This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.
Erforschung von Biomaterialien und Tissue Engineering umfasst oft zellbasierten In-vitro-Untersuchungen, die ersten Kenntnisse der Ausgangszellzahl erfordern. Während die Forscher üblicherweise Referenz ihrer Einsaatdichte dies nicht notwendigerweise die tatsächliche Anzahl der Zellen, die an das betreffende Material anhaften. Dies ist insbesondere für Materialien oder Gerüste, die nicht die Basis des Standard-Zellkulturplatten gut abdecken. In dieser Studie wird die anfängliche Befestigung der menschlichen mesenchymalen Stammzellen in einer bekannten Anzahl an elektrogesponnen Poly (ε-caprolacton) Garn nach 4 h in Kultur angeimpft. Elektrogesponnene Garne wurden in verschiedenen Aufbauten gehalten, einschließlich Bioreaktor Gefäße auf 9 Upm Zellkultureinsätze in geringen Bindungs Well-Platten und Polytetrafluorethylen (PTFE) Gräben von Petrischalen platziert positioniert dreht. Die beiden letzteren wurden entweder statischen Bedingungen auf einer Rüttelplatte ausgesetzt oder aufgestellt (30 <span style = "font-size: 14px; line-height: 28px;"> rpm). Nach 4-stündiger Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2 wurde die Position der ausgesäten Zellen durch Zell-DNA-Assay bestimmt. Gerüste wurden aus ihren Behältern entfernt und in Lysepuffer gelegt. Die Medien-Fraktion wurde entfernt und in ähnlicher Weise zentrifugiert – der Überstand verworfen und Pellet mit Lysispuffer gebrochen. Lyse-Puffer wurden zu jedem Gefäß oder hinzugefügt, so, und abgeschabt, um alle Zellen, die vorhanden sein können, zu befreien. Das Zell-DNA-Test bestimmt den Prozentsatz an Zellen innerhalb des Stützgerüsts vorliegen, Medien und auch Fraktionen. Zellhaftung gering war für alle Versuchsanordnungen, mit größter Anlage (30%) für Garne in Zellkultur-Einsätzen gehalten und Schüttelbewegung unterzogen. Diese Studie sensibilisiert auf die tatsächliche Anzahl von Zellen verbundenen, unabhängig von der genannten Zellansiedlungsdichte Warten.
Gerüste werden regelmäßig weiterentwickelt und für Biomaterialien und Tissue-Engineering-Anwendungen untersucht. Als solche sind sie allgemein mit Zellen und ihre in vitro-Verhalten über Tests, die Zellproliferation und Zellzahl zu bestimmen, beispielsweise dadurch ausgesät. Für Experimente, wie diese, ist es zwingend erforderlich, dass die anfängliche Zellzahl bekannt ist und Forscher Staat häufig die Seeding-Konzentration in Bezug auf die Anzahl der Zellen pro ml oder cm 2. Dies ist zwar eine gute Praxis, insbesondere für Scale-up-Zwecke, ist es nicht für die tatsächliche Anzahl der Zellen, die an die Gerüstoberfläche (die auch abhängig von den Klebeeigenschaften der Biomaterialoberfläche 1) haften ausmachen. Dies gilt insbesondere für Gerüste, die nicht die gesamte Basis der Zellkultur-Well-Platte abdecken als Zellen vom Konstrukt fallen könnten und aufgrund der oft statische Natur des Experiments kann nie in Kontakt mit dem Material der inte zurückkommenRuhe. Elektrofasergarne sind ein gutes Beispiel für ein Gerüst, das nicht den Boden der Vertiefung (1A) umfasst. In diesem Fall sollte eine niedrige Bindungs Well-Platten, die nicht oberflächenbehandelt wurden verwendet, um Zellen von der Befestigung an der Plattenoberfläche und somit die Ergebnisse verzerrt jedes gut basierten Assay zu verhindern.
Well-Platten sind leicht zur Zellbesiedelung verwendet, auf Gerüsten, aber sie sind nicht die einzige Methode zur Verfügung. Rotary Zellkultursysteme, eine Art Bioreaktor durch den Lebenswissenschaften bei der NASA in den späten 1980er Jahren entwickelt wurde, können auf ähnliche Weise verwendet werden, um Gerüste in einem dreidimensionalen (3D) Umgebung mit simulierten Mikrogravitation zu impfen. Diese Art der Bioreaktor bleibt eine beliebte Wahl mit Forschern weltweit und wurde in Studien zur Zellsignal 2,3 aufgenommen, Stammzellen und Tissue Engineering 4,5 6,7. Was macht den Dreh Bioreaktor vorzuziehen, Well-Platten ist die Aufrechterhaltungeiner 3D-Umgebung, was dazu beiträgt, differenzierten Zellen Entdifferenzierung vermeiden, wie es oft der Fall, wenn in herkömmlichen 2D-Bedingungen 8 kultiviert.
Dieser Aufsatz untersucht verschiedene Techniken zur Aussaat humanen mesenchymalen Stammzellen auf elektro Poly (ε-caprolacton) Fasergarne wie in Bosworth et al., 9, um die anfängliche Anzahl von Zellen Befestigung an dieser Gerüste innerhalb von 4 Stunden-Zeitraum zu maximieren hergestellt. Für 2D-Kultur wurden Fäden sicher in Well-Platten oder maßgeschneiderte Poly (Tetrafluorethylen) (PTFE) Mulden gehalten und unter statischen Bedingungen gehalten, oder bei 30 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Für 3D-Kultur wurden Garne und Zellen im Bioreaktor Gefäße 9 UpM gehalten.
Elektro Fasermatrizen aus Biopolymeren hergestellt werden regelmäßig verwendet, um die Zellhaftung und Proliferation zu Biomaterial und / oder Tissue-Engineering-Anwendungen 11,12 unterstützt. In diesen Fällen sind die Matrizen oft dünne Blätter aus Fasern, die leicht bedecken die gesamte Basis einer Zellkultur-Well-Platte und sind somit in vollständigen Kontakt mit ausgesäten Zellen, welche die Zellhaftung verbessert. Wenn jedoch die von Biomaterialien, nicht vollständig die Basis der Platte mit Vertiefungen zu bedecken, gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass ein Großteil der angesiedelten Zellen werden nicht in Kontakt mit dem Gerüst zu bleiben und letztendlich nicht in der Lage zu befestigen. Diese Studie untersuchte verschiedene Vorgehens Impfen von Zellen auf Gerüsten, die nicht decken die Basis der Platte mit Vertiefungen, um ein optimiertes Verfahren, das für zukünftige zellbasierten Experimenten empfohlen werden könnte bestimmen.
Fünf verschiedene Set-ups untersucht (Abbildung 1): scaffolds (elektro Garn) statt mit Zellkultur-Einsätzen in geringen Bindungs Well-Platten und entweder unter statischen Bedingungen gehalten oder bei 30 Upm geschüttelt; Gerüste in engen PTFE Wannen und hielt statisch oder bei 30 Umdrehungen pro Minute geschüttelt; und Gerüsten innerhalb Bioreaktorgefäße 9 UpM untergebracht. Bestimmen der Anzahl von Zellen, die an die elektro Garne durch DNA Assay halten hatten gezeigt, ein geringer Prozentsatz der Befestigung für alle Impfen Aufbauten (Abbildung 2); und dies wurde weiter aus rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen (SEM) (Abbildung 3) bestätigt. Greatest Zellhaftung – 30% bzw. ~ 18.060 Zellen -wurde für Garne, die in Zellkultur-Einsätzen gehalten und zu einer kontinuierlichen Bewegung unterzogen wurden nicht beobachtet. Interessanterweise wurde niedrigsten Zellanheftung (15%) für Garne von Zellkultureinsätzen gehalten, sondern unter statischen Bedingungen gehalten wird, die darauf schließen ließen, dass die Aufnahme von Radialbewegung hat einen positiven Effekt auf halten Zellen in Kontakt mit dem Gerüst erreicht. Jedochist darauf hinzuweisen, dass eine kontinuierliche kreisFluss der Medien kann für die aus den REM-Aufnahmen beobachtet Zellagglomerate verantwortlich sein werden. Die Rüttelplatte auf die niedrigste Einstellung gesetzt – 30 Umdrehungen pro Minute – das ist eine Einschränkung zu diesem Set-up sein könnte. Mit einem langsameren radiale Bewegung kann helfen, zu verhindern oder zu reduzieren Zell Agglomeration und könnte auch zu verbessern Zellhaftung als Zellen weniger Kraft zu erleben. Zukünftige Experimente sollten sich auf die Optimierung der ideal-Geschwindigkeit für eine verbesserte Zellhaftung zu konzentrieren. Die Einbeziehung Bewegung für Garne innerhalb der Rinnen gehalten nicht in einem ähnlichen Trend ergeben, wobei beide Szenarien ergeben 18% Befestigung (~ 10.836 Zellen); wenn dies aufgrund der teilweisen Flotation der Gerüste innerhalb der Rinnen sein, da sie nicht an der Basis verankert ist (bei Mulden auf der Rüttelplatte platziert beobachtet). Teil Floating des Gerüsts werden alle Zellen, die zu dem Boden des Troges aus in Kontakt mit dem Material und anhaftende versenkt verhindern. Für tseinen besonderen Aufbau, der Trog in eine Petrischale untergebracht ist und insgesamt 10 ml Mediumvolumen aufgenommen. Die kleinen Abmessungen der Mulde so dass die Mehrzahl der Medien innerhalb der Petrischale vorhanden ist, und wenn es irgendeine Bewegung, können Zellen von der Rinne in die Petrischale Drift und bleiben vollständig unzugänglich des Gerüsts. Um diese Einschränkungen zu überwinden, sollten weitere Experimente einen zusätzlichen Schritt in dem Protokoll ist, wobei die Enden der Gerüste sind an der Basis der Mulden mit sterilen feinen Nadeln fixierten umfassen, da dies ihre Flotation und Bewegung (insbesondere bei Gerüsten ausgesetzt wird Radialbewegung), die letztlich zu einer erhöhten Anzahl von Zellen, die Befestigung am Gerüst führen. 16% der Zellen, die innerhalb der Drehgefäßen vorhanden Garne beigefügt hatte. Obwohl es eine gut etablierte Technik für 3D-Kultur, hat Probleme mit dem Abbau von Gerüsten vom Haupthafen der Schiffe, die in lose attac geführt hat ergebenhed Zellen verloren gehen. Die Schiffe, die vollständig geöffnet werden würde, dieses Problem zu beseitigen; diese sind erhältlich, sind jedoch erheblich teurer als die Einweggefäße in dieser Studie verwendet.
Diese Studie zeigt die aktuellen Probleme mit der Aussaat Gerüste, die nicht die gesamte Basis von Standard-Zellkulturplatten gut abdecken. Impfen eines bekannten Zellzahl ergab weniger als ein Drittel Befestigung an dem Gerüst, trotz der Gerüstoberfläche, die auf allen Zellen anhaften. Dies kann nachteilige Auswirkungen auf andere zellbasierten Assays, die die Biokompatibilität und Zellmaterial / Zell-Zell-Verhalten und Wechselwirkungen mit dem Gerüst als mögliche zukünftige medizinische Vorrichtung beurteilen kann. Weitere Einschränkungen der Studie kann die 4 Stunden Zeitpunkt sind – obwohl sie lange genug, um anfängliche Zellaussaat zu gewährleisten (Zellen wurde gezeigt, fest an Substraten anzubringen innerhalb 30 Minuten 13,14,15), kann es sinnvoll sein, investigate späteren Zeitpunkten Bereitstellung von Zellen nicht über einen längeren Zeitrahmen vermehren, da dies sonst neigen die Anfangszellzahl. Reduzieren des Volumens der Medien, in diesem Fall 10 ml, könnte auch der Kontakt zwischen den Zellen und Gerüst zu verbessern und letztlich zu erhöhen Zellanheftung. Zukünftige Studien sollten auch die Lebensfähigkeit der Zellen betrachten, da der Prozess der Zellaussaat können Zellschäden und / oder Zelltod 16 verursachen. Zell-DNA-Assays nicht zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen zu differenzieren, die als solche eine lebend / tot-Assay, beispielsweise das Niveau der Lebensfähigkeit markieren würde.
Diese Untersuchung schärft das Bewusstsein der tatsächlichen Anzahl von Zellen, die zum Schafott legen trotz der Aussaat eine bekannte Menge. Für Studien, die in der Start Anzahl der Zellen zu verlassen, ist es sehr wichtig, dass die Forscher genau, wie viele dieser Figur in der Tat auf dem Substrat haften von Interesse zu tun.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich für die Finanzierung dieser Forschung Dank und Anerkennung des Medical Research Council – MRC-FAP Zuschuss Code G1000788-98812.
Distilled water | in-house supply | n/a | |
Ethanol | Merck | 1117271000 | |
Phosphate Buffered Saline solution | Life Technologies | 70013016 | |
Human mesenchymal stem cells | PromoCell GmbH | C-12974 | |
MSC culture media | PromoCell GmbH | C-28010B | Warmed to 37 oC before use |
Supplement mix | PromoCell GmbH | C-39810 | Add to culture media |
Antibiotic/antimyotic mix | Sigma-Aldrich | A5955 | Add to culture media |
Trypsin (0.05 %) EDTA (0.02 %) | Sigma-Aldrich | 59417C | Warmed to 37 oC before use |
Cell culture flasks (T75) | Becton Dickinson Ltd | 353110 | |
Low binding 6-well plates | Costar Corning | 3471 | |
6-well CellCrowns | Scaffdex | C00003S | |
Petri-dish 50 ml deep | Sterilin | 124 | |
PTFE troughs | in-house production | n/a | |
Disposable RCCS vessels 10 ml | Synthecon | D-410 | |
4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor | Synthecon | RCCS-4DQ | |
Shaker plate | Stuart | SSM1 | Mini Orbital Shaker |
Haemocytometer | Digital Bio | DHC-F01 | Disposable C-Chip |
Centrifuge tube | Deltalab | 352096, 429901 | 15 ml and 50 ml |
Centrifuge | Hettich | Rotafix 32 A | |
Syringe 3 ml | Shield Medicare Ltd | 3039820 | |
Pipettes | Sterilin | 40305, 47310, 40125 | 5, 10 and 25 ml |
Gilson pipettes | SLS | F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 | P2 – P1000 |
Pipette tips | SLS | PIP7852, PIP7834, PIP7840 | |
Micro test tube 1.5 ml | Eppendorf | 30125.15 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
PicoGreen Assay | Invitrogen | P7589 | Assay set-up in the dark |
Black 96-well plate | Greiner Bio One | 655086 | |
Fluorescent plate-reader | BGM Labtech | FLUOstar Optima | |
Glutaraldehyde 25 % | TAAB Laboratories | G002 | Made to a concentration of 1.5 % v/v in PBS |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 999-97-3 | |
Aluminium stubs (SEM) | Agar Scientific | G301 | |
Carbon tabs (SEM) | Agar Scientific | G3347N | |
Gold sputter coater | Edwards | S150B | |
Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom World | Phenom Pro |