Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Het optimaliseren van Bevestiging van menselijke mesenchymale stamcellen op Poly (ε-caprolacton) elektrogesponnen Yarns

doi: 10.3791/52135 Published: April 10, 2015

Abstract

Onderzoek naar biomaterialen en tissue engineering omvat vaak op basis van cellen in vitro onderzoeken, die een eerste kennis van het startnummer cel vereisen. Terwijl onderzoekers vaak verwijzen naar hun entdichtheid dit betekent niet noodzakelijk het werkelijke aantal cellen die zijn toegetreden tot het materiaal in kwestie. Dit is met name het geval voor de materialen, of steigers, die geen betrekking hebben op de basis van standaard celkweek well platen. Deze studie onderzoekt de initiële hechting van menselijke mesenchymale stamcellen geënt bij een bekend aantal op electrospun poly (ε-caprolacton) garen na 4 uur in de cultuur. Electrospun garens werden gehouden in verschillende set-ups, waaronder bioreactor schepen te draaien op 9 rpm, celkweek inserts geplaatst bij weinig binding well platen en (PTFE) in troggen geplaatst in petrischaaltjes. De laatste twee werden aan hetzij statische omstandigheden of geplaatst op een shaker plaat (30 37 ° C, 5% CO2, werd de locatie van gezaaide cellen bepaald met-DNA-test. Scaffolds werden verwijderd uit de verpakking en geplaatst in lysis buffer. De media fractie werd eveneens verwijderd en gecentrifugeerd - het supernatant verwijderd en pellets gebroken met lysisbuffer. Lysis buffer werd aan elke recipiënt, of goed, en geschraapt om alle cellen die aanwezig kunnen zijn vrij. De cel DNA test bepaald het percentage cellen aanwezig in het schavot, media en goed fracties. Celaanhechting laag was voor alle experimentele set-ups, met de grootste beslag (30%) voor garens gehouden binnen celkweek inserts en onderworpen aan schudden beweging. Deze studie sensibiliseert het werkelijke aantal cellen verbonden aan steigers ongeacht de vermelde cel zaaidichtheid.

Introduction

Steigers worden routinematig worden ontwikkeld en onderzocht voor biomateriaal en tissue engineering toepassingen. Als zodanig zijn zij gewoonlijk geënt met cellen en hun in vitro gedrag kenmerk via assays die celproliferatie en celaantal te bepalen, bijvoorbeeld. Voor experimenten zoals deze, is het noodzakelijk dat het aanvankelijke aantal cellen is bekend en onderzoekers stellen vaak zaaien concentratie qua aantal cellen per ml of cm2. Hoewel dit goed gebruik, vooral voor opschaling doeleinden, is het niet goed voor het werkelijke aantal cellen die hechten aan het schavot oppervlak (die ook afhankelijk is van de hechting van het biomateriaal 1). Dit geldt vooral voor steigers die niet de gehele basis van de celkweek titerplaat cellen van het construct kan vallen en, vanwege de vaak statische aard van het experiment, misschien nooit terug in contact met het materiaal van interust. Electrospun vezeldraden zijn een goed voorbeeld van een scaffold die niet bedekt de bodem van de put (Figuur 1A). In dit geval dient lage bindingsaffiniteit putjes die geen oppervlak bewerkt zijn worden gebruikt om cellen te voorkomen hechten aan het oppervlak van de plaat en daarmee het resultaat van een goed gebaseerde bepaling verstoren.

Putjesplaten worden gemakkelijk gebruikt voor zaaien van cellen op steigers, maar ze zijn niet de enige methode. Roterende celkweek systemen een soort bioreactor ontwikkeld door de afdeling Life Sciences NASA eind 1980 kan eveneens worden gebruikt voor steigers zaad in een driedimensionale (3D) omgeving met gesimuleerde microzwaartekracht. Dit type bioreactor blijft een populaire keuze met onderzoekers over de hele wereld en is opgenomen in de studies voor cell signaling 2,3, stamcellen 4,5 en tissue engineering 6,7. Wat de roterende bioreactor voorkeur well platen is het onderhoudeen 3D-omgeving die helpt voorkomen gedifferentieerde cellen van dedifferentiërende, zoals vaak het geval is indien gekweekt in conventionele 2D omstandigheden 8.

Deze paper onderzoekt verschillende technieken zaaien menselijke mesenchymale stamcellen op electrospun poly (ε-caprolacton) vezeldraden zoals gefabriceerd Bosworth et al., 9 om het aanvankelijke aantal cellen verbonden aan deze scaffolds binnen 4 uur periode te maximaliseren. Voor 2D-cultuur, werden garens stevig vastgehouden binnen well platen of op maat poly (tetrafluorethyleen) (PTFE) troggen en onder statische omstandigheden bewaard, of geschud bij 30 rpm. Voor 3D-cultuur, werden garens en cellen gehouden binnen bioreactor schepen draaiende op 9 rpm.

Protocol

1.Scaffold Fabrication en Sterilisatie

  1. Los PCL in 1,1,1,3,3,3-hexafluorisopropanol tot 10% w / v concentratie geven. Zoals beschreven Bosworth et al, 9 electrospin de polymeeroplossing (parameters: 20 kV, 1 ml / uur, 20 cm). En verzamelen uitgelijnd vezels aan de rand van een roterende doorn (600 rpm). Met een scalpel verwijder het lint van de verzamelde vezels en snijd in kortere lengtes - 3 cm (voor troggen en roterende vaten) en 4 cm (voor celkweek inserts) lengtes.
  2. Met behulp van fijne tang onderdompelen individuele strips in gedestilleerd water en verwijder.
  3. Houd beide uiteinden tussen duim en wijsvinger; handmatig draai de strip totdat het lijkt op draad.
  4. Kort onderdompelen deze thread-achtige steiger in gedestilleerd water en leg op een schone, niet-vezelige kaart te drogen.
  5. Eenmaal droog, plaats individueel in schone microcentrifugebuisjes en voeg 1 ml 50% v / v ethanol in gedestilleerd water. Sluit het deksel en laat gedurende 24 uur.
    Opmerking: Voer de volgende stappen onder laminaire stroming:
  6. Plaats microcentrifuge buizen in een laminaire stroming kast en zuig 50% v / v oplossing. Te vervangen door 1 ml 70% v / v ethanol in gedestilleerd water, dicht deksels en laat gedurende 24 uur.
  7. Herhaal 90% en 100% v / v ethanol in gedestilleerd water (1 ml volumes).
  8. Wassen steigers tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 24 uur per wasbeurt (2 x 1 ml).
  9. Verwijder PBS en te vervangen door 1 ml celkweek media. Opmerking: Steigers zijn klaar voor gebruik na 24 uur.

2. Het bepalen van Steiger Oppervlakte en Aantal Cellen

  1. Met behulp van een lichtmicroscoop en imaging software meet de diameter van de electrospun draad langs zijn lengte om een ​​gemiddelde waarde te bepalen.
  2. Stel dat de garen een cilindrische staaf en benaderen de oppervlakte met:
  3. Waarbij A = Oppervlakte, r = radius en h = lengte
    Opmerking: Het oppervlak werd berekend op 18.902800 pm2. Voorts zij opgemerkt dat het werkelijke oppervlak groter zal zijn dan deze berekening als het garen bestaat uit honderden fijne vezels, die het oppervlak toenemen. Dientengevolge een groter aantal cellen moet kunnen hechten aan het schavot. Echter, dit heeft geen invloed op een directe vergelijking tussen de testgroepen worden gemaakt.
  4. Bepaal het maximum aantal cellen dat kan hechten aan de steiger blootgestelde oppervlak door:
    Opmerking: Met behulp van een lichtmicroscoop en imaging software, de diameter van menselijke mesenchymale stamcellen werd bepaald op 20 pm (uitgaande cellen zijn rond), dus in casu aantal cellen = 60.200.

3. Steiger Set-up - Cell Culture Inserts (figuur 1A)

  1. Onder laminaire stroming, open de steriele 6-well celkweek inserts en scheiden de kortere ringen met de tanden van de bredere geringd lichamen.
  2. Neem de ring met de tanden naar boven gericht. Draperen éénvan 4 cm scaffolds boven het midden van de ring en zorg ervoor dat overlapt aan beide zijden. Neem de geringde lichaam en positie boven de getande ring en steiger en naar beneden drukken zorg ervoor dat de steiger blijftstaan ​​en ligt door het midden van de celkweek insert.
  3. Plaats de celkweek insert met steiger in de put van een 6-well, lage bindende plaat.
  4. Voeg 10 ml van de cultuur media naar het schavot.

4. Steiger Set-up - Trough (Figuur 1B)

  1. Onder laminaire stroming, plaats poly (tetrafluorethyleen) (PTFE) troggen in afzonderlijke petrischaaltjes en voeg 10 ml van de cultuur media om de trog.
  2. Met behulp van een tang draperen één van de 3 cm steigers in de drinkbak, en zorg ervoor zijn lengte ligt parallel aan de trog's langer rand.

5. Steiger Set-up - bioreactorvat (figuur 1C)

  1. Onder laminaire stroming, afzien 10 ml steriele PBS door de bioreactorvat'sbelangrijkste haven en laat 10 min.
  2. Verwijder de PBS en te vervangen door 8 ml kweekmedium.
  3. Met behulp van een tang, plaatst u één van de 3 cm steigers in het vat via de grote poort.
  4. Sluit de belangrijkste haven uit.

6. Celtelling

  1. Cultuur menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) verkregen uit beenmerg volgens de fabrikant protocol tot passage 4 voor het oogsten.
  2. Zuig het materiaal uit een 75 cm 2 kolf met hMSCs afkomstig uit beenmerg (doorgang 4, 80% samenvloeiing).
  3. Was de cellen met 10 ml steriele PBS en zuig.
  4. Voeg 3 ml trypsine en incubeer de kolf bij 37 ° C, 5% CO2 totdat de cellen losgemaakt van de fles oppervlak.
  5. 7 ml kweekmedium om het enzym te inactiveren en breng dit totale volume (10 ml) om een ​​centrifugebuis.
  6. Resuspendeer deze celsuspensie door en neer te pipetteren meerdere malen homogeen dispergeren cellen in hetmateriaal en de cel agglomeraten (10 ml pipet).
  7. Verwijder 20 ul van celsuspensie en transfer naar een haemocytometer.
  8. Plaats de haemocytometer onder een lichtmicroscoop en imago op x10 doelstelling.
  9. Focus de rasterlijnen en tel het aantal cellen in de 4 x 4 pleinen in elke hoek van het net en die binnen de vierkante vallen en degenen die de rechterhand of onderste grenslijn oversteken. Tellen voor elke set van 4 x 4 vierkantjes (4 tellen per grid).
  10. Herhaal de resuspensie en celgetal drie keer (stappen 6,6-6,9).
  11. Bereken het gemiddelde celgetal en het bepalen van het volume van de media nodig voor cel resuspensie (cel concentratie 60.200 in 200 pi). Zo bepalen de gemiddelde celtelling van de hemocytometer en bepalen de totale gemiddelde aantal cellen uit de drie afzonderlijke tellingen. Vermenigvuldig dit met 1 x 10 4 tot aantal cellen per ml en vervolgens vermenigvuldigen geven door het totale volume celsuspensie te gevenTal aantal cellen. Gebruik de volgende vergelijking om het volume van dragers die voor resuspensie bepalen:
  12. Centrifugeer de celsuspensie bij 241 xg gedurende 5 minuten.

7. Cell Zaaien

  1. Zuig het materiaal uit de gecentrifugeerd buis verlaten van de cel pellet en te vervangen door de berekende media volume.
  2. Resuspendeer de cellen en media voor een nog mengen.
  3. Met behulp van een P200 Gilson pipet langzaam afgeven 200 ui celsuspensie op elke steiger door uitvoering van de punt van de pipet langs de steiger lengte en onder de media vloeistofoppervlak. Laat staan ​​voor 20 min.
  4. Voor bioreactor schepen, afzien 200 ul celsuspensie door de belangrijkste haven. Hoogst de resterende 2 ml kweekmedium via de injectiespuit poorten tot een totaal volume van 10 ml.

8. Experimentele Start

  1. De bioreactor schepen over te dragen aan de RCC-4DQ bioreactor en ingesteld om te draaien op 9 rpm.
  2. TranSfer de well platen met celkweek inserts en drinkbakken, om de shaker plaat en ingesteld om te draaien bij 30 rpm.
  3. Breng de well platen met celkweek inserts en dalen op de plank van een cel incubator ingesteld op 37 ° C, 5% CO2 (statische kweek).

9. DNA-test

  1. Bereid oplossingen - lysebuffer, 1x TE-buffer, DNA-normen en cel-DNA werkende oplossing - volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Na 4 uur, verwijder de monsters uit de incubator en plaats onder laminaire stroming.
  3. Verwijder de media fracties van alle monsters en plaatsen in afzonderlijk gekenmerkt centrifuge buizen. Centrifugeer de buizen 241 xg. Verwijder het supernatant en voeg 3 ml lysis buffer. Resuspendeer de oplossing kunnen breken de cel pellet.
  4. Behulp van een tang verwijder de steigers en plaats in centrifuge buizen met 3 ml lysis buffer (voor de steigers in de bioreactor schepen, verwijder het schavot voor het opzuigen van het media). Voor steigers gehouden binnen celkweek inserts, eerst bevrijden van de steiger door het snijden van de steiger dicht bij de rand van het inzetstuk met behulp van een scalpel.
  5. Voeg 3 ml lysis buffer aan elke steiger bakje en schraap het oppervlak (krachtig bewegen voor de bioreactor schepen). Verwijder de lysis buffer en plaats die afzonderlijk gekenmerkt centrifugebuizen.
  6. Vortex elke centrifugebuis gedurende ongeveer 1 minuut voldoende roeren van de cellen te waarborgen en buffer en lysis van de celmembraan te bevorderen.
  7. In een zwarte plaat met 96 putjes, 100 ul lysisbuffer per monster fractie - steiger, media en goed (dupliceren).
  8. In het donker, voeg 100 ul-DNA-oplossing aan alle putjes met lysis buffer en meng voorzichtig.
  9. Inclusief putjes met lysisbuffer die geen DNA en cel-DNA oplossing voor een negatieve en positieve controles voor zowel plate.
  10. Met behulp van een fluorescentie-plaat-reader, meet de absorptie van het goeds met 485 nm excitatie en 520 nm emissie.
  11. Vergelijk de gegevens met de standaardcurve gegenereerd uit de DNA normen volgens de instructies van de fabrikant.

10. Scanning Electron Microscope (SEM) Fixatie

  1. Voer de volgende stappen onder laminaire stroming: Na 4 uur, verwijder alle steigers uit hun tanks en plaats in een nieuwe 6-well plaat (aparte putten).
  2. Was de steigers tweemaal met PBS.
  3. Voer de volgende stappen op de open bank: Aan elk putje, voeg 2 ml van 1,5% v / v glutaaraldehyde in PBS om volledige dekking van het schavot te garanderen.
  4. Laat de plaat gedurende minimaal 30 minuten bij 4 ° C voor mobiele fixatie.
  5. Verwijder de fixeeroplossing en was de steigers tweemaal met PBS.
  6. Dehydrateer de steigers met toenemende concentraties ethanol in gedestilleerd water beginnend met 50% v / v, gevolgd door 70% v / v en 90% v / v. Voor elke concentratie, volledig onderdompelen de steigers in solution (2 ml) en laat gedurende 3 min. Gooi de oplossing en herhaal.
  7. Dehydrateer 100% ethanol volledig onderdompelen de steigers in oplossing (2 ml) en vertrekken voor 5 min. Gooi de oplossing en herhaal.
  8. Chemisch droog de steigers met behulp hexamethyldisilazan (HMDS) binnen een zuurkast. Dompel de steigers in HMDS (2 ml) en laat gedurende 5 min. Verwijder de HMDS en herhaal.
  9. Verwijder de HMDS en laat de steigers drogen. Monteer de steigers op commercieel beschikbare SEM stubs (in dit geval roestvrijstalen stubs met lijm koolstof tabs).
  10. Te verlichten bekijken binnen de SEM, de vacht van de monsters met behulp van een gouden-sputter coater gedurende 2 minuten om te zorgen voor een dunne en gelijkmatige dekking.
  11. Leg monsters binnen de SEM en visualiseren van de cel-geplaatste steigers met behulp van een 5 keV elektronenbundel.

Representative Results

De resultaten benadrukken de locatie van cellen na 4 uur na enten per proefopstelling onderzocht. Figuur 2A toont het percentage cellen dat gedurende deze tijd de steiger oppervlak hebben gehecht. Een omrekeningsfactor van 8,5 pg / cel werd gebruikt voor het meten DNA inhoud in celaantal converteren en bepalen dus het percentage cellen 10. Voor alle zaaien opstellingen onderzocht, het percentage celhechting relatief laag, met de grootste celhechting (30%) voor steigers gehouden binnen celkweek inserts en geschud bij 30 rpm (Insert Shaker). Laagste therapietrouw (15%) was voor steigers gehouden binnen de inzetstukken celcultuur en onder statische omstandigheden (Insert Static) gehouden.

Een groot aantal cellen aanwezig in de media fractie (figuur 2B) waren, met name voor celkweek inserts gehouden binnen lage bindingsaffiniteit platen (Insert Statisch) en roterende vat was 50% en 51%respectievelijk. Steigers gehouden binnen de troggen toonde een verhoogd aantal cellen aanwezig in de houder zelf - 48% van de cellen voor Trog Shaker en 50% voor trog Statische.

Scanning elektronenmicroscopie toegestaan ​​visuele inspectie van de cel geplaatste scaffolds (figuur 3). Representatieve beelden gewezen op een beperkte aanwezigheid van cellen op de vezelachtige oppervlak, ongeacht het zaaien set-up. Echter, een groter aantal cellen en cellen agglomeraten aanwezig op de steigers gehouden binnen de inzetstukken celkweek en geschud bij 30 rpm (Insert Shaker).

Figuur 1
Figuur 1. Experimentele Set-ups, waar elektrogesponnen Garen wordt gehouden binnen; (A) celkweek inserts en lage bindende well plaat; (B) poly (tetrafluorethyleen) (PTFE) goot en petrischaal; en (C) bioreactorvat. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Locatie van Cellen 4 uur na het zaaien op PCL elektrogesponnen Yarns met behulp van verschillende Seeding Set-ups. (A) toont het percentage cellen dat voor het PCL steiger zijn gehecht (gemiddelde ± standaarddeviatie), (B) toont de procentuele verdeling van cellocatie binnen drie fracties - media, goed en steiger (n = 4, gegevens gepresenteerd als gemiddelde waarden). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3

Figuur 3. Vertegenwoordiger Rasterelektronenmicrografieën voor PCL elektrogesponnen Yarns met menselijke mesenchymale stamcellen, 4 uur na Initial Seeding behulp van verschillende experimentele set-ups. (Alle afbeeldingen op 1000x, schaal bar = 130 micrometer.) Klik hier om een foto grotere versie van deze figuur.

Discussion

Electrospun glasvezel matrices vervaardigd uit biopolymeren worden regelmatig gebruikt om celaanhechting en proliferatie van biomateriaal en / of tissue engineering toepassingen 11,12 ondersteunen. In deze gevallen de matrices vaak dunne vellen van vezels die gemakkelijk de gehele bodem van een celkweek putjesplaat en dus volledig contact met gezaaide cellen die celhechting bevordert. Indien het biomateriaal steiger niet dekken de bodem van de put plaat, is er een grote kans dat een groot deel van de gezaaide cellen niet in contact met de steiger en uiteindelijk niet kunnen hechten. Deze studie onderzocht verschillende methoden zaaien cellen op scaffolds die geen betrekking hebben op de bodem van de put plaat, teneinde een geoptimaliseerde techniek die kan worden aanbevolen voor toekomstige celgebaseerde proeven bepalen.

Vijf verschillende set-ups werden onderzocht (figuur 1): scaffolds (electrospun garen) gehouden met behulp van celkweek inserts binnen laag bindende well platen en ofwel onder statische omstandigheden bewaard of geschud bij 30 tpm; steigers geplaatst binnen nauwe PTFE troggen en statische gehouden of geschud bij 30 tpm; en steigers gehuisvest in bioreactor schepen te draaien op 9 rpm. Het bepalen van het aantal cellen dat door DNA test om de electrospun garens hadden gehecht toonde een laag percentage bevestiging voor alle enten setups (figuur 2); en dit werd verder bevestigd door scanning elektronen microfoto (SEM) (Figuur 3). Grootste celaanhechting - 30% of ~ 18.060 cellen -werd waargenomen voor garens die werden gehouden binnen celkweek inserts en onderworpen aan een continue beweging. Interessant laagste celhechting (15%) werd verkregen garens bezit van celkweek inserts maar onder statische omstandigheden gehouden, wat erop wijst dat de opname van radiale beweging een positief effect op het houden van cellen in contact met de steiger. Echter,zij opgemerkt dat permanente omcirkelen van de media stroom belast de cel agglomeraten waargenomen vanuit de SEM beelden kunnen zijn. De shaker plaat werd ingesteld op de laagste stand - 30 toeren - waarin een beperking aan deze set-up zou kunnen zijn. Met behulp van een langzamere radiale beweging kan helpen te voorkomen of te verminderen cel agglomeratie en kon ook het verbeteren van celaanhechting als cellen minder kracht zullen ervaren. Toekomstige experimenten moet zich richten op het optimaliseren van de ideale shaker snelheid voor een betere hechting van cellen. Integratie van ontwerpresolutie garens gehouden binnen de drinkbakken niet resulteren in een soortgelijke trend, met beide scenario's waardoor 18% attachment (~ 10.836 cellen); maar dit kan vanwege de gedeeltelijke flotatie van de steigers binnen de troggen (waargenomen voor troggen die op de klopperplaat) aangezien zij niet verankerd aan de basis. Gedeeltelijke zweven van de steiger wordt voorkomen dat cellen die gezonken naar de bodem van de trog in contact komt met het materiaal en aanhangende. Voor tzijn bijzondere opstelling werd de trog zich in een petrischaal en een totaal volume 10 ml medium toegevoegd. De kleine afmetingen van de trog betekent dat de meerderheid van de media aanwezig in het petrischaaltje als er enige beweging kunnen cellen weg van de goot drijven in het petrischaaltje blijven volledig buiten het bereik van de steiger. Om deze beperkingen te overwinnen, zouden verdere experimenten omvatten een extra stap in het protocol, waarbij de uiteinden van de steigers worden vastgemaakt aan de bodem van de goten met steriele fijne naalden, omdat dit hun flotatie en beweging (vooral belemmering voor steigers blootgesteld radiale beweging), die uiteindelijk moeten leiden tot een verhoogd aantal cellen verbonden aan de steiger. 16% van de cellen aanwezig in het roterende vaten garens waren aangebracht. Ondanks dat het een goed ingeburgerde techniek voor 3D-cultuur, heeft problemen met het verwijderen van de steigers van de belangrijkste haven van de vaartuigen, die kunnen hebben geleid tot losjes Attached cellen verloren. Schepen die volledig geopend kan worden zou dit probleem op te heffen; Deze zijn te koop, maar zijn aanzienlijk duurder dan het beschikbare schepen gebruikt in deze studie.

Deze studie toont de huidige problemen met het zaaien van steigers die geen betrekking hebben op de hele onderkant van de standaard celcultuur well platen. Zaaien een bekend aantal cellen resulteerde in minder dan een derde vastmaken aan de steiger, ondanks oppervlakte van de steiger is waardoor alle cellen te hechten. Dit kan nadelige gevolgen hebben in andere cellen gebaseerde assays die de biocompatibiliteit en cel-materiaal / cel-cel gedrag en interacties met de steiger als potentiële toekomstige medische inrichting kan beoordelen. Verdere beperkingen van de studie kan de 4 hr tijdpunt zijn - ondanks dat lang genoeg is om initiële zaaien van cellen waarborgen (cellen hebben aangetoond dat stevig aan substraten binnen dertig minuten 13,14,15), kan het redelijk zijn inMaastricht onderzoek latere tijdstippen verstrekken cellen niet vermenigvuldigen gedurende een langere termijn, omdat dit anders zou scheef het startnummer cel. Vermindering van de hoeveelheid media, in dit geval 10 ml, kan ook contact tussen de cellen en steiger kan verbeteren, vergroten celhechting. Toekomstige onderzoeken moeten ook cellevensvatbaarheid beschouwen als het proces van cel enten kan celbeschadiging en / of celdood 16 veroorzaken. Cell DNA tests geen onderscheid tussen levensvatbare en niet-levensvatbare cellen als zodanig een levende / dode assay, bijvoorbeeld, zou de levensvatbaarheid kon markeren.

Dit onderzoek sensibiliseert het werkelijke aantal cellen die hechten aan het schavot ondanks zaaien een bekende hoeveelheid. Voor studies die van deze uitgangspunten aantal cellen, is het zeer belangrijk dat onderzoekers precies hoeveel van deze omzet in feite zich aan het substraat van belang.

Acknowledgments

De auteurs willen graag bedanken en erkennen de Medical Research Council voor de financiering van dit onderzoek - MRC-FAP subsidie ​​code G1000788-98812.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Distilled water in-house supply n/a
Ethanol Merck 1117271000
Phosphate Buffered Saline solution Life Technologies 70013016
Human mesenchymal stem cells PromoCell GmbH C-12974
MSC culture media PromoCell GmbH C-28010B Warmed to 37 oC before use
Supplement mix PromoCell GmbH C-39810 Add to culture media
Antibiotic/antimyotic mix Sigma-Aldrich A5955 Add to culture media
Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%) Sigma-Aldrich 59417C Warmed to 37 °C before use
Cell culture flasks (T75) Becton Dickinson Ltd 353110
Low binding 6-well plates Costar Corning 3471
6-well CellCrowns Scaffdex C00003S
Petri-dish 50 ml deep Sterilin 124
PTFE troughs in-house production n/a
Disposable RCCS vessels 10 ml Synthecon D-410
4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor Synthecon RCCS-4DQ
Shaker plate Stuart SSM1 Mini Orbital Shaker
Haemocytometer Digital Bio DHC-F01 Disposable C-Chip
Centrifuge tube Deltalab 352096, 429901 15 ml and 50 ml
Centrifuge Hettich Rotafix 32 A
Syringe 3 ml Shield Medicare Ltd 3039820
Pipettes Sterilin 40305, 47310, 40125 5, 10 and 25 ml
Gilson pipettes SLS F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 P2 - P1000
Pipette tips SLS PIP7852, PIP7834, PIP7840
Micro test tube 1.5 ml Eppendorf 30125.15
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
PicoGreen Assay Invitrogen P7589 Assay set-up in the dark
Black 96-well plate Greiner Bio One 655086
Fluorescent plate-reader BGM Labtech FLUOstar Optima
Glutaraldehyde 25% TAAB Laboratories G002 Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma 999-97-3
Aluminium stubs (SEM) Agar Scientific G301
Carbon tabs (SEM) Agar Scientific G3347N
Gold sputter coater Edwards S150B
Scanning Electron Microscope (SEM) Phenom World Phenom Pro

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jauregui, H. O. Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells. ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33, (2), 66-74 (1986).
  2. Puca, A., Russo, G., Giordano, A. Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's. Oncotarget. 3, (4), 426 (2012).
  3. Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway. Annals of biomedical engineering. 33, (10), 1405-1410 (2005).
  4. Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells. Cellular Reprogramming. 15, (5), 443-458 (2013).
  5. Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Molecular biotechnology. 54, (2), 331-336 (2013).
  6. Wang, Y., et al. Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds. Tissue Engineering Part A. 18, (21-22), 2376-2385 (2012).
  7. Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering. Clinical Orthopaedics and Related Research. 471, (8), 2422-2433 (2013).
  8. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281, (1), F12-F25 (2001).
  9. Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24, (6), 1605-1614 (2011).
  10. Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds. Tissue Engineering Part A. 18, (7-8), 757-767 (2011).
  11. Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels. Biomaterials. 35, (9), 2713-2719 (2014).
  12. Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro. Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).
  13. Yavin, E., Yavin, Z. Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface. The Journal of cell biology. 62, (2), 540-546 (1974).
  14. Chen, H. Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91, (21), 10148-10152 (1994).
  15. Grant, D. S., Tashiro, K. -I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro. Cell. 58, (5), 933-943 (1989).
  16. Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization. Biotechnology and bioengineering. 64, (5), 580-589 (1999).
Het optimaliseren van Bevestiging van menselijke mesenchymale stamcellen op Poly (ε-caprolacton) elektrogesponnen Yarns
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bosworth, L. A., Rathbone, S. R., Cartmell, S. H. Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(ε-caprolactone) Electrospun Yarns. J. Vis. Exp. (98), e52135, doi:10.3791/52135 (2015).More

Bosworth, L. A., Rathbone, S. R., Cartmell, S. H. Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(ε-caprolactone) Electrospun Yarns. J. Vis. Exp. (98), e52135, doi:10.3791/52135 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter