Live-avbildning av<em> Drosophila</em> Pupal Eye
Summary
This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.
Abstract
Iboende prosesser av Drosophila pupal utvikling kan skifte og forvrenge øyet epitel på måter som gjør enkelte celle atferd vanskelig å spore under live celle bildebehandling. Disse fremgangsmåter omfatter: retinal rotasjon, cellevekst og organisme bevegelse. I tillegg bretter uregelmessigheter i topologien av epitel, inkludert subtile støt og ofte innført som puppe er forberedt for bildebehandling, gjør det utfordrende å skaffe i fokus bilder av mer enn noen få ommatidia i et enkelt fokusplanet. Arbeidsflyten skissert her remedier disse problemene, noe som gir enkel analyse av cellulære prosesser i løpet av Drosophila pupal øye utvikling. Passende-iscenesatt puppe er ordnet i en bilderigg som enkelt kan monteres i de fleste laboratorier Ubiquitin-DE-cadherin:. GFP og GMR-GAL4 -driven UAS-α-catenin: GFP brukes til å visualisere cellegrensene i øyet epitel 1 -3. Etter dekonvolvering erpåføres fluorescerende bilder tatt på flere fokalplanene maksimumsprojeksjonsbilder generert for hvert tidspunkt og forbedret ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. Justerings algoritmer brukes til raskt å stabilisere overflødig bevegelse, noe som gjør enkelte celle atferd lettere å spore.
Introduction
Forbindelsen Drosophila øye er karakterisert ved den stereotype arrangement av dets ~ 750 ommatidia adskilt av en honeycomb-gitteret av aksessoriske pigmentceller 4,5. Disse pigmentceller er mønstret av en koordinert kombinasjon av begivenheter: lokale celle bevegelser, cellevekst, endringer i cellen form, og apoptose. Live-visualisering av dette Epitel gjør det interessant å studere de molekylære mekanismene som ligger til grunn disse hendelsene i en fysiologisk relevant og uaffisert tredimensjonal sammenheng.
I motsetning til tidligere protokoller 6,7, den teknikk som er beskrevet her innbefatter en effektiv metode for stabilisering av ytre vev bevegelse som ikke kan være koplet fra avbildningsprosessen. Denne metoden forbedrer studier av celle oppførsel i utviklings Drosophila pupal øye epitel – en vev som vokser, roterer, og skift i løpet av bildebehandling. I tillegg motion-stabilisering teknikk debeskrevet her vil være nyttig for å studere celler i andre sammenhenger hvor overflødig bevegelse oppstår.
For å visualisere cellegrensene i Drosophila retinal feltet, ble transgene snørene generert som uttrykker ubi-DE-cadherin: GFP samt UAS-α-catenin: GFP under kontroll av øyet spesifikke driver GMR-GAL4 1-3. Bruken av to GFP-merket membranmarkører tillater visualisering av cellegrensene ved lavere intensitet lys. Dette reduserer vevsskade og fotobleking på gjentatt eksponering for høy energi bølgelengder, som gir økt bildefrekvens og film varighet. Å forbedre effekten av RNAi transgener, UAS-DCR-2 ble også innlemmet i en annen fluesnøre 8.
I en tredje oppdatering fra tidligere protokoller, er en enklere avbildning rigg som er lett å montere i de fleste laboratorier er beskrevet. Denne anordning eliminerer behovet for å ha en spesialisert avbildning rig generert av et universitet er "maskinverksted" eller lignende tjeneste. Denne bilderigg er lik den som brukes til bilde andre pupal vev 9,10.
Presenteres her er en enkel levende-cell imaging protokoll som kan brukes til å vurdere de morphogenetic hendelser som bidrar til øye mønster fra ~ 17-42 timer etter puparium dannelse (hr APF) direkte. Spesielt denne protokollen gjør det mulig å bestemme konsekvensene av å endre genuttrykk under pupal utvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrivelsen av vill type utvikling (over) danner grunnlag for sammenligninger av mønstrings hendelser i RNAi eller høyekspresjonsystemer genotyper. Sammenligninger av levende vev utvikling er uvurderlig når man skal avgjøre hvilke celle atferd er regulert av et protein av interesse. Videre, og som ikke er beskrevet her, live cell imaging gjør en til å gjøre kvalitative og / eller kvantitative beskrivelser av rollen av et gen av interesse i hendelsene som mønster øyet. Etter 30-32 timers APF fleste pigmentcelle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe | ||
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems | ||
References
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
