This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.
Forskning i biomaterialer og tissue engineering omfatter ofte cellebaserede in vitro undersøgelser, som kræver indledende kendskab til start celletal. Mens forskere almindeligvis henvise deres seeding tæthed dette betyder ikke nødvendigvis, det faktiske antal celler, som har tiltrådt det pågældende materiale. Dette er især tilfældet for materialer, eller stilladser, der ikke dækker bunden af standard cellekultur brøndsplader. Denne undersøgelse undersøger den oprindelige binding af humane mesenkymale stamceller podet ved et kendt antal på elektrospindes poly (ε-caprolacton) garn efter 4 timer i kultur. Elektrospundne garn blev holdt inden for flere forskellige opsætninger, herunder bioreaktor fartøjer roterende på 9 rpm, cellekultur skær placeret i lave bindende brønde og polytetrafluorethylen (PTFE) trug placeret inden petriskåle. De to sidstnævnte blev udsat for enten statiske betingelser eller anbringes på et rysteapparat (30 <span style = "font-size: 14px; line-height: 28px;"> rpm). Efter 4 timers inkubation ved 37 ° C, 5% CO 2 blev placeringen af sederede celler bestemt ved celle-DNA-assay. Stilladser blev fjernet fra deres containere og placeres i lysisbuffer. Fraktion Mediet blev ligeledes fjernet og centrifugeret – supernatanten blev kasseret og pellet brudt op med lysisbuffer. Lysis buffer blev tilsat til hver beholder, eller godt, og skrabet for at frigøre eventuelle celler, der kan være til stede. Den celle-DNA-assay bestemmes procentdelen af celler til stede i stilladset, medier og godt fraktioner. Cellebinding var lav for alle eksperimentelle set-ups, med størst tilknytning (30%) for garn, der holdes inden cellekultur skær og underkastet ryste bevægelse. Denne undersøgelse skaber opmærksomhed til det faktiske antal af celler knyttet til stilladser uanset den angivne cellepodning tæthed.
Stilladser rutinemæssigt udvikles og forsket i biomateriale og vævsmanipulering applikationer. Som sådan er de sædvanligvis podet med celler og deres in vitro adfærd kendetegnet via assays, der bestemmer celleproliferation og celleantal, f.eks. For eksperimenter som disse, er det bydende nødvendigt, at den oprindelige celle nummer er kendt og forskere ofte angiver koncentrationen såning med hensyn til antallet af celler pr ml eller cm2. Mens dette er god praksis, især til opskalering formål, betyder det ikke højde for det faktiske antal celler, som klæber til stillads overflade (som også er afhængig af klæbeegenskaber biomaterialeoverfladen 1). Dette er især sandt for stillads, som ikke dækker hele bunden af cellekultur brøndsplade som celler kan falde væk fra konstruktionen, og på grund af den ofte statiske karakter af eksperimentet, kan aldrig komme tilbage i kontakt med materialet af intehvile. Elektrospundne fibergarner er et godt eksempel på et stillads, der ikke dækker bunden af brønden (figur 1A). I dette tilfælde bør lave bindende brøndsplader som ikke har været overfladebehandlet anvendes til at forhindre celler i at hæfte på pladens overflade og dermed fordreje resultaterne af en godt assay.
Brøndsplader let anvendes til cellepodning på stilladser, men de er ikke den eneste metode til rådighed. Rotary celledyrkningssystemer, en type bioreaktor udviklet af Life Sciences Division at NASA i slutningen af 1980, kan ligeledes anvendes til at pode stilladser inden for en tre-dimensionelle (3D) miljø med simuleret vægtløshed. Denne type bioreaktor er stadig et populært valg med forskere fra hele verden og er blevet indarbejdet i undersøgelser for celle signalering 2,3 stamceller 4,5 og tissue engineering 6,7. Hvad gør roterende bioreaktor foretrække at brøndsplader er opretholdelsenaf et 3D-miljø, som hjælper med at forhindre differentierede celler fra dedifferentiating, som det ofte er tilfældet, når de dyrkes i konventionelle 2D betingelser 8.
Dette papir undersøger forskellige teknikker til podning humane mesenchymale stamceller på elektrospundet poly (ε-caprolacton) fibergarner som fremstillet i Bosworth et al., 9 for at maksimere det oprindelige antal af celler knyttet til disse scaffolds inden for en 4 timers periode. For 2D kultur blev garn holdes sikkert i brønde eller skræddersyet poly (tetrafluorethylen) (PTFE) trug og holdes under statiske betingelser, eller rystet ved 30 rpm. For 3D kultur blev garn og celler holdes inden bioreaktor fartøjer roterende på 9 rpm.
Elektrospundne fiber matricer fremstillet af biopolymerer regelmæssigt anvendes til at støtte cellebinding og proliferation for biomateriale og / eller vævsdyrkningsapplikationer 11,12. I disse tilfælde, matricerne er ofte tynde plader af fibre, der let dækker hele bunden af en cellekultur brøndplade og dermed er i fuldstændig kontakt med podet celler, som forbedrer cellebinding. Men hvis biomateriale stillads ikke fuldt ud dækker bunden af brønden plade, er der en stor chance for, at en stor del af de podede celler vil ikke forblive i kontakt med stilladset og i sidste ende vil ikke være i stand til at vedhæfte. Denne undersøgelse undersøgte flere forskellige metoder til at pode celler på stilladser, der ikke dækker bunden af brønden plade, for at bestemme en optimeret teknik, der kan anbefales til fremtidige cellebaserede forsøg.
Fem forskellige opsætninger blev undersøgt (figur 1): scaffoLDS (elektrospundet garn) holdt ved hjælp af cellekultur indsatser indenfor lave bindende brøndplader og enten holdt under statiske forhold eller rystet ved 30 rpm; stilladser placeret inden for snævre PTFE trug og holdt statisk eller rystet ved 30 rpm; og stilladser anbragt inde bioreaktor fartøjer roterende 9 rpm. Bestemmelse af antallet af celler, der var klæbet til elektrospundne garner ved DNA analyse viste en lav procentdel af udlæg for alle seeding opsætninger (figur 2); og dette blev yderligere bekræftet fra skanningselektronmikrografer (SEM) (figur 3). Største cellebinding – 30% eller ~ 18.060 celler -blev observeret for garn, der blev afholdt inden for cellekultur skær og udsat for kontinuerlig bevægelse. Interessant nok blev laveste cellebinding (15%) opnået for garn, som cellekultur skær men holdes under statiske forhold, der tyder på, at inddragelsen af radial bevægelse har en positiv effekt på at holde celler i kontakt med stilladset. ImidlertidDet skal bemærkes, at kontinuerlig cirkelbevægelser af mediernes flow kan være ansvarlig for celle agglomerater observeret fra SEM billeder. Den shaker pladen blev sat på sit laveste indstilling – 30 rpm – som kunne være en begrænsning for denne opsætning. Ved hjælp af en langsommere radial bevægelse kan bidrage til at forebygge eller reducere celle agglomerering og kan også forbedre cellebinding som celler vil opleve mindre kraft. Fremtidige forsøg bør fokusere på at optimere den ideelle shaker hastighed for forbedret vedhæftning celle. Omfattende beslutningsforslag garn holdes inden trugene resulterede ikke i en lignende tendens, med begge scenarier giver 18% vedhæftet fil (~ 10.836 celler); selvom dette kan skyldes den delvise flotation af stilladser i renderne (observeret for trug placeret på rysteapparatet plade), da de ikke blev forankret til basen. Delvis flydende af stilladset vil forhindre eventuelle celler, der er sunket til bunden af truget kommer i kontakt med materialet og vedhængende. For thans særlige opsætning blev trug anbragt i en petriskål og et totalt volumen på 10 ml medie tilsat. De små dimensioner af truget betyder, at størstedelen af medierne er til stede i petriskålen, og hvis der er nogen bevægelse kan celler glider væk fra truget ind i den petriskål og forblive helt utilgængeligt for stilladset. For at overvinde disse begrænsninger, bør yderligere eksperimenter indeholde et ekstra trin i protokollen, hvorefter enderne af stilladser er fastgjort til bunden af trugene anvendelse af sterile fine-nåle, da dette skulle forhindre deres flydeevne og bevægelse (især for stillads udsættes for radial bevægelse), som i sidste ende fører til et øget antal celler, der er knyttet til stilladset. 16% af cellerne var fastgjort til garner til stede i de roterende fartøjer. Trods en veletableret teknik til 3D kultur, var der opstå problemer med fjernelse af stilladser fra skibenes vigtigste havn, hvilket kan have resulteret i løst AttacHED celler går tabt. Fartøjer, der kan åbnes helt vil eliminere dette problem; disse er tilgængelige til at købe, men er betydeligt dyrere end de disponible fartøjer, som anvendes i denne undersøgelse.
Denne undersøgelse viser de aktuelle problemer med såning stilladser, der ikke dækker hele bunden af standard cellekultur brøndplader. Seeding et kendt celletal resulterede i mindre end en tredjedel knyttet til skafottet, på trods af stillads overfladeareal giver mulighed for alle celler til at klæbe. Dette kunne have skadelige konsekvenser i andre cellebaserede assays, der kan vurdere biokompatibilitet og celle-materiale / celle-celle adfærd og interaktion med stilladset som et potentielt fremtidigt medicinske udstyr. Yderligere begrænsninger af undersøgelsen kan omfatte 4 timer tid-point – trods lang nok til at sikre indledende cellepodning (celler er blevet vist at fast tillægger substrater inden for tredive minutter 13,14,15), kan det være rimeligt at ivestigate senere tidspunkter levere celler ikke formere sig i løbet af en længere tidsramme, da dette ellers ville forvrænge den begyndende celle nummer. At reducere mængden af medier, i dette tilfælde 10 ml, også kan forbedre kontakten mellem cellerne og stillads og i sidste ende øge cellevedhæftning. Fremtidige studier bør også overveje cellelevedygtighed som processen med cellepodning kan forårsage cellebeskadigelse og / eller celledød 16. Celle-DNA analyser skelner ikke mellem levedygtige og ikke-levedygtige celler, som sådan en levende / død assay, for eksempel, ville fremhæve omfanget af levedygtighed.
Denne undersøgelse skaber opmærksomhed til det faktiske antal celler, der lægger til skafottet trods såning en kendt mængde. For undersøgelser, der er afhængige af start antal celler, er det meget vigtigt, at forskerne ved præcis, hvor mange af dette tal rent faktisk holde sig til underlaget af interesse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke og anerkende Medical Research Council for at finansiere denne forskning – MRC-DPF tilskud kode G1000788-98812.
Distilled water | in-house supply | n/a | |
Ethanol | Merck | 1117271000 | |
Phosphate Buffered Saline solution | Life Technologies | 70013016 | |
Human mesenchymal stem cells | PromoCell GmbH | C-12974 | |
MSC culture media | PromoCell GmbH | C-28010B | Warmed to 37 oC before use |
Supplement mix | PromoCell GmbH | C-39810 | Add to culture media |
Antibiotic/antimyotic mix | Sigma-Aldrich | A5955 | Add to culture media |
Trypsin (0.05 %) EDTA (0.02 %) | Sigma-Aldrich | 59417C | Warmed to 37 oC before use |
Cell culture flasks (T75) | Becton Dickinson Ltd | 353110 | |
Low binding 6-well plates | Costar Corning | 3471 | |
6-well CellCrowns | Scaffdex | C00003S | |
Petri-dish 50 ml deep | Sterilin | 124 | |
PTFE troughs | in-house production | n/a | |
Disposable RCCS vessels 10 ml | Synthecon | D-410 | |
4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor | Synthecon | RCCS-4DQ | |
Shaker plate | Stuart | SSM1 | Mini Orbital Shaker |
Haemocytometer | Digital Bio | DHC-F01 | Disposable C-Chip |
Centrifuge tube | Deltalab | 352096, 429901 | 15 ml and 50 ml |
Centrifuge | Hettich | Rotafix 32 A | |
Syringe 3 ml | Shield Medicare Ltd | 3039820 | |
Pipettes | Sterilin | 40305, 47310, 40125 | 5, 10 and 25 ml |
Gilson pipettes | SLS | F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 | P2 – P1000 |
Pipette tips | SLS | PIP7852, PIP7834, PIP7840 | |
Micro test tube 1.5 ml | Eppendorf | 30125.15 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
PicoGreen Assay | Invitrogen | P7589 | Assay set-up in the dark |
Black 96-well plate | Greiner Bio One | 655086 | |
Fluorescent plate-reader | BGM Labtech | FLUOstar Optima | |
Glutaraldehyde 25 % | TAAB Laboratories | G002 | Made to a concentration of 1.5 % v/v in PBS |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 999-97-3 | |
Aluminium stubs (SEM) | Agar Scientific | G301 | |
Carbon tabs (SEM) | Agar Scientific | G3347N | |
Gold sputter coater | Edwards | S150B | |
Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom World | Phenom Pro |