +] når den aktiveres av nevrotransmittere ognevromodulatorer løslatt fra nevroner to. For det andre, [Ca 2+] Jeg øker i astrocytter føre til utslipp av signalmolekyler fra astrocytter som i sin tur kan påvirke nerveceller og blodårer. Tyder på at molekyler løslatt fra astrocytter føre til endringer i funksjonene til synapser, kretser og til slutt adferd 3-5 via astrocyte-til-nevron signalering. Men, dette er fortsatt en rask utvikling forskningsområde, og det har blitt hevdet at en bedre og detaljert forståelse av astrocyte [Ca 2+] Jeg er nødvendig for å løse noen av dagens usikkerhet 6.
I tidligere arbeid, ble det vist at ilegging av organiske Ca 2+ indikatorfarger i astrocytter unnlater å pålitelig oppdage [Ca 2+] Jeg signaler i hele astrocytter i kultur og in situ 7-10. Disse funnene har vært diskutert av oss og andre 6,11,12. Den lønnsommg bildet er at [Ca 2+] Jeg signaler innenfor astrocyttkulturer prosesser (f.eks, greiner og branchlets), som er de primære områder for samhandling med nevroner og blodårer, har sjelden blitt utforsket i detalj. Nylig har anvendelsen av genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs) som cytosolisk GCaMP3, GCaMP5G og GCaMP6 og plasmamembran forankrede versjoner (f.eks, Lck-GCaMP3) har tillatt studiet av [Ca2 +] signaler i små avdelinger av astrocytter slike som tynne prosesser, nær plasmamembranen, og i løpet av hele områder 7,8. Imidlertid GECIs har en ulempe i løpet av organiske Ca 2 + indikatorfargestoffer, og som er kravet til genetiske metoder for å levere de kodende genene selektivt til astrocytter in vivo i perioder på uker for GECIs å være hensiktsmessig uttrykt. Expression in vivo er vanligvis oppnås ved hjelp av transgene mus, knock-in mus eller med virus basert levering appKakerlakker. I den foreliggende Jove artikkelen rapporterer vi metoder og prosedyrer som brukes til å levere GECIs til striatale astrocytter hjelp adenoassosiert virus. Vi fokuserer på cytomegalovirus-GCaMP3 som et eksempel, men den samme grunnleggende prosedyren fungerer for hvilken som helst annen GECI eller fluorescerende protein basert reporter.
Metodene som er beskrevet her har tillatt oss å uttrykke CYTO-GCaMP3 i striatale astrocytter in vivo for påfølgende [Ca 2+] i bildebehandling i situ. Denne metoden har fordeler fremfor å bruke transgene eller knock-in mus, inkludert robust uttrykk for målrettet protein, hurtighet og fleksibilitet av eksperimentell implementering og anatomisk spesifisitet. Ekspresjonen av GCaMP3 ved hjelp AAV2 / 5 ble funnet å være spesifikk og robust. Kombinasjonen av GFAP GfaABC 1</su…
The authors have nothing to disclose.
Flertallet av arbeidet og involvert personell ble støttet av NIH stipend NS060677 og dels ved NIH tilskudd MH099559 og MH104069 (til BSK). Noe av arbeidet ble også støttet av CHDI Foundation.
Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
I mL syringe | BD | 309628 | |
syringe needle | BD | 305109 | |
AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
Mounting Medium | Vector | H-1000 |