This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.
Forskning kring biomaterial och vävnadsteknik inkluderar ofta cellbaserade in vitro undersökningar som kräver initial kunskap om startcellnummer. Medan forskarna refererar ofta deras sådd täthet detta inte nödvändigtvis indikerar det faktiska antalet celler som har anslutit sig till det aktuella materialet. Detta är särskilt fallet för material, eller byggnadsställningar, som inte täcker basen av standardcellodlingsbrunnsplattor. Denna studie undersöker den inledande infästning av mänskliga mesenkymala stamceller sådda på ett känt antal på electrospun poly (ε-kaprolakton) garn efter 4 tim i kultur. Elektrospunna garner hölls inom flera olika uppställningar, inklusive bioreaktor fartyg som roterar med 9 rpm, cellodlingsinlägg placerade i låga bindningsbrunnsplattor och polytetrafluoretylen (PTFE) tråg placerade inom petriskålar. De senare två utsattes för antingen statiska betingelser eller placerade på en skakapparat platta (30 <span style = "font-size: 14px; line-height: 28px;"> rpm). Efter 4 h inkubation vid 37 ° C, 5% CO2, var platsen för sådda celler bestämdes genom cell-DNA-analys. Ställningar togs bort från sina behållare och placeras i lyseringsbuffert. Medierna fraktionen liknande avlägsnades och centrifugerades – supernatanten kastades och pelleten bryts upp med lysbuffert. Lysis-buffert sattes till varje kärl, eller väl, och skrapades för att frigöra eventuella celler som kan finnas närvarande. Den cell-DNA-analysen bestämdes den procentuella andelen celler som finns inom byggnadsställning, media och brunns fraktioner. Cellfäste var låg för alla experimentella uppställningar, med störst fäste (30%) för garner som hålls inom cellodlingsinlägg och utsätts för skakningar rörelse. Denna studie lyfter medvetenhet till det faktiska antalet celler som är förenade med ställningar oavsett den angivna cellsåddtäthet.
Byggnadsställningar rutinmässigt utvecklas och forskat för biomaterial och vävnadstekniska tillämpningar. Som sådana är de vanligen ympats med celler och deras in vitro beteende kännetecknas genom analyser som bestämmer celltillväxt och cellnummer, till exempel. För experiment som dessa, är det absolut nödvändigt att den initiala cellantalet är känd och forskare uppger ofta sådd koncentrationen i fråga om antalet celler per ml eller cm 2. Även om detta är en bra metod, speciellt för uppskalningsändamål, betyder inte hänsyn till det faktiska antalet celler som vidhäftar till ställningen yta (som också är beroende av de vidhäftande egenskaperna hos biomaterialytan 1). Detta gäller särskilt för byggnadsställningar som inte täcker hela basen av cellodlings brunnar som celler kan falla bort från konstruktionen och, på grund av den ofta statiska karaktären av experimentet, kan aldrig komma tillbaka i kontakt med materialet för integrevila. Electrospun fibergarn är ett bra exempel på en byggnadsställning som inte täcker basen av brunnen (Figur 1A). I detta fall bör låg bindningsbrunnsplattor som inte har ytbehandlats användas för att förhindra celler från att fästa till plattans yta och därmed snedvrida resultaten av eventuella väl baserad analys.
Brunnars plattor är lätt användas för cellsådd på byggnadsställningar, men de är inte den enda metod som finns tillgänglig. Roterande cellodlingssystem, en typ av bioreaktor utvecklats av Life Sciences Division på NASA i slutet av 1980-talet, kan på liknande sätt användas till utsäde byggnadsställningar inom en tredimensionell (3D) miljö med simulerad tyngdlöshet. Denna typ av bioreaktor förblir ett populärt val med forskare över hela världen och har införlivats i studier för cellsignalering 2,3, stamceller 4,5 och tissue engineering 6,7. Vad gör den roterande bioreaktor föredra framför brunnsplattor är underhålletav en 3D-miljö, vilket bidrar till att förhindra differentierade celler från dedifferentiating, vilket ofta är fallet när de odlas inom konventionella 2D förhållanden 8.
Denna uppsats undersöker olika tekniker för sådd mänskliga mesenkymala stamceller på electrospun poly (ε-kaprolakton) fibertrådar som tillverkas i et al. Bosworth, 9 för att maximera den initiala antalet celler som är knutna till dessa ställningar inom en 4 h period. För 2D kultur, har garner säkert hållas inom brunnsplattor eller skräddarsydda poly (tetrafluoroeten) (PTFE) tråg och hållas under statiska förhållanden, eller skakas vid 30 rpm. För 3D kultur ades garn och celler hållas inom bioreaktor fartyg som roterar med 9 rpm.
Elektrospunna fibermatriser tillverkade av biopolymerer regelbundet används för att stödja cellbindning och spridning för biomaterial och / eller vävnadstekniska tillämpningar 11,12. I dessa fall, matriserna är ofta tunna blad av fibrer som lätt täcker hela basen av ett cellodlingsbrunnsplatta och sålunda är i fullständig kontakt med sådda celler som förbättrar cellvidhäftning. Men om biomaterial ställningen inte helt täcker basen av brunnar, det finns en stor chans att en stor andel av de sådda cellerna inte kommer att stanna i kontakt med byggnadsställningen och i slutändan inte kommer att kunna fästa. Denna studie undersökte flera olika metoder för sådd celler på byggnadsställningar som inte täcker basen av brunnar, i syfte att fastställa en optimerad teknik som kan rekommenderas för framtida cellbaserade experiment.
Fem olika uppställningar undersöktes (Figur 1): scaffolds (electrospun garn) höll med hjälp cellodlingsinlägg inom låga bindningsbrunnsplattor och antingen hållas under statiska förhållanden eller skakas vid 30 rpm; byggnadsställningar placerade inom snäva PTFE dalar och höll statisk eller skakas vid 30 rpm; och byggnadsställningar inrymt inuti bioreaktor fartyg som roterar med 9 rpm. Bestämmande av antalet celler som hade anslutit sig till de elektrospunna garner genom DNA-analys visade en låg andel av fäste för alla sådd uppställningar (Figur 2); och detta bekräftades ytterligare från svepelektronmikrofotografier (SEM) (figur 3). Greatest cellvidhäftningen – 30% eller ~ 18.060 celler -var observerats för garner som hölls inom cellodlingsinlägg och utsätts för kontinuerlig rörelse. Intressant var lägst cellbindning (15%) uppnås för garner som innehas av cellodlingsinlägg men hålls under statiska förhållanden, vilket skulle tyda på att införandet av radiell rörelse har en positiv effekt på att hålla cellerna i kontakt med byggnadsställningen. EmellertidDet bör noteras att kontinuerlig cirklande av medias flöde kan vara ansvarig för cell agglomerat observerade från SEM-bilder. Den shaker plattan sattes på sin lägsta inställning – 30 rpm – vilket skulle kunna vara en begränsning till denna uppsättning. Med användning av en långsammare radiell rörelse kan bidra till att förhindra eller minska cell agglomerering och skulle också kunna förbättra cellvidhäftning som celler kommer att uppleva mindre kraft. Framtida experiment bör fokusera på att optimera den ideala shaker hastighet för bättre cellbindning. Införliva förslag till garn som hålls inom de dalar resulterade inte i en liknande trend, med båda scenarierna ger 18% fäste (~ 10.836 celler); även om detta kan bero på den partiella flyt av byggnadsställningar inom trågen (observeras för tråg placerade på shaker plattan), eftersom de inte var förankrade till basen. Partiell flytning av byggnadsställningen kommer att förhindra eventuella celler som har sjunkit till botten av tråget från att komma i kontakt med materialet och vidhäftning. För thans särskilda uppsättning, var tråget inrymd i en petriskål och en total 10 ml volym av medium tillsattes. De små dimensionerna hos tråget innebär att majoriteten av medierna är närvarande inuti petriskålen och om det finns någon rörelse, kan celler glida iväg från tråget in i petriskål och förbli helt utom räckhåll för byggnadsställningen. För att övervinna dessa begränsningar, bör ytterligare experiment inkluderar ett extra steg i protokollet, varvid ändarna av byggnadsställningar är uppsatt på basen av tråg som använder sterila fin-nålar, eftersom detta skulle hindra deras flyt och rörelse (särskilt för byggnadsställningar utsatta för radiell rörelse), vilket i slutändan skulle leda till ett ökat antal celler som är knutna till schavotten. 16% av cellerna hade fäst trådarna som finns inom de roterande kärl. Trots att en väl etablerad teknik för 3D kultur, gjorde uppstår problem med avlägsnande av byggnadsställningar från fartygens huvudport, vilket kan ha lett till löst attacHed celler går förlorade. Fartyg som kan öppnas helt skulle eliminera detta problem; dessa är tillgängliga att köpa, men är betydligt dyrare än de engångs fartyg som används i denna studie.
Denna studie visar de aktuella frågor med sådd byggnadsställningar som inte täcker hela basen av standardcellodlingshålsplattor. Sådd ett känt cell nummer resulterade i mindre än en tredjedel är knuten till schavotten, trots ställningen s yta möjliggör för alla celler att hålla sig. Detta skulle kunna få negativa konsekvenser i andra cellbaserade analyser som kan bedöma biokompatibilitet och cellmaterial / cell-cell beteende och samspel med ställningen som en potentiell framtida medicinteknisk produkt. Ytterligare begränsningar av studien kan omfatta 4 h tidspunkt – trots att tillräckligt lång för att säkerställa initiala cellsådd (celler har visat sig ordentligt fästa vid substrat inom trettio minuter 13,14,15), kan det vara rimligt att itesta själva senare tidpunkter som ger celler inte föröka under en längre tidsram, eftersom detta annars skulle skeva startcellnummer. Att minska volymen av media, i detta fall 10 ml, även skulle kunna förbättra kontakten mellan cellerna och byggnadsställning och i slutändan öka cellbindning. Framtida studier bör också överväga cellviabiliteten som processen att cellsådd kan orsaka cellskador och / eller celldöd 16. Cell DNA-analyser gör ingen skillnad mellan livskraftiga och icke livsdugliga celler, som sådan en levande / död analys, till exempel, skulle lyfta nivån på lönsamheten.
Denna undersökning ökar medvetenheten till det faktiska antalet celler som fäster till schavotten trots sådd en känd kvantitet. För studier som är beroende av utgångs antalet celler, är det mycket viktigt att de forskare veta exakt hur många av denna omsättning gör faktiskt vidhäfta till substratet av intresse.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka och erkänna det medicinska forskningsrådet för att finansiera denna forskning – MRC-DPFS bidrag koden G1000788-98812.
Distilled water | in-house supply | n/a | |
Ethanol | Merck | 1117271000 | |
Phosphate Buffered Saline solution | Life Technologies | 70013016 | |
Human mesenchymal stem cells | PromoCell GmbH | C-12974 | |
MSC culture media | PromoCell GmbH | C-28010B | Warmed to 37 oC before use |
Supplement mix | PromoCell GmbH | C-39810 | Add to culture media |
Antibiotic/antimyotic mix | Sigma-Aldrich | A5955 | Add to culture media |
Trypsin (0.05 %) EDTA (0.02 %) | Sigma-Aldrich | 59417C | Warmed to 37 oC before use |
Cell culture flasks (T75) | Becton Dickinson Ltd | 353110 | |
Low binding 6-well plates | Costar Corning | 3471 | |
6-well CellCrowns | Scaffdex | C00003S | |
Petri-dish 50 ml deep | Sterilin | 124 | |
PTFE troughs | in-house production | n/a | |
Disposable RCCS vessels 10 ml | Synthecon | D-410 | |
4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor | Synthecon | RCCS-4DQ | |
Shaker plate | Stuart | SSM1 | Mini Orbital Shaker |
Haemocytometer | Digital Bio | DHC-F01 | Disposable C-Chip |
Centrifuge tube | Deltalab | 352096, 429901 | 15 ml and 50 ml |
Centrifuge | Hettich | Rotafix 32 A | |
Syringe 3 ml | Shield Medicare Ltd | 3039820 | |
Pipettes | Sterilin | 40305, 47310, 40125 | 5, 10 and 25 ml |
Gilson pipettes | SLS | F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 | P2 – P1000 |
Pipette tips | SLS | PIP7852, PIP7834, PIP7840 | |
Micro test tube 1.5 ml | Eppendorf | 30125.15 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
PicoGreen Assay | Invitrogen | P7589 | Assay set-up in the dark |
Black 96-well plate | Greiner Bio One | 655086 | |
Fluorescent plate-reader | BGM Labtech | FLUOstar Optima | |
Glutaraldehyde 25 % | TAAB Laboratories | G002 | Made to a concentration of 1.5 % v/v in PBS |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 999-97-3 | |
Aluminium stubs (SEM) | Agar Scientific | G301 | |
Carbon tabs (SEM) | Agar Scientific | G3347N | |
Gold sputter coater | Edwards | S150B | |
Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom World | Phenom Pro |