This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.
Forskning på biomaterialer og vevsteknologi ofte inneholder cellebasert in vitro undersøkelser, som krever innledende kjennskap til startcellenummer. Mens forskere ofte referere deres seeding tetthet dette betyr ikke nødvendigvis at det faktiske antall celler som har levd opp til det aktuelle materialet. Dette gjelder særlig for materialer, eller stillaser, som ikke dekker bunnen av standard cellekultur brønners plater. Denne studien undersøker til å feste seg av menneskelige stamceller seeded på et kjent nummer på elektrospunnede poly (ε-kaprolakton) garn etter fire timer i kultur. Elektrospunnede garn ble holdt innenfor flere forskjellige oppsett, inkludert bioreaktor fartøy roterende på 9 rpm, cellekultur inserts plassert i lav bindende brønners plater og polytetrafluoretylen (PTFE) trau plassert innenfor petriskåler. De to sistnevnte ble utsatt for enten statiske betingelser eller plassert på en risteplate (30 <span style = "font-size: 14px; line-høyde: 28px;"> rpm). Etter 4 timers inkubering ved 37 ° C, 5% CO2, ble plasseringen av de kimsatte celler bestemt ved celle DNA-analyse. Stillasene ble fjernet fra sine beholdere og plassert i lyseringsbuffer. Mediene fraksjonen ble likeledes fjernet og sentrifugert – supernatanten kastet og pellet brutt opp med lysisbuffer. Lyseringsbuffer ble tilsatt til hver beholder, eller i tillegg, og skrapet for å frigjøre eventuelle celler som kan være til stede. Cellen DNA-analyse bestemmes prosentandelen av celler som er tilstede i stillaset, media og brønn fraksjoner. Celleadhesjon var lav for alle eksperimentelle oppsett, med størst feste (30%) for garn holdes innenfor celledyrkningsinnsatser og utsatt for ristebevegelse. Denne studien øker bevisstheten til det faktiske antall celler som knytter seg til stillaser uavhengig av den angitte cellen seeding tetthet.
Stillasene er rutinemessig blir utviklet og forsket for biomateriale og vev-tekniske applikasjoner. Som sådan, er de som vanligvis podet med celler og deres in vitro oppførsel karakterisert via assayer som bestemmer celleproliferasjon og cellenummeret, for eksempel. For eksperimenter som disse, er det viktig at den første celle nummer er kjent og forskere ofte oppgi seeding konsentrasjon i form av antall celler per ml eller cm2. Selv om dette er god praksis, spesielt for oppskalering formål, betyr det ikke høyde for det faktiske antall celler som holder seg til skafottet overflaten (som også er avhengig av klebende egenskaper biomateriale overflate 1). Dette gjelder spesielt for stillaser som ikke dekker hele undersiden av cellekultur brønn plate som cellene kan falle bort fra konstruksjonen, og, på grunn av den ofte statisk natur av forsøket, kan aldri komme tilbake i kontakt med materialet av interesten. Elektrospunnede fiberen garn er et godt eksempel på et stillas som ikke dekker bunnen av brønnen (figur 1A). I dette tilfellet bør lave bindings brønners plater som ikke er overflatebehandlet brukes til å forhindre celler fra å feste seg på platens overflate og følgelig forvrenger resultatene av en hvilken som helst godt basert assay.
Brønners plater er gjerne brukes for celle poding på stillasene, men de er ikke den eneste metode tilgjengelig. Roterende cellekultursystemer, en type bioreaktor utviklet av Life Sciences Division hos NASA i slutten av 1980-tallet, kan tilsvarende brukes til frø stillas innenfor en tredimensjonal (3D) miljø med simulert vektløshet. Denne typen bioreaktor er fortsatt et populært valg med forskere over hele verden og har blitt innlemmet i studier for cellesignale 2,3, stamceller 4,5 og tissue engineering 6,7. Det som gjør den roterende bioreaktor å foretrekke å brønners plater er vedlikeholdav en 3D-miljø, noe som bidrar til å hindre differensierte celler fra dedifferentiating, som ofte er tilfellet når de dyrkes i konvensjonelle 2D forhold 8.
Dette papiret undersøker forskjellige teknikker for poding humane stamceller på elektrospunnede poly (ε-kaprolakton) fibergarn som fremstilt i Bosworth et al., 9 for å maksimere den innledende antall celler som knytter seg til disse stillaser i en 4 timers periode. For 2D kultur, ble det garn sikkert avholdes innen brønnplater eller skreddersydde poly (tetrafluorethylen) (PTFE) trau og holdt under statiske forhold, eller ristes ved 30 rpm. For 3D-kultur, ble garn og celler avholdes innen reaktor fartøy roterende på 9 rpm.
Elektrospunnede fiber matriser fabrikkert fra biopolymerer blir jevnlig brukt til å støtte cellebinding og spredning for biomateriale og / eller vev tekniske applikasjoner 11,12. I disse tilfellene matrisene er ofte tynne ark av fibre som lett dekker hele undersiden av en cellekultur brønn plate og således er i fullstendig kontakt med seeded celler som forbedrer cellefesting. Men hvis biomaterialet stillaset ikke fullt ut dekker bunnen av brønnen plate, er det en høy sannsynlighet for at en stor andel av de kimsatte celler ikke vil være i kontakt med stillaset, og til slutt vil ikke være i stand til å feste. Denne studien undersøkte flere forskjellige metoder for såing av cellene på stillaser som ikke dekker bunnen av brønnplaten, for å bestemme en optimalisert teknikk som kan være anbefalt for fremtidige cellebaserte forsøk.
Fem forskjellige oppsett ble undersøkt (figur 1): scaffolds (elektrospunnede garn) holdt ved hjelp av cellekultur inserts innen lave bindende brønners plater og enten holdt under statiske forhold eller ristes ved 30 rpm; stillasene plassert innenfor trange PTFE trau og holdt statisk eller rystet ved 30 rpm; og stillaser plassert inne bioreaktor fartøy roterende på 9 rpm. Bestemme antall celler som hadde levd opp til de elektrospunnede garn av DNA-analysen viste en lav prosentandel av vedlegg for alle seeding set-ups (figur 2); og dette ble ytterligere bekreftet i scanning elektronmikrografer (SEM) (figur 3). Greatest celle vedlegg – 30% eller ~ 18 060 celler -ble observert for garn som ble holdt innenfor cellekultur inserts og utsatt for kontinuerlig bevegelse. Interessant nok var laveste cellebinding (15%) oppnådde for garn holdt av cellekultur inserts men holdt under statiske forhold, noe som skulle tilsi at inkludering av radial bevegelse har en positiv effekt på å holde cellene i kontakt med stillaset. ImidlertidDet bør bemerkes at kontinuerlig sirkle av medienes flyt kan være ansvarlig for celle agglomerater observert fra SEM bilder. Shaker plate ble satt på sitt laveste innstilling – 30 rpm – noe som kan være en begrensning til dette oppsettet. Ved hjelp av en tregere radial bevegelse kan bidra til å forebygge eller redusere celle tettbebyggelse og kan også forbedre celle vedlegg som celler vil oppleve mindre kraft. Fremtidige eksperimenter bør fokusere på å optimalisere den ideelle shaker hastighet for økt celle vedlegg. Innlemming bevegelse for garn holdes innenfor rennene resulterte ikke i en lignende trend, med begge scenarier som gir 18% vedlegg (~ 10 836 celler); selv om dette kan være på grunn av den partielle flyte av stillasene innenfor rennene (observert for trau plassert på risteplaten) som de ikke var forankret til bunnen. Delvis flytende av stillaset vil hindre eventuelle celler som har sunket til bunnen av rennen fra å komme i kontakt med materialet og klebende. For tsin spesielle oppsett, trauet ble plassert i en petriskål og et totalt 10 ml volum av mediet tilsatt. De små dimensjoner av trauet betyr at størstedelen av mediet er til stede i petriskålen, og hvis det ikke er noen bevegelse, kan cellene drive bort fra rennen inn i petriskål og forblir fullstendig utilgjengelig for stillaset. For å overvinne disse begrensningene, bør ytterligere eksperimenter er et ekstra trinn i protokollen, hvorved endene av stillasene er festet til bunnen av trauene ved hjelp av sterile fine nåler, da dette skal hindre deres flyteevne og bevegelighet (særlig for stillaser utsatt for radial bevegelse), som til slutt skal føre til et økt antall celler som knytter seg til skafottet. 16% av cellene hadde festet til trådene er tilstede i de roterende fartøy. Til tross for at et veletablert teknikk for 3D kultur, problemer gjorde oppstå med fjerning av stillas fra fartøyenes hovedhavn, som kan ha resultert i løst AttacHed celler går tapt. Fartøy som kan åpnes helt ville eliminere dette problemet; disse er tilgjengelig for kjøp, men er betydelig mer kostbart enn den kasserbare fartøy som brukes i denne undersøkelsen.
Denne studien viser de aktuelle problemstillinger med seeding stillaser som ikke dekker hele bunnen av standard cellekultur brønners plater. Seeding en kjent celle nummer resulterte i mindre enn en tredjedel feste til skafottet, til tross for stillaset areal slik at for alle celler for å overholde. Dette kan ha uheldige konsekvenser i andre cellebaserte analyser som kan vurdere den biokompatibilitet og celle-materiell / celle-celle atferd og interaksjoner med stillaset som en potensiell fremtidig medisinsk enhet. Ytterligere begrensninger av studien kan omfatte fire timers tidspunkts – til tross for å være lang nok til å sikre innledende celle seeding (celler har vist seg å fast feste til substrater i løpet av tretti minutter 13,14,15), kan det være rimelig å ivestigate senere tidspunkter som gir cellene ikke sprer under en lengre tidsramme som dette ellers ville forskyve startcellen nummer. Å redusere volumet av mediet, i dette tilfelle 10 ml, kan også forbedre kontakt mellom cellene og stillaset, og til slutt øke cellefesting. Fremtidige studier bør også vurdere celle levedyktighet som prosessen med celle seeding kan forårsake celleskader og / eller celledød 16. Celle DNA-analyser ikke skiller mellom levedyktige og ikke-levedyktige celler, som en slik levende / døde assay, for eksempel, vil markere nivået av levedyktighet.
Denne undersøkelsen øker bevisstheten til det faktiske antall celler som festes til stillaset tross seeding en kjent mengde. For studier som er avhengige av start antall celler, er det svært viktig at forskerne vet nøyaktig hvor mange av at figuren gjør faktisk holder seg til underlaget av interesse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke og erkjenne Medical Research Council for finansierer denne forskningen – MRC-FAP stipend kode G1000788-98812.
Distilled water | in-house supply | n/a | |
Ethanol | Merck | 1117271000 | |
Phosphate Buffered Saline solution | Life Technologies | 70013016 | |
Human mesenchymal stem cells | PromoCell GmbH | C-12974 | |
MSC culture media | PromoCell GmbH | C-28010B | Warmed to 37 oC before use |
Supplement mix | PromoCell GmbH | C-39810 | Add to culture media |
Antibiotic/antimyotic mix | Sigma-Aldrich | A5955 | Add to culture media |
Trypsin (0.05 %) EDTA (0.02 %) | Sigma-Aldrich | 59417C | Warmed to 37 oC before use |
Cell culture flasks (T75) | Becton Dickinson Ltd | 353110 | |
Low binding 6-well plates | Costar Corning | 3471 | |
6-well CellCrowns | Scaffdex | C00003S | |
Petri-dish 50 ml deep | Sterilin | 124 | |
PTFE troughs | in-house production | n/a | |
Disposable RCCS vessels 10 ml | Synthecon | D-410 | |
4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor | Synthecon | RCCS-4DQ | |
Shaker plate | Stuart | SSM1 | Mini Orbital Shaker |
Haemocytometer | Digital Bio | DHC-F01 | Disposable C-Chip |
Centrifuge tube | Deltalab | 352096, 429901 | 15 ml and 50 ml |
Centrifuge | Hettich | Rotafix 32 A | |
Syringe 3 ml | Shield Medicare Ltd | 3039820 | |
Pipettes | Sterilin | 40305, 47310, 40125 | 5, 10 and 25 ml |
Gilson pipettes | SLS | F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 | P2 – P1000 |
Pipette tips | SLS | PIP7852, PIP7834, PIP7840 | |
Micro test tube 1.5 ml | Eppendorf | 30125.15 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
PicoGreen Assay | Invitrogen | P7589 | Assay set-up in the dark |
Black 96-well plate | Greiner Bio One | 655086 | |
Fluorescent plate-reader | BGM Labtech | FLUOstar Optima | |
Glutaraldehyde 25 % | TAAB Laboratories | G002 | Made to a concentration of 1.5 % v/v in PBS |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 999-97-3 | |
Aluminium stubs (SEM) | Agar Scientific | G301 | |
Carbon tabs (SEM) | Agar Scientific | G3347N | |
Gold sputter coater | Edwards | S150B | |
Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom World | Phenom Pro |