Abstract
מחקר לביו-חומרים והנדסת רקמות לעתים קרובות כולל במבחנה חקירות מבוססות תאים, אשר דורשות ידע ראשוני של מספר התאים מתחיל. בעוד חוקרים נפוצים התייחסות צפיפות הזריעה שלהם זה לא בהכרח מצביע על המספר האמיתי של תאים שדבקו בחומר מדובר. הדבר נכון במיוחד במקרה של חומרים, או פיגומים, שאינך מכסים את הבסיס של צלחות גם תרבית תאים סטנדרטית. מחקר זה חוקר את הקובץ המצורף הראשוני של תאי גזע אנושיים mesenchymal זורעים במספר ידוע על פולי electrospun (ε-caprolactone) חוט לאחר 4 שעות בתרבות. חוטי electrospun הוחזקו בתוך כמה סט-אפים שונים, כוללים כלי bioreactor מסתובבים בסל"ד 9, תרבות מוסיף תא ממוקם בצלחות נמוכות מחייבות היטב וpolytetrafluoroethylene שקתות (PTFE) ממוקמים בתוך צלחות פטרי. שני האחרונים היו נתונים לשני תנאים סטטיים או מיקומו על צלחת שייקר (30
Introduction
פיגומים באופן שיגרתי בשלבי פיתוח ומחקר ליישומים ביולוגי והנדסת רקמות. ככזה, הם זורעים בדרך כלל עם תאים וההתנהגות במבחנה שלהם מאופיינים באמצעות מבחני הקובעים שגשוג תאים ומספר תא, למשל. בניסויים כגון אלה, קיימים הכרח כי מספר התאים הראשוני ידוע ולעתים קרובות חוקרים לקבוע את ריכוז הזריעה במונחים של מספר התאים למ"ל או 2 סנטימטר. בזמן הזה הוא תרגול טוב, בעיקר למטרות בהיקף של עד, זה אינו לוקח בחשבון את המספר האמיתי של תאים שידבקו אל פני השטח הפיגום (שהוא גם תלוי במאפייני ההדבקה של פני השטח הביולוגי 1). הדבר נכון במיוחד עבור פיגומים שאינם מכסים את כל הבסיס של הצלחת גם תרבית התאים כמו תאים עלולים ליפול מהמבנה ו, בשל האופי לעתים קרובות סטטית של הניסוי, ייתכן שלעולם לא יחזרו במגע עם החומר של inteשאר. חוטי electrospun סיבים הם דוגמא טובה של פיגום שאינו מכסה את הבסיס של הבאר (איור 1 א). במקרה זה, יש להשתמש בצלחות גם מחייב נמוכים שלא היו שטופל פני השטח כדי למנוע מתאים הקשורים בשטח של הצלחת ולכן מעוותים את התוצאות של assay כל מבוסס היטב.
הצלחות גם משמשות בקלות לזריעת תאים על פיגומים, אבל הם לא השיטה היחידה זמינה. מערכות תרבית תאי רוטרי, סוג של bioreactor שפותח על ידי החטיבה למדעי החיים בנאס"א בשנת 1980 מאוחר, יכולות לשמש באופן דומה לזרע פיגומים בסביבה תלת-ממדית (3D) עם כביד מדומה. סוג זה של bioreactor עדיין בחירה פופולרית עם חוקרים ברחבי העולם וכבר שולב במחקרים לתא איתות 2,3, תאי גזע והנדסת רקמות 4,5 6,7. מה שעושה את bioreactor הסיבובי עדיף על צלחות גם הוא התחזוקהשל סביבת 3D, אשר מסייעת במניעת תאים מובחנים מdedifferentiating, כפי שקורה לעתים קרובות כאשר בתרבית בתוך תנאי 2D קונבנציונליים 8.
מאמר זה חוקר טכניקות שונות לזריעת תאי גזע mesenchymal אנושיים על פולי electrospun (ε-caprolactone) חוטי סיבים כמפוברקים בוסוורת 'et al., 9 במטרה למקסם את המספר הראשוני של תאים הקשורים בפיגומים האלה בתוך תקופה של 4 שעות. לתרבות 2D, חוטים נערכו באופן מאובטח בתוך צלחות גם או פולי מחוייט (tetrafluoroethylene) שקתות (PTFE) והמשיכו בתנאים סטטיים, או מזועזע ליום 30 בסל"ד. לתרבות 3D, חוטים ותאים הוחזקו בתוך כלי bioreactor מסתובבים בסל"ד 9.
Protocol
ייצור ועיקור 1.Scaffold
- לפזר PCL ב1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol לתת 10% w / v ריכוז. כפי שתואר בוסוורת 'ואח', 9 electrospin פתרון פולימרים (הפרמטרים: 20 kV, 1 מיליליטר / שעה, 20 סנטימטרים). ולאסוף מיושר סיבים על קצה mandrel מסתובב (600 סל"ד). עם אזמל להסיר את הסרט של סיבים שנאספו ואז לחתוך לאורכים קצרים יותר - 3 סנטימטר (לשקתות וכלי סיבוביים) ו- 4 סנטימטר (לתרבית תאים מוסיף) אורכים.
- בעזרת מלקחיים קנס להטביע רצועות בודדות במים מזוקקים ולהסיר.
- מחזיק שני הקצוות בין האגודל לאצבע; לסובב ידני את הרצועה עד שדומה חוט.
- בקצרה לצלול הפיגום דמוי חוט הזה במים מזוקקים ומניח על אי-סיבי כרטיס נקי, לייבוש.
- ברגע שיבש מקום, בנפרד בצינורות microcentrifuge נקיים ולהוסיף 1 מיליליטר של 50% אתנול v / v במים מזוקקים. סגור את המכסים ולהשאיר למשך 24 שעות.
הערה: בצע את השלבים תחת זרימה למינרית הבאה: - מניחים צינורות microcentrifuge בזרימה למינרית ולשאוב את פתרון v / v 50%. החלף עם 1 מיליליטר אתנול 70% v / v במים מזוקקים, קרובים מכסים ומשאירים למשך 24 שעות.
- חזור על פעולה עבור 90% ו 100% אתנול v / v במים מזוקקים (1 מיליליטר כרכים).
- לשטוף פיגומי פעמיים עם תמיסת מלח פוספט (PBS), 24 שעות לכל לשטוף (2 x 1 מיליליטר).
- הסר PBS ולהחליף עם תקשורת ותרבות תא 1 מיליליטר. הערה: פיגומים מוכנים לשעת שימוש לאחר 24.
2. קביעת שטח פן פיגום ומספר התאים
- באמצעות תוכנת ההדמיה מיקרוסקופ ואור, למדוד את הקוטר של חוט electrospun לאורכו כדי לקבוע ערך ממוצע.
- תניח חוט להיות מוט גלילי ולהתקרב לשטח פנים באמצעות:
- איפה פני שטח =, r = רדיוס וh = אורך
הערה: השטח היה מחושב להיות 18902, 800 מיקרומטר 2. יתר על כן, יש לציין כי השטח בפועל יהיה גדול יותר מחישוב זה כחוט מורכב ממאות סיבים עדינים, אשר יגדילו את שטח הפנים. כתוצאה מכך מספר גדול יותר של תאים צריך להיות מסוגל לצרף אל הגרדום. עם זאת, זה לא משפיע על השוואה ישירה בין קבוצות בדיקה שנעשית. - לקבוע את המספר המרבי של תאים שיכולים לצרף אל פני השטח הפיגום נחשף על ידי:
הערה: שימוש בתוכנת מיקרוסקופ והדמיה אור, הקוטר של תאי גזע mesenchymal האדם היה נחוש להיות 20 מיקרומטר (תאי הנחה הם עגולים), ולכן במקרה זה, מספר התאים = 60200.
3. פיגום Set-up - Cell תרבות תוספות (איור 1 א)
- תחת הזרימה למינרית, לפתוח את התרבות מוסיף תא 6-גם סטרילי ולהפריד את הטבעות קצרות עם שיניים מהגופים רחבות מוקפים.
- קח את הטבעת עם שיניים מצביעות כלפי מעלה. לעטוף אחדשל פיגומי 4 סנטימטרים מעל מרכז הטבעת לוודא שזה חופף בשני הצדדים. קח את הגוף ועמדה מוקפים על טבעת השיניים ופיגום ולדחוף כלפי מטה כדי לוודא שהפיגום נשאר בעמדה והשקרים דרך המרכז של להכניס את תרבית תאים.
- במקום להכניס תרבית תאים עם פיגום לתוך הבאר של היטב 6, צלחת מחייבת נמוכה.
- הוסף 10 מיליליטר של תקשורת בתרבות לפיגום.
4. פיגום Set-up - שוקת (איור 1)
- תחת הזרימה למינרית, פולי המקום (tetrafluoroethylene) (PTFE) שקתות לצלחות פטרי אישיות ולהוסיף 10 מיליליטר של תקשורת בתרבות לשוקת.
- בעזרת מלקחיים לעטוף אחד 3 פיגומי סנטימטרים לתוך השוקת, כדי לוודא שאורכו נמצא במקביל לקצה הארוך של השוקת.
5. פיגום Set-up - כלי Bioreactor (איור 1 ג)
- תחת הזרימה למינרית, להפריש 10 מיליליטר PBS סטרילי באמצעות כלי של bioreactorנמל ועיקרי להשאיר למשך 10 דקות.
- הסר את PBS ולהחליף עם תקשורת והתרבות 8 מיליליטר.
- בעזרת מלקחיים, להכניס אחד מפיגומי 3 סנטימטר לתוך הכלי דרך היציאה הראשית.
- סגור את הנמל הראשי.
ספירת 6. Cell
- תאי תרבות אנושיים גזע mesenchymal (hMSC) נגזרים ממח עצם על פי פרוטוקול עד למעבר 4 לפני קציר יצרן.
- לשאוב את התקשורת מסנטימטר 75 2 בקבוק המכיל hMSCs נגזר ממח עצם (קטע 4, confluency 80%).
- לשטוף את התאים עם PBS ולשאוב 10 מיליליטר סטרילי.
- הוסף 3 מיליליטר טריפסין ודגירת הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד התאים וחילצה ממשטח הבקבוק.
- להוסיף 7 מיליליטר תקשורת ותרבות כדי להשבית את האנזים ולהעביר נפח זה כולל (10 מיליליטר) לצינור צנטריפוגות.
- Resuspend השעיה תא זה על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים כדי לפזר הומוגנית תאים בתוךתקשורת וagglomerates תא גבול (10 פיפטה מיליליטר).
- הסר 20 μl של השעיה תא והעברה לhaemocytometer.
- הנח את haemocytometer תחת מיקרוסקופ אור ותמונה במטרת x10.
- פוקוס קווי הרשת ולספור את מספר התאים ב4 x 4 ריבועים בכל פינה של הרשת ואשר נופלים בתוך הריבוע ואלה החוצים את יד ימין או קו גבול תחתון. רוזן לכל סט של 4 x 4 ריבועים (4 סעיפים לרשת).
- חזור על ספירת resuspension ותא שלוש פעמים (שלבים 6.6-6.9).
- לחשב את ספירת תאים הממוצעת ולקבוע את עוצמת הקול של מדיה הנדרשת לresuspension תא (תא ריכוז 60200 ב -200 μl). לדוגמא, לקבוע את ספירת תאים הממוצעת מhaemocytometer ולאחר מכן לקבוע את המספר הממוצע הכולל של תאים משלושה סעיפים נפרדים. תכפיל את זה ב 1 x 10 4 לתת מספר התאים למ"ל, ואז להכפיל בנפח הכולל של השעיה תא לתת למספר הטל של תאים. השתמש בנוסחא הבאה כדי לקבוע נפח של תקשורת הנדרשת לresuspension:
- צנטריפוגה ההשעיה התא ב241 XG במשך 5 דקות.
זריעת 7. Cell
- לשאוב את התקשורת מצינור centrifuged עוזב את התא גלולה ולהחליף עם מחושב נפח התקשורת.
- Resuspend התאים והתקשורת אפילו לערבב.
- בעזרת פיפטה Gilson P200, לוותר לאט 200 μl של השעיה תא על כל פיגום על ידי הפעלת קצה פיפטה לאורך הפיגום ומתחת לפני השטח הנוזלי תקשורת. השאר באין מפריע במשך 20 דקות.
- לכלי bioreactor, לוותר 200 μl של השעיה תא דרך היציאה הראשית. Top-עד התקשורת נותרה 2 מיליליטר התרבות דרך יציאות המזרק כדי לתת נפח כולל של 10 מיליליטר.
8. ניסויי התחל
- העבר את כלי bioreactor לbioreactor RCCS-4DQ ולהגדיר כדי לסובב בשעה 9 בסל"ד.
- טראןספיר הצלחות גם עם התרבות מוסיף תא ושקתות לצלחת שייקר ולהגדיר כדי לסובב ב 30 סל"ד.
- העבר את הצלחות גם עם התרבות מוסיף תא ושקתות למדף של חממת תא נקבעה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (תרבות סטטית).
9. DNA Assay
- הכן פתרונות - מאגר תמוגה, מאגר 1x TE, תקני ה- DNA ופתרון עובד DNA תא - בהתאם להנחיות היצרן.
- לאחר 4 שעות, להסיר את הדגימות מהחממה ולמקם תחת הזרימה למינרית.
- הסר את השברים תקשורת מכל המדגמים ומניח בצינורות צנטריפוגה שכותרתו בנפרד. צנטריפוגה הצינורות 241 XG. הסר את supernatant ולהוסיף למאגר תמוגה 3 מיליליטר. Resuspend הפתרון להתפרקות התא גלולה.
- בעזרת מלקחיים להסיר את הפיגומים ומקום בצינורות צנטריפוגה המכילים 3 מיליליטר חיץ תמוגה (לפיגומים בתוך כלי bioreactor, להסיר את הפיגום לפני aspiratingקוטר). לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא, לשחרר ראשון פיגום על ידי חיתוך הפיגום בסמוך לשפת של insert באמצעות אזמל.
- הוסף 3 מיליליטר של חיץ תמוגה לכל כלי קיבול פיגום ולגרד את פני השטח (במרץ להתסיס לכלי bioreactor). הסר את מאגר תמוגה ומניח בצינורות צנטריפוגה שכותרתו בנפרד.
- מערבולת כל צינור צנטריפוגות במשך כ 1 דק 'על מנת להבטיח תסיסה מספקת של התאים וחיץ ולעודד תמוגה של קרום התא.
- בצלחת גם שחורה 96, להוסיף למאגר תמוגה 100 μl לכל חלק מדגם - פיגום, תקשורת וגם (לשכפל).
- בחושך, להוסיף של פתרון ה- DNA תא 100 μl לכל הבארות המכילות מאגר תמוגה ומערבבים בעדינות.
- כולל בארות עם חיץ תמוגה מכיל לא פתרון ה- DNA ו- DNA של התאים כדי לספק שליטה שלילית וחיובית לצלחת גם.
- שימוש בצלחת-קורא הקרינה, למדוד את הספיגה של הבארs באמצעות 485 ננומטר עירור ופליטת 520 ננומטר.
- להשוות את הנתונים עם עקומת הסטנדרט שנוצרה מתקני ה- DNA על פי הוראות היצרן.
10. סריקת אלקטרונים מיקרוסקופ קיבוע (SEM)
- בצע את השלבים הבאים תחת זרימה למינרית: לאחר 4 שעות, להסיר את כל הפיגומים מהקיבול והמקום שלהם בתוך צלחת 6-היטב חדשה (בארות נפרדות).
- לשטוף את הפיגומים פעמיים עם PBS.
- בצע את השלבים הבאים על הספסל הפתוח: כל אחד היטב, להוסיף 2 מיליליטר של 1.5% glutaraldehyde v / v בPBS, כדי להבטיח כיסוי של הפיגום מלא.
- השאר את הצלחת למשך 30 דקות מינימום ב 4 מעלות צלזיוס במשך קיבוע תא.
- הסר את הפתרון מקבע ולשטוף את הפיגומים פעמיים עם PBS.
- מייבש את הפיגומים עם הגדלת ריכוזים של אתנול במים מזוקקים מתחילה עם 50% v / v, ואחריו 70% v / v ו- 90% v / v. עבור כל ריכוז, submerse מלא הפיגומים בsolution (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 3 דקות. מחק את הפתרון וחזור.
- ליבש באתנול 100% על ידי submersing מלא הפיגומים בפתרון (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 5 דקות. מחק את הפתרון וחזור.
- כימי לייבש את הפיגומים באמצעות hexamethyldisilazane (HMDS) בתוך ארון קטר. לטבול את הפיגומים בHMDS (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 5 דקות. הסר את HMDS וחזור.
- הסר את HMDS ולאפשר הפיגומים לייבוש. הר הפיגומים של ספחי SEM זמינים מסחרי (במקרה זה ספחי נירוסטה עם כרטיסיות פחמן דבק).
- כדי להקל על הצפייה בSEM, מעיל הדגימות באמצעות coater זהב-גמגום למשך 2 דקות על מנת להבטיח כיסוי דק ואפילו.
- דגימות מקום בתוך SEM ולדמיין את פיגומי תא זרע באמצעות קרן אלקטרונים 5 קאב.
Representative Results
התוצאות מדגישות את מיקומם של התאים הבאים שלאחר זריעה 4 שעות לכל ניסיוני הגדרה נחקרו. איור 2 א ממחיש את אחוז התאים שמחוברים אל פני השטח הפיגום בתקופה זו. גורם המרה של 8.5 pg / תא משמש להמרת תוכן DNA נמדד במספר תא ובכך לקבוע את אחוז התאים 10. לכל להגדיר קופצים הזריעה נחקר, אחוז המצורף תא הוא נמוך יחסית, עם דבקות הגדולה תא (30%) לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא ומזועזע ליום 30 בסל"ד (הכנס אכר). הדבקות הנמוכה ביותר (15%) הייתה לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא וכל זמן תחת תנאים סטטיים (הכנס סטטי).
מספר גדול של תאים נכחו בתוך שבריר התקשורת (איור 2), בעיקר לתרבות מוסיף תא שנערך בתוך צלחות נמוכות מחייבות (הכנס סטטי) וכלי סיבוביים להיות 50% ו- 51%בהתאמה. פיגומים שנערכו בתוך השקתות הפגינו מספר גדל מתאים קיימים בתוך המחזיק עצמו - 48% מתאים לשוקת שאכר ו -50% לשוקת סטטי.
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אפשר הערכה חזותית של פיגומי תא-זרע (איור 3). נציג תמונות מודגשות נוכחות מוגבלת של תאים על פני השטח הסיביים, ללא קשר לזריעת הגדרה. עם זאת, מספר גדול יותר של תאים והתא agglomerates נכחו על הפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא ומזועזע ליום 30 בסל"ד (הכנס אכר).
איור 1. ניסיוני סט-אפ, שבו electrospun חוט מוחזק במסגרת; (א) מוסיף תרבית תאים וצלחת גם מחייב נמוך; פולי (B) (tetrafluoroethylene) שוקת (PTFE) וצלחת פטרי; ו(ג) כלי bioreactor. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מיקום 2. איור של תאים 4 שעות Post-זריעה על PCL electrospun חוטים באמצעות הגדר קופצים זריעה שונה. () מדגים את אחוז התאים שצורפו לפיגום PCL (ממוצע ± סטיית תקן); (ב) מדגיש את התפשטות אחוז מיקום תא בתוך שלושה שברים - תקשורת, גם ופיגום (n = 4, הנתונים שהוצגו כ אומר ערכים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. הנציגים micrographs אלקטרונים סורק עבור PCL חוטים electrospun עם תאי גזע mesenchymal האדם, 4 שעות לאחר זריעה ראשונית באמצעות ניסיוני סט-אפים שונים. (כל התמונות בהגדלה 1,000X, סרגל קנה מידה = 130 מיקרומטר.) אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
מטריצות סיבי electrospun מפוברקות מbiopolymers משמשות באופן קבוע כדי לתמוך מצורף תא ושגשוג עבור יישומים ביולוגי ו / או הנדסת רקמות 11,12. במקרים אלה, המטריצות הן לעתים קרובות סדינים דקים של סיבים בקלות לכסות את כל הבסיס של צלחת גם תרבית תאים ובכך נמצאים בקשר מלא עם תאי זרע אשר משפר מצורף תא. עם זאת, אם הפיגום הביולוגי אינו מכסה את הבסיס של הצלחת גם באופן מלא, יש סיכוי גבוה שחלק גדול מתאי זרע לא יישאר במגע עם הפיגום וסופו של דבר לא תוכל לצרף. מחקר זה בדק כמה שיטות שונות לזריעת תאים על פיגומים שאינך מכסים את הבסיס של הצלחת גם, על מנת לקבוע טכניקה מותאמת שיכול להיות מומלצת לניסויים מבוססי תאי עתיד.
חמישה סט-אפים שונים נחקרו (איור 1): scaffoLDS (חוט electrospun) שנערך באמצעות מוסיף תרבית תאים בתוך צלחות גם מחייב נמוכים וגם כל הזמן תחת תנאים סטטיים או מזועזע ליום 30 בסל"ד; פיגומים ממוקמים בתוך שקתות PTFE צרות והחזיקו סטטי או מזועזעים ליום 30 בסל"ד; ופיגומים שוכנו בתוך כלי bioreactor מסתובבים בסל"ד 9. קביעת מספר התאים שדבקו בחוטי electrospun ידי assay DNA הוכיח אחוז נמוך של קובץ מצורף לכל להגדיר קופצים זריעה (איור 2); וזה אושר גם מסריקת micrographs אלקטרונים (SEM) (איור 3). קובץ מצורף גדול תא - 30% או ~ 18060 תאים ד"ר גינזבורג נצפה לחוטים שהוחזקו בתוך התרבות מוסיף תא ונתונים לתנועה רציפה. מעניין, קובץ מצורף הנמוך ביותר תא (15%) הושג עבור חוטים שנערכו על ידי התרבות מוסיף תא אבל כל הזמן תחת תנאים סטטיים, אשר הייתי מציע כי הכללת תנועת רדיאלי יש השפעה חיובית על שמירת תאים במגע עם הפיגום. עם זאת,יש לציין כי מלקחיים רציפים של הזרימה של התקשורת עשויים להיות אחראים לagglomerates התא נצפה מתמונות SEM. הצלחת שייקר נקבעה על ההגדרה הנמוכה ביותר שלה - 30 סל"ד - אשר יכולה להיות מגבלה להגדרה זו. בתנועות איטיות רדיאלי עשויה לעזור למנוע או להפחית את מסכת תא וגם יכול לשפר מצורף תא כמו תאים חווים פחות כוח. ניסויים עתידיים צריכים להתמקד באופטימיזציה של המהירות שייקר האידיאלית עבור קובץ מצורף תא משופר. שילוב תנועה לחוטים שנערכו בתוך השקתות לא הביא למגמה דומה, עם שני תרחישי מניב קובץ מצורף 18% (~ 10836 תאים); למרות שזה יכול להיות בגלל הציפה החלקית של הפיגומים בתוך השקתות (נצפה לשקתות מונחות על הצלחת שייקר) כפי שהם אינם מעוגנים לבסיס. צף חלקי של הפיגום ימנע את כל תאים ששקעו לתחתית השוקת מלבוא במגע עם החומר והדבקות. לtההגדרה המסוימת שלו, השוקת שכנה בתוך צלחת פטרי וסך הכל 10 מיליליטר נפח התקשורת הוסיף. הממדים הקטנים של השוקת אומר כי הרוב המכריע של התקשורת קיים בתוך צלחת פטרי ואם יש תנועה, תאים עשויים להתרחק מן השוקת לצלחת פטרי ולהישאר לגמרי מחוץ להישג ידם של הפיגום. כדי להתגבר על מגבלות אלה, ניסויים נוספים צריכים לכלול צעד נוסף בפרוטוקול, לפיה את הקצוות של הפיגומים שהוצמדו לבסיס של השקתות באמצעות קנס-מחטים סטריליות, כיוון שזו צריכה למנוע הציפה והתנועה (במיוחד שלהם לפיגומים החשופים ל תנועת רדיאלי), שסופו של דבר צריך להוביל לעלייה במספר התאים הקשורים בפיגום. 16% מתאים שמחוברים לחוטים הנוכחיים בתוך כלי סיבוביים. למרות היותו טכניקה מבוססת היטב לתרבות 3D, בעיות לא מתעוררות עם הסרת פיגומים מהנמל העיקרי של כלי, אשר עשויים להסתיים באופן רופף ATTACתאי הד לאיבוד. כלי שניתן לפתוח באופן מלא היה למנוע את הבעיה; אלה זמינים לרכישה, אבל הם הרבה יותר יקרים מאשר כלי חד פעמי המשמשים במחקר זה.
מחקר זה מדגים את הבעיות הנוכחיות עם זריעת פיגומים שאינם מכסים את כל הבסיס של צלחות גם תרבית תאים סטנדרטית. זריעת מספר תא ידוע הביאה פחות מ מצרף שלישית לפיגום, למרות שטח הפנים של הפיגום המאפשרים לכל התאים לדבוק. לכך יכולה להיות השלכות מזיקות במבחנים מבוססי תאים אחרים שעשויים להעריך את ההתאמה הביולוגית ותא-חומר / תאי תאי ההתנהגות ואינטראקציות עם הפיגום כהתקן רפואי עתידי אפשרי. מגבלות נוספות של המחקר עשויות לכלול את נקודת זמן 4 שעות - למרות היותו מספיק זמן כדי להבטיח זריעת תאים ראשונית (תאים הוכחו לצרף היטב למצעים בתוך שלושים דקות 13,14,15), זה עשוי להיות סביר בvestigate נקודות הזמן מאוחר יותר מתן תאים אינם מתרבים במסגרת זמן ארוכה יותר כמו זה שאחרת להטות את מספר התא מתחיל. הקטנת הנפח של תקשורת, במקרה זה 10 מיליליטר, יכול גם לשפר את הקשר בין התאים והפיגום וסופו של דבר להגדיל את קובץ מצורף תא. מחקרים עתידיים צריכים לקחת בחשבון גם את כדאיויות תא כתהליך של זריעת תאים יכול לגרום לניזק לתאים ו / או תא מות 16. מבחני DNA התא אינם מבחינים בין תאי קיימא ולא ברי קיימא, כמו assay מת / כגון חי, למשל, הייתי להדגיש את רמת הכדאיות.
חקירה זו מעלה את מודעות למספר האמיתי של תאים שמייחסים לפיגום למרות זריעת כמות ידועה. ללימודים המסתמכים על מספר ההתחלה של תאים, חשוב מאוד שחוקרים יודעים בדיוק כמה של דמות שאכן לדבוק במצע של עניין.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות וללהכיר במועצה למחקר הרפואית למימון מחקר זה - G1000788-98812 קוד מענק MRC-DPFS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled water | in-house supply | n/a | |
| Ethanol | Merck | 1117271000 | |
| Phosphate Buffered Saline solution | Life Technologies | 70013016 | |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell GmbH | C-12974 | |
| MSC culture media | PromoCell GmbH | C-28010B | Warmed to 37 oC before use |
| Supplement mix | PromoCell GmbH | C-39810 | Add to culture media |
| Antibiotic/antimyotic mix | Sigma-Aldrich | A5955 | Add to culture media |
| Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%) | Sigma-Aldrich | 59417C | Warmed to 37 °C before use |
| Cell culture flasks (T75) | Becton Dickinson Ltd | 353110 | |
| Low binding 6-well plates | Costar Corning | 3471 | |
| 6-well CellCrowns | Scaffdex | C00003S | |
| Petri-dish 50 ml deep | Sterilin | 124 | |
| PTFE troughs | in-house production | n/a | |
| Disposable RCCS vessels 10 ml | Synthecon | D-410 | |
| 4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor | Synthecon | RCCS-4DQ | |
| Shaker plate | Stuart | SSM1 | Mini Orbital Shaker |
| Haemocytometer | Digital Bio | DHC-F01 | Disposable C-Chip |
| Centrifuge tube | Deltalab | 352096, 429901 | 15 ml and 50 ml |
| Centrifuge | Hettich | Rotafix 32 A | |
| Syringe 3 ml | Shield Medicare Ltd | 3039820 | |
| Pipettes | Sterilin | 40305, 47310, 40125 | 5, 10 and 25 ml |
| Gilson pipettes | SLS | F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 | P2 - P1000 |
| Pipette tips | SLS | PIP7852, PIP7834, PIP7840 | |
| Micro test tube 1.5 ml | Eppendorf | 30125.15 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| PicoGreen Assay | Invitrogen | P7589 | Assay set-up in the dark |
| Black 96-well plate | Greiner Bio One | 655086 | |
| Fluorescent plate-reader | BGM Labtech | FLUOstar Optima | |
| Glutaraldehyde 25% | TAAB Laboratories | G002 | Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 999-97-3 | |
| Aluminium stubs (SEM) | Agar Scientific | G301 | |
| Carbon tabs (SEM) | Agar Scientific | G3347N | |
| Gold sputter coater | Edwards | S150B | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom World | Phenom Pro |
References
- Jauregui, H. O. Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells. ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33 (2), 66-74 (1986).
- Puca, A., Russo, G., Giordano, A. Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's. Oncotarget. 3 (4), 426 (2012).
- Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway. Annals of biomedical engineering. 33 (10), 1405-1410 (2005).
- Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells. Cellular Reprogramming. 15 (5), 443-458 (2013).
- Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Molecular biotechnology. 54 (2), 331-336 (2013).
- Wang, Y., et al. Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds. Tissue Engineering Part A. 18 (21-22), 2376-2385 (2012).
- Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering. Clinical Orthopaedics and Related Research. 471 (8), 2422-2433 (2013).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), F12-F25 (2001).
- Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24 (6), 1605-1614 (2011).
- Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds. Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 757-767 (2011).
- Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels. Biomaterials. 35 (9), 2713-2719 (2014).
- Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro. Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).
- Yavin, E., Yavin, Z. Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface. The Journal of cell biology. 62 (2), 540-546 (1974).
- Chen, H. Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (21), 10148-10152 (1994).
- Grant, D. S., Tashiro, K. -I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro. Cell. 58 (5), 933-943 (1989).
- Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization. Biotechnology and bioengineering. 64 (5), 580-589 (1999).
