Her er en fremgangsmåde beskrevet til etablering af systemisk infektion i nyfødte rotter med kulturer af Escherichia coli K1. Denne ikke-invasiv procedure tillader kolonisering af mavetarmkanalen, translokation af patogenet til den systemiske cirkulation, og invasion af det centrale nervesystem ved choroid plexus.
Undersøgelse af samspillet mellem værtsdyr og bakterielt patogen kun mening, hvis infektionen model anvendte replikerer de vigtigste elementer i den naturlige infektion. Denne protokol beskriver procedurer for etablering og evaluering af systemisk infektion på grund neuropathogenic Escherichia coli K1 i den neonatale rotte. Kolonisering af mavetarmkanalen fører til spredning af patogenet langs gut-lymfe-blod-hjerne løbet af infektion og modellen viser stærk afhængighed alder. En stamme af E. coli O18: K1 med øget virulens for den neonatale rotte producerer exceptionelt høje kolonisering, translokation til blodet rum og invasion i hjernehinden efter transit gennem chorioideus plexus. Som i den humane vært, er penetration af centralnervesystemet ledsaget af lokal inflammation og en uvægerligt dødelig udgang. Modellen er bevist anvendelighed til studier af mekanismenaf patogenese, til evaluering af terapeutiske indgreb og til vurdering af bakteriel virulens.
Systemiske bakterielle infektioner er en stor trussel mod trivsel og overlevelse af den nyfødte; præmature børn er særligt sårbare. Neonatal bakteriel meningitis (NBM), ofte forbundet med bakteriel sepsis, fortsætter med at være en væsentlig kilde til dødelighed og sygelighed i de første par uger af livet, og problemet forværres af den fortsatte udvikling af resistens over for frontline antibakterielle stoffer 1,2. Et tilfælde af NBM er en medicinsk nødsituation, der indebærer en høj medicinsk, social og økonomisk byrde 3; derfor er der et presserende behov for nye lægemidler, og især nye profylaktiske strategier til at mindske byrden for infektion. Nogle NBM funktioner er usædvanligt: i den udviklede verden, Escherichia coli og Gruppe B streptokokker er ansvarlige for det store flertal af sager, og kapaciteten af disse stammer til at fremkalde NBM er næsten altid forbundet med tilstedeværelsen af en beskyttende polysaccharid capsule der gør det muligt at patogenet at unddrage immungenkendelse processer 4. En meget stor del (80-85%) af neuroinvasive E. coli udtrykke K1 kapsel 5,6, en α-2,8-bundet polysialic-polymer, der er strukturelt identiske vært for modulatorer af neuronal plasticitet 7.
Evaluering af nye behandlings- og profylaktiske for NBM og tilhørende bakteriæmi og sepsis vil klart drage fordel af en robust dyremodel for infektion, der efterligner de centrale træk ved sygdommen i den menneskelige nyfødte, især den stærke alder afhængighed og den naturlige vej for infektion . En bred vifte af modeller for Gram-positive og Gram-negative bakterielle meningitis er tilgængelige 8,9 og disse har betydeligt udvidet vores viden om patogenese, patofysiologi og behandlingsmuligheder i disse infektioner. Således har eksperimentelle infektioner i rotter, mus, kaniner og aber er blevet anvendt til at undersøge meningitis i både neonate og den voksne. Men mange af disse modeller anvender direkte intracisternal eller subkutan injektion af bakterier til initiering af infektion, hvilket skaber en kunstig patogenese ved at omgå de naturlige processer i formidling fra stedet for kolonisering. I nogle tilfælde er disse metoder til podning ført til væsentlige ændringer i patologi; for eksempel subkutan administration af E. coli K1 stammer ophævede alder afhængighed forbundet med naturlig infektion, der producerer bakteriæmi og invasion af det centrale nervesystem (CNS) i begge nyfødte og voksne 10. Disposition til E. coli NBM er kritisk afhængig af vertikal transmission af den agens fra mor til barn ved eller kort efter fødslen 11. Maternelle E. coli K1 bakterier koloniserer den neonatale mave-tarmkanalen (GI) 11-13, der er steril ved fødslen, men hurtigt opnår en kompleks mikroflora 14. I koloniserede nyfødte, E. coliK1 bakterier har evnen til at translokere fra det intestinale lumen ind i den systemiske cirkulation før indtastning CNS over blod-hjerne eller blod-cerebrospinalvæske væskebarrierer 9,15. Design af robuste modeller af eksperimentel infektion bør tage hensyn til oplysningerne vedr.
Selv om mus er blevet almindeligt anvendt til undersøgelse af visse former af bakteriel meningitis 8, er de uegnede til undersøgelser af neonatal infektion: de er overvældet af systemisk infektion og viser ikke den stærke afhængighed alder karakteristisk for det menneskelige spædbørn 16. Yderligere α-defensiner, centrale peptider i mavetarmkanalen yde beskyttelse mod systemisk invasion af E. coli K1 17, er højt udtrykt i Paneth celler og neutrofiler hos mennesker og rotter, men ikke i mus 18. Der er en bemærkelsesværdig grad af overlapning, redundans og heterogenitet i mus defensin og relaterede cryptidin generne ikke findes i andre enimals 19. Neonatal rotte blev anvendt først ved Moxon og medarbejdere 20 at undersøge patogenesen af Haemophilus influenzae-meningitis efter intranasal inokulation replikerer naturlige sted for kolonisering af dette neonatal patogen i mennesker, og derefter tilpasset til aldersbetinget E. coli K1 bakteriæmi og meningitis. Bortolussi et al. 21 ansat intraperitoneal injektion af det bakterielle inokulum at initiere infektion, men den primære undersøgelse af Glode og medarbejdere 22 brugt oral gastrisk fodring parallel den naturlige rute for infektion efter GI kolonisering. Som ventrikelsondekanalen kan beskadige slimhindeoverflader blev proceduren raffineret omfatter fodring af inoculum til nyfødte 23. Her fremgangsmåde til mavetarmkanalen kolonisering og procedurerne til at spore infektion i modtagelige rotteunger er beskrevet; derudover er terapeutiske og forebyggende anvendelser af model diskuteret.
Dyremodellen beskrevet her bygger på tidligere arbejde, der har til formål at gengive de vigtigste træk ved naturligt forekommende infektioner hos mennesker. Neonatale rotter blev oprindeligt anvendt til at studere spædbarn meningitis grund H. influenzae type b, som arten opfyldte de vigtigste kriterier for en robust model for infektion. Således bør indgangsport af det relevante patogen afspejle det naturlige menneskelige infektion og reproducerbart give anledning til lignende patologi af tilstrækkelig varighed til at tillade terapeutisk intervention. De teknikker, der anvendes, bør ikke begrænse anvendelsen af proceduren, og bør ikke bidrage til sygdom resultat 20. Modellen for H. influenzae meningitis i spædbarn rotter udviklet af Moxon og kolleger opfylder disse kriterier 20; naturlig infektion forekommer efter kolonisering af slimhinderne i de øvre luftveje og denne vigtige funktion blev gentaget i rotteunger af ikke-traumetic instillation af bakterierne på membranerne i de nasale passager. Vigtigere, blev aldersbetinget infektionens art replikeres i modellen.
Den samme gruppe var også den første til at udvikle en ikke-invasiv model af E. coli K1 NBM i den neonatale rotte-22. Patogenfrit Sprague-Dawley unger blev koloniseret af fodring 10 august-10 oktober bakterier gennem en mundtlig gastrisk rør; inokulum derfor var betydeligt højere end den, der anvendes af os. Kolonisering med de tre K1 undersøgte stammer, C94 (O7: K1: H), EC3 (O1: K1: H) og LH (Ø75: K1: H3) forekommer i en relativt høj andel (48-74%) af K1-fodrede dyr, men forekomsten af bakteriæmi, meningitis og dødelighed var variabel og signifikant lavere end satserne for kolonisering. Den klonale natur af E. coli K1 eksperimentel infektion blev etableret senere 23, og det er nu klart, at kun O18: K1 og, i mindre grad, O7: K1 serotyper er i standtil konsekvent at forårsage systemisk infektion. Af denne grund er disse undersøgelser af patogenesen af neuropathogenic E. coli K1 var baseret på brugen af virulens-forstærket O18: K1 stamme A192PP. En sammenligning af E. coli K1 fodring af neonatale rotter ved en gastrisk slange, som anvendes af Glode og kolleger 22, og en dråbe fodring metode som ansat ved Achtman gruppe 23 afslørede store antal dødsfald ved hjælp af den tidligere metode, næsten helt sikkert på grund af skader på slimhindeoverflader ved gastrisk rør. Da satserne for kolonisering er sammenlignelige med disse to metoder, anbefales det at bruge mindre invasiv metode til at fodre bakterierne ved hjælp af en pipette med en steril spids, som er beskrevet i denne meddelelse.
E. coli-stamme A192PP brugt i vores studier er O18: K1. Det er en mere virulent derivat af den kliniske stamme E. coli A192, der oprindeligt blev udvundet fra en patient med sepsis 27 </sup>. Den øgede virulens af stammen blev opnået ved seriel passage gennem neonatale rotter 26. Stammen fremkalder en aldersbetinget sygdom sværhedsgrad, med 100% bakteriæmi og dødelighed, når det administreres til 2 dage gamle dyr 28. I modsætning 9 dage gamle dyr er fuldstændigt resistente over for sygdomme. K1-specifikke lytiske bakteriofager kan anvendes til at skelne E. coli K1 fra andre E. coli stammer 29. I denne undersøgelse, skal følsomheden af levedygtige bakterier til bakteriofag K1E anvendes til (i) at kontrollere renheden af E. coli K1 suspensioner parat til at blive fodret til dyrene, og (ii) at skelne E. coli K1 fra andre colibakterier for at beregne rentabiliteten i endetarmsåbning podninger, blod og vævsprøver. Hvis kolonien er E. coli K1, vil det være modtagelige for bakteriofag K1E lysis, og bakteriel vækst hæmmes ved stedet for bakteriofag inokulering. Hvis kolonien er ikke E. coli K1, vil det be resistente over for KIE bakteriofag lysis, og der bør være et område med bakterievækst i stedet for bakteriofag inokulering. Det skal erindres, at dyremodeller ikke kan afspejle alle funktioner af den naturligt forekommende sygdom. Den nuværende model kan modificeres til at undersøge virulens karakteristika som andre end E. neuropathogenic bakterier coli A192PP og variationer i størrelsen af den koloniserende inoculum kan imødekommes. Fremtidige anvendelser af teknikken kunne omfatte evaluering af tiltrængte lægemidler til at behandle den betingelse, og at afdække detaljerne i værtens respons på kolonisering og væv invasion.
Den her beskrevne metode er enkel, men effektiv. Single kuld på 10 – 12 unger blev ansat som test- eller kontrolgrupper og det inden-kuld tilgang sikrer en høj grad af reproducerbarhed og statistisk gyldighed. Det er bydende nødvendigt, at hvalpene kommer tilbage til deres naturlige mødre snarest muligt efter enhver procedure og kuld bør derfor ikke omfatte dyr, der forskellige indgreb. Det er vigtigt, at Fed inokulum opvarmes ellers hvalpene vil afvise den tilbudte kultur. Hvalpene hurtigt at udvikle en kompleks mikrobioter og inden for to dage efter fødslen mavetarmkanalen er koloniseret med en bred vifte af bakterier fra rækkerne etableret som de mest udbredte mikrober i spædbørn og voksne tarmen. Hvalpe, der ikke er blevet fodret E. coli A192PP ikke bære E. coli K1 i mavetarmkanalen 17 og så bestemmelse af satserne for kolonisering er forholdsvis ligetil. Imidlertid NEUS -baserede qPCR metode til påvisning kolonisere E. coli K1 er langt mere følsomme, at de traditionelle dyrkningsmetoder og anbefales kraftigt 17.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger G0400268 og MR / K018396 / 1 fra Medical Research Council, og ved aktion Medical Research. Yderligere støtte blev leveret af National Institute for Health Research University College London Hospitals Biomedical Research Centre.
Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) | Harlan, UK | www.harlan.com | |
E. coli K1 A192PP | Taylor lab | www.ucl.ac.uk | Mushtaq et al. 2004 |
Bacteriophage K1E | Taylor lab | www.ucl.ac.uk | Mushtaq et al. 2004 |
Glycerol | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | G5516 |
Mueller-Hinton Agar | Oxoid, UK | www.oxoid.com | CM0337 |
Mueller-Hinton Broth | Oxoid, UK | www.oxoid.com | CM0405 |
MacConkey Agar | Oxoid, UK | www.oxoid.com | CM0007 |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | P4417 |
Ethanol 100% | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | E7023 |
Heparin Sodium Salt | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | 84020 Prepare 20-50 units/ml |
RNAlater Solution | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | R0901 10µl/mg tissue |
Acetic Acid | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | 320099 |
Chloroform | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | C2432 |
Methanol | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | 322415 |
Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 11542483 |
Alcotip Swabs | Scientific Laboratory Supplies, UK | www.scientificlabs.co.uk | SWA1000 |
Petri dishes | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | P5856 |
30mL Universal Tube | AlphaLaboratories, UK | www.alphalabs.co.uk | CW3890 |
0.5ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | I1405-1500 |
1.5ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | I1415-1000 |
0.1µl calibrated loops | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | E1412-0112 |
L-shaped spreaders | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | E1412-1005 |
Cuvettes | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 10594175 |
Forceps straight with fine points | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12780036 |
Forceps straight with blunt tips | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12391369 |
Forceps watchmaker's curved with very fine points | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12740926 |
Scissors straight with very fine points | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12972055 |
Laboratory Scissors | VWR, UK | www.vwr.com | USBE4251 |
25g Syringe Needles | Greiner Bio-One Ltd | www.greinerbioone.com | N2525 |
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers | PerkinElmer, UK | www.perkinelmer.co.uk | L60000BB |
Unitemp Incubator | B&T, UK | OP958 | |
Multitron shaking incubator | INFORS HT, UK | www.infors-ht.com | AJ118 |
Ultra-Turrax T-10 homogenizer | IKA Werke | www.ika.com | 0003737000 |