This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.
Biomaterials और ऊतक इंजीनियरिंग में रिसर्च अक्सर शुरू करने सेल नंबर का प्रारंभिक ज्ञान की आवश्यकता होती है जो कोशिका आधारित इन विट्रो जांच भी शामिल है। शोधकर्ताओं सामान्यतः उनके बोने घनत्व का संदर्भ जबकि यह जरूरी सवाल में सामग्री का पालन किया है कि कोशिकाओं की वास्तविक संख्या का संकेत नहीं है। यह विशेष रूप से मानक सेल संस्कृति में अच्छी तरह से प्लेटों के आधार कवर नहीं है कि सामग्री, या scaffolds के लिए मामला है। इस अध्ययन संस्कृति में 4 घंटे के बाद electrospun पाली (ε-caprolactone) यार्न पर एक ज्ञात संख्या में वरीयता प्राप्त मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं की प्रारंभिक लगाव की जांच। Electrospun यार्न 9 RPM, पेट्री डिश के भीतर रखा कम बंधन में अच्छी तरह प्लेटें और polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs में तैनात सेल संस्कृति आवेषण पर घूर्णन बायोरिएक्टर जहाजों सहित कई अलग सेट-अप के भीतर आयोजित की गई। बाद के दो एक प्रकार के बरतन प्लेट पर स्थिर शर्तों या तो अधीन करने के लिए या तैनात थे (30 <spaएन शैली = "font-size: 14px; रेखा से ऊंचाई: 28px;"> आरपीएम)। 37 ओ सी पर चार घंटा ऊष्मायन, 5% सीओ 2 के बाद, वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के स्थान सेल डीएनए परख द्वारा निर्धारित किया गया था। Scaffolds उनके कंटेनरों से हटा दिया है और lysis बफर में रखा गया था। मीडिया अंश इसी तरह हटा दिया है और centrifuged था – सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया और गोली lysis बफर के साथ टूट गया। Lysis बफर प्रत्येक गोदाम में जोड़ा, या अच्छी तरह से, और उपस्थित हो सकता है कि किसी भी कोशिकाओं को मुक्त करने scraped किया गया था। सेल डीएनए परख पाड़ के भीतर मौजूद कोशिकाओं, मीडिया और अच्छी तरह से अंशों का प्रतिशत निर्धारित की। सेल लगाव यार्न सेल संस्कृति आवेषण के भीतर आयोजित की और गति झटकों के अधीन के लिए सबसे बड़ा लगाव (30%) के साथ, सभी प्रयोगात्मक सेट अप के लिए कम था। इस अध्ययन पर ध्यान दिए बिना कहा सेल बोने घनत्व के scaffolds के लिए संलग्न कोशिकाओं की वास्तविक संख्या के लिए जागरूकता उठाती है।
Scaffolds नियमित तौर पर विकसित किया है और biomaterial और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए शोध किया जा रहा है। जैसे, वे आमतौर पर उदाहरण के लिए, सेल प्रसार और सेल नंबर निर्धारित कि assays के माध्यम विशेषता कोशिकाओं और उनके इन विट्रो व्यवहार के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। जैसे कि इन प्रयोगों के लिए, यह प्रारंभिक सेल नंबर से जाना जाता है कि जरूरी है और शोधकर्ताओं अक्सर मिलीलीटर या 2 सेमी प्रति कोशिकाओं की संख्या के मामले में बोने की एकाग्रता राज्य है। यह विशेष रूप से बड़े पैमाने अप प्रयोजनों के लिए अच्छा अभ्यास है, जबकि, यह (भी biomaterial सतह एक के चिपकने वाला गुणों पर निर्भर है) पाड़ सतह का पालन करना है कि कोशिकाओं की वास्तविक संख्या के लिए खाते में नहीं है। कोशिकाओं के निर्माण से दूर गिर सकता है और, की वजह से प्रयोग की अक्सर स्थिर प्रकृति के कारण, बौद्धिक अत्याधुनिक की सामग्री के साथ संपर्क में वापस आने के लिए कभी नहीं हो सकता क्योंकि यह सेल संस्कृति में अच्छी तरह से थाली के पूरे बेस कवर नहीं है कि scaffolds के लिए विशेष रूप से सच हैबाकी। Electrospun फाइबर यार्न अच्छी तरह से (चित्रा 1 ए) के आधार कवर नहीं करता है कि एक चबूतरा का एक अच्छा उदाहरण है। इस मामले में, सतह का इलाज नहीं किया गया है कि कम से बाध्यकारी अच्छी तरह प्लेटें थाली की सतह के लिए संलग्न है और इसलिए किसी भी अच्छी तरह से आधारित परख के परिणामों विकृत से कोशिकाओं को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
अच्छी तरह प्लेटें आसानी से scaffolds के पर सेल बोने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन वे उपलब्ध एकमात्र तरीका नहीं कर रहे हैं। रोटरी सेल संस्कृति सिस्टम, देर से 1980 में नासा में जीवन विज्ञान प्रभाग द्वारा विकसित बायोरिएक्टर का एक प्रकार है, इसी तरह नकली microgravity के साथ एक तीन आयामी (3 डी) पर्यावरण के भीतर scaffolds के बीज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बायोरिएक्टर इस प्रकार का दुनिया भर में शोधकर्ताओं के साथ एक लोकप्रिय विकल्प रहता है और, कोशिकाओं 4,5 और ऊतक इंजीनियरिंग 6,7 स्टेम सेल 2,3 संकेतन के लिए अध्ययन में शामिल किया गया है। क्या अच्छी तरह से प्लेटों के लिए बेहतर रोटरी बायोरिएक्टर बनाता रखरखाव हैअक्सर मामला है, dedifferentiating से विभेदित कोशिकाओं को रोकने में मदद करता है जो एक 3 डी वातावरण, की जब पारंपरिक 2D शर्तों 8 भीतर सुसंस्कृत।
यह पत्र एक 4 घंटे की अवधि के भीतर इन scaffolds के लिए संलग्न कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या को अधिकतम करने के क्रम में बोसवर्थ एट अल।, 9 में गढ़े रूप electrospun पाली (ε-caprolactone) फाइबर यार्न पर मानव mesenchymal स्टेम सेल बोने के लिए विभिन्न तकनीकों की जांच। 2D संस्कृति के लिए, यार्न सुरक्षित रूप से अच्छी तरह प्लेटें या कस्टम बनाया पाली (tetrafluoroethylene) (PTFE) troughs के भीतर आयोजित की गई और स्थिर शर्तों के तहत रखा है, या 30 rpm पर हिल। 3 डी संस्कृति के लिए, यार्न और कोशिकाओं 9 rpm पर घूर्णन बायोरिएक्टर वाहिकाओं के भीतर आयोजित की गई।
बायोपॉलिमरों से गढ़े Electrospun फाइबर matrices के लिए नियमित रूप से biomaterial और / या ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों 11,12 के लिए सेल लगाव और प्रसार का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इन मामलों में, matrices के आसानी से एक सेल संस्कृति में अच्छी तरह से थाली की पूरी आधार को कवर किया और इस प्रकार सेल लगाव जो सुधार वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के साथ पूर्ण संपर्क में हैं कि फाइबर की पतली शीट अक्सर होते हैं। हालांकि, biomaterial पाड़ पूरी तरह से अच्छी तरह से थाली के आधार कवर नहीं करता है, तो वरीयता प्राप्त कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा पाड़ के साथ संपर्क में नहीं रह जाएगा और अंत में संलग्न करने के लिए सक्षम नहीं होगा कि वहाँ एक उच्च मौका है। इस अध्ययन से भविष्य सेल आधारित प्रयोगों के लिए सिफारिश की जा सकती है कि एक अनुकूलित तकनीक का निर्धारण करने के क्रम में, अच्छी तरह से थाली के आधार कवर नहीं है कि मचान पर कोशिकाओं बोने के लिए कई अलग अलग तरीकों की जांच की।
पांच अलग सेट-अप (चित्रा 1) की जांच की गई: scaffoLDS (electrospun यार्न) कम बंधन में अच्छी तरह से प्लेटों के भीतर सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग कर आयोजित किया है और या तो स्थिर शर्तों के तहत रखा या 30 rpm पर हिल; 30 rpm पर संकीर्ण PTFE troughs के भीतर रखा जाता है और स्थिर आयोजित या हिल scaffolds के; और scaffolds के 9 rpm पर घूर्णन बायोरिएक्टर वाहिकाओं के अंदर रखे। सभी बोने सेट अप (चित्रा 2) के लिए कुर्की की एक कम प्रतिशत डीएनए परख द्वारा electrospun यार्न का पालन किया था कि कोशिकाओं की संख्या का प्रदर्शन निर्धारण; और यह आगे इलेक्ट्रॉन micrographs (SEM) (चित्रा 3) स्कैनिंग से पुष्टि की गई। महानतम सेल लगाव – 30% या ~ 18,060 कोशिकाओं सेल संस्कृति आवेषण के भीतर आयोजित की और निरंतर गति के अधीन थे कि यार्न के लिए मनाया -was। दिलचस्प है, सबसे कम सेल लगाव (15%) रेडियल गति का समावेश पाड़ के साथ संपर्क में कोशिकाओं रखने पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है सुझाव है कि जो सेल संस्कृति आवेषण द्वारा आयोजित लेकिन स्थिर शर्तों के तहत रखा यार्न, के लिए हासिल की थी। हालांकि,यह मीडिया के प्रवाह के निरंतर चक्कर SEM छवियों से मनाया सेल agglomerates के लिए जिम्मेदार हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। प्रकार के बरतन प्लेट इसकी सबसे कम सेटिंग पर स्थापित किया गया था – 30 RPM – इस सेट अप करने के लिए एक सीमा हो सकता है। एक धीमी रेडियल गति का प्रयोग रोकने के लिए या सेल ढेर को कम करने में मदद मिल सकती है और कोशिकाओं को कम बल का अनुभव करेंगे के रूप में भी सेल लगाव सुधार सकता है। भविष्य प्रयोगों में सुधार सेल लगाव के लिए आदर्श प्रकार के बरतन गति के अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए। दोनों स्थितियों में 18% लगाव (~ 10,836 कोशिकाओं) उपज के साथ एक इसी तरह की प्रवृत्ति में परिणाम नहीं था troughs के भीतर आयोजित यार्न के लिए प्रस्ताव शामिल; इस troughs के भीतर scaffolds के आंशिक प्रवर्तन के कारण हो सकता है, हालांकि वे आधार करने के लिए लंगर नहीं थे के रूप में (एक प्रकार के बरतन प्लेट पर रखा troughs के लिए मनाया गया)। सामग्री और पालन के साथ संपर्क में आने से गर्त की तह तक डूब चुके हैं कि किसी भी कोशिकाओं को रोकने जाएगा पाड़ की आंशिक चल। टी के लिएअपने विशेष सेट-अप, गर्त एक पेट्री डिश के भीतर रखे था और मीडिया के एक कुल 10 एमएल मात्रा गयी। गर्त के छोटे आयाम मीडिया के बहुमत पेट्री डिश के भीतर मौजूद है और किसी भी आंदोलन है, तो कोशिकाओं पेट्री डिश में दूर गर्त से बहाव और पाड़ की पहुंच से बाहर पूरी तरह से रह सकता है कि इसका मतलब है। इस से अवगत कराया scaffolds के लिए उनके प्रवर्तन और विशेष रूप से आंदोलन (रोकने चाहिए के रूप में इन सीमाओं को पार करने के लिए, आगे के प्रयोगों, scaffolds के सिरों बाँझ ठीक सुइयों का उपयोग troughs के आधार पर टिकी हैं जिससे प्रोटोकॉल में एक अतिरिक्त कदम शामिल होना चाहिए अंततः पाड़ संलग्न करने के लिए कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व चाहिए जो रेडियल गति),। कोशिकाओं के 16% रोटरी वाहिकाओं के भीतर मौजूद यार्न से जुड़ी थी। 3 डी संस्कृति के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक होने के बावजूद, समस्याओं शिथिल attac में हुई है जो हो सकता है 'जहाजों मुख्य बंदरगाह से scaffolds के हटाने के साथ पैदा हुआHED कोशिकाओं को खो दिया जा रहा है। पूरी तरह से इस समस्या को समाप्त होगा खोला जा सकता है कि वेसल्स; इन खरीद के लिए उपलब्ध हैं, लेकिन काफी इस अध्ययन में इस्तेमाल डिस्पोजेबल जहाजों की तुलना में अधिक महंगे हैं।
इस अध्ययन के मानक सेल संस्कृति में अच्छी तरह से प्लेटों के पूरे बेस कवर नहीं है कि scaffolds के बोने के साथ वर्तमान मुद्दों को दर्शाता है। एक ज्ञात सेल नंबर सीडिंग पालन करने के लिए सभी कोशिकाओं के लिए अनुमति पाड़ की सतह क्षेत्र होने के बावजूद, पाड़ के लिए एक तिहाई संलग्न की तुलना में कम हुई। यह एक संभावित भविष्य के चिकित्सा उपकरण के रूप में पाड़ साथ biocompatibility और सेल-सामग्री / सेल सेल व्यवहार और बातचीत का आकलन कर सकते हैं कि अन्य सेल आधारित assays में हानिकारक परिणाम हो सकते हैं। अध्ययन के आगे सीमाओं 4 घंटा समय बिंदु शामिल हो सकते हैं – प्रारंभिक सेल बोने सुनिश्चित करने के लिए काफी लंबे समय होने के बावजूद (कोशिकाओं को मजबूती से तीस मिनट 13,14,15 भीतर substrates के लिए संलग्न करने के लिए दिखाया गया है), उस में करने के लिए उचित हो सकता हैबाद में समय-अंक इस अन्यथा शुरू करने सेल नंबर तिरछा होता है के रूप में कोशिकाओं को एक लंबे समय-सीमा के दौरान पैदा करना नहीं है प्रदान करने vestigate। इस मामले में, 10 एमएल मीडिया की मात्रा को कम करने, भी कोशिकाओं और पाड़ के बीच संपर्क में सुधार और अंततः सेल लगाव बढ़ सकते हैं। भविष्य अध्ययनों से यह भी कोशिका क्षति और / या कोशिका मृत्यु 16 पैदा कर सकता है सेल बोने की प्रक्रिया के रूप में सेल व्यवहार्यता पर विचार करना चाहिए। इस तरह के एक लाइव / मृत परख, उदाहरण के लिए, व्यवहार्यता के स्तर पर प्रकाश डाला जाएगा के रूप में सेल डीएनए assays के, व्यवहार्य और अलाभकारी कोशिकाओं के बीच अंतर नहीं है।
यह जांच एक ज्ञात मात्रा बोने के बावजूद पाड़ के लिए देते हैं कि कोशिकाओं की वास्तविक संख्या के लिए जागरूकता उठाती है। कोशिकाओं की शुरुआती संख्या पर निर्भर है कि अध्ययन के लिए, यह शोधकर्ताओं ने पाया कि आंकड़े के कई तथ्य ब्याज की सब्सट्रेट करने के लिए पालन में क्या वास्तव में कैसे पता है कि अत्यधिक महत्वपूर्ण है।
The authors have nothing to disclose.
एमआरसी-DPFS अनुदान कोड G1000788-98812 – लेखक इस अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए चिकित्सा अनुसंधान परिषद को धन्यवाद और स्वीकार करना चाहते हैं।
Distilled water | in-house supply | n/a | |
Ethanol | Merck | 1117271000 | |
Phosphate Buffered Saline solution | Life Technologies | 70013016 | |
Human mesenchymal stem cells | PromoCell GmbH | C-12974 | |
MSC culture media | PromoCell GmbH | C-28010B | Warmed to 37 oC before use |
Supplement mix | PromoCell GmbH | C-39810 | Add to culture media |
Antibiotic/antimyotic mix | Sigma-Aldrich | A5955 | Add to culture media |
Trypsin (0.05 %) EDTA (0.02 %) | Sigma-Aldrich | 59417C | Warmed to 37 oC before use |
Cell culture flasks (T75) | Becton Dickinson Ltd | 353110 | |
Low binding 6-well plates | Costar Corning | 3471 | |
6-well CellCrowns | Scaffdex | C00003S | |
Petri-dish 50 ml deep | Sterilin | 124 | |
PTFE troughs | in-house production | n/a | |
Disposable RCCS vessels 10 ml | Synthecon | D-410 | |
4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor | Synthecon | RCCS-4DQ | |
Shaker plate | Stuart | SSM1 | Mini Orbital Shaker |
Haemocytometer | Digital Bio | DHC-F01 | Disposable C-Chip |
Centrifuge tube | Deltalab | 352096, 429901 | 15 ml and 50 ml |
Centrifuge | Hettich | Rotafix 32 A | |
Syringe 3 ml | Shield Medicare Ltd | 3039820 | |
Pipettes | Sterilin | 40305, 47310, 40125 | 5, 10 and 25 ml |
Gilson pipettes | SLS | F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 | P2 – P1000 |
Pipette tips | SLS | PIP7852, PIP7834, PIP7840 | |
Micro test tube 1.5 ml | Eppendorf | 30125.15 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
PicoGreen Assay | Invitrogen | P7589 | Assay set-up in the dark |
Black 96-well plate | Greiner Bio One | 655086 | |
Fluorescent plate-reader | BGM Labtech | FLUOstar Optima | |
Glutaraldehyde 25 % | TAAB Laboratories | G002 | Made to a concentration of 1.5 % v/v in PBS |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 999-97-3 | |
Aluminium stubs (SEM) | Agar Scientific | G301 | |
Carbon tabs (SEM) | Agar Scientific | G3347N | |
Gold sputter coater | Edwards | S150B | |
Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom World | Phenom Pro |