The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.
Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.
Se necesitan estrategias para describir minuciosamente las características de la hemodinámica cerebral en el sistema nervioso central de los animales pequeños para avanzar en el campo de la neurociencia 1-3. La técnica presentada muestra cómo realizar acústica no invasiva y de imagen fotoacústica en cerebro pequeño animal con el fin de examinar la biología vascular, disposición y función.
Técnicas de imagen ópticos permiten la localización de eventos relacionados con la actividad neuronal 2,4-5 y adquieren simultáneamente señales generadas por la hemoglobina, tanto en estados oxigenados y no oxigenados 6. Sin embargo, debido a la absorción y la dispersión fotónica, la imagen óptica pura sufre de pobre resolución espacial y el tejido limitada profundidad de penetración 7-8. Por el contrario, la acústica ofrecen la oportunidad de realizar las imágenes más profunda con mayor resolución espacial espacio, pero se ve obstaculizado por el moteado y limitada contraste 9-11. Mediante la combinación de características de la fotónica wiº ultrasonido, la técnica fotoacústica mejora tanto la formación de imágenes de diagnóstico y potencialidades de los métodos individuales 12-16.
Formación de imagen fotoacústica del cerebro tiene el potencial para dilucidar múltiples preguntas en la neurobiología, sin embargo, el casquete que protege naturalmente, el encéfalo, limita drásticamente tanto el 17-19 penetración en el tejido fotónico y ultrasonidos. Por otra parte, los huesos promover la dispersión de la luz y el sonido resulta en la pérdida de la sensibilidad y de la imagen aberraciones 17-18. Como consecuencia, ultrasónica cerebro y la formación de imagen fotoacústica se pueden realizar fácilmente en animales recién nacidos antes de la osificación 20, pero la profunda anatomía y la fisiología del cerebro adulto son claramente accesible sólo después de una craneotomía 21,22. Lamentablemente, la cirugía necesaria para la eliminación de cráneo es técnicamente difícil y sus efectos pueden ser perjudiciales para algunos fines experimentales por lo que es difícil de controlar la progresión de la enfermedad neuronal en elmismo animal con el tiempo. Por lo tanto, un método no invasivo para imagen profunda biología cerebral en modelos de animales pequeños es altamente deseable. En la literatura el método de fotón reciclador 17 se reporta como una manera de reducir la pérdida de teléfono y aumentar la transmitancia a través del cráneo intacto, la mejora de la señal fotoacústica a ruido (SNR) y el contraste de la diana.
El protocolo presentado tiene como objetivo proporcionar un método fiable para acústica cerebro subcortical y formación de imagen fotoacústica en roedores investigación de uso (específicamente en ratas) sin ningún tipo de cirugía invasiva. El procedimiento se basa en el uso de dispositivos portátiles de transducción de ultrasonido de alta frecuencia y la formación de imagen fotoacústica. A diferencia de la tecnología de imágenes tomográficos 23, portátil y transductores direccionales 24 Habilitar selección de regiones específicas de cráneo con espesor reducido de forma natural, denominado fisuras o scissures. Los grandes hendiduras (forámenes) presentes en el vertebrado unNimal cráneo son necesarios para localizar los haces de nervios, vasos u otras estructuras de conexión circuitos encéfalo internos a otras partes del cuerpo. Los grandes hendiduras se encuentran en las aberturas de hueso de diferentes tamaños que pueden ser explotadas como pasajes específicos para las ondas de ultrasonido y láser. Tal formación de imágenes dirigida reduce los efectos de reflexión de onda causadas por las interfaces de hueso y aumenta la sensibilidad al aumentar la profundidad de penetración de formación de imágenes. En esta perspectiva, el transductor de formación de imágenes puede estar dispuesto para ser perpendicular a las hendiduras situadas en el temporal y en el lado occipital del cráneo (Figura 1), con el fin de converger máximo el ultrasonido y rayos fotónicos en estas áreas. Esta orientación tanto mejora la calidad de la señal y las fuerzas de la señal para proceder a través de una capa más delgada de hueso con respecto a otras orientaciones craneales. Por lo tanto, las ondas transmitidas y reflejadas se someten a un menor grado de dispersión, lo que permite colección de señales intensas procedentes de más profundacapas de tejido. En contraste con los procedimientos anteriores, esta configuración experimental requiere de afeitar la cabeza justo animal, mientras que ningún otro tipo de cirugía es necesaria.
Con el protocolo propuesto, las imágenes se realiza en relativamente alta resolución espacial, revelando tanto, las estructuras anatómicas de referencia específica y los vasos sanguíneos más profundos que el estado actual de los métodos de la técnica, a la vez que la piel del animal y del cráneo permanecen intactos. Imágenes coronales y axiales únicos pueden ser adquiridos mediante la explotación de diversas modalidades de adquisición de imágenes por ultrasonidos (B, Doppler de potencia, color Doppler, modo de onda pulsada) en paralelo a la imagen fotoacústica. Un repertorio extenso de parámetros se puede extraer de estas imágenes, lo que permite la representación de parénquima y la anatomía vascular junto con toda una colección de características que afectan a la dinámica de circulación de la sangre. Este protocolo se puede utilizar para obtener imágenes de las características básicas del parénquima cortical en alta frecuencia Modo ultrasónico B modalidad, las arterias carótidas basilar e internos (BA e ICA respectivamente) que componen el Círculo de Willis, la arteria cerebral media (ACM) y otros detalles del aparato circulatorio. Además, la cuantificación del flujo sanguíneo, significa velocidades de las corrientes, la descripción movimiento direccional y los datos de saturación de oxígeno se puede recoger de cortical a las regiones profundas del cerebro.
Esta nueva estrategia tiene un gran potencial para una variedad de aplicaciones y satisface la necesidad urgente de procedimientos confiables para representar características profundas del cerebro que son cruciales en diversas patologías. Por otra parte, debido a su mínima invasividad, el protocolo presentado puede permitir posibles estudios de imagen miríada sobre el sistema nervioso central, en particular aquellos que requieren un monitoreo a largo plazo o que involucre delicados modelos animales patológicos.
El protocolo presentado fue optimizado con el fin de proporcionar un rendimiento muy eficaz de imágenes cerebrales en animales pequeños. Las imágenes pueden ser adquiridas en las diferentes modalidades de precisión siguiendo las indicaciones sobre los parámetros de adquisición y el posicionamiento del transductor en forámenes cráneo. En particular, el posicionamiento en el lado temporal es el más crítico, ya que los EE.UU. y el láser tienen que estar centrado con la mayor precisión posible penetrar correctamente el agujero, lo cual es más pequeño que el occipital. Sin embargo, gracias a esta configuración experimental, características hemodinámicas relacionadas con concursos fisiológicos o incluso patológicos son accesibles y se pueden evaluar incluso en regiones profundas del cerebro, que suelen ser difíciles de caracterizar.
Desde la adquisición de imágenes exitosa depende de la exactitud del posicionamiento del transductor, esta dependencia ha de tenerse muy en cuenta, ya que puede afectar al rendimiento de imagen. Por ejemplo,algunas estructuras anatómicas de interés podrían no ser completamente incluidos en el plano de la imagen de adquisición y su identificación a partir de imágenes que ofrecen sólo una visión parcial podría resultar subóptimo. Por otra parte, una adquisición de imágenes de Estados Unidos y PA realizado en una modalidad en tres dimensiones (3D Mode) no sería compatible con la configuración experimental se ha descrito anteriormente, ya que requiere el transductor para mover a lo largo de un camino automatizado predefinido. Por último, debido a la variabilidad anatómica natural, la dimensión de las aberturas del cráneo puede variar significativamente entre los animales, lo que repercute impredecibles sobre el proceso de adquisición. Este hecho hace dependiente de la calidad de imagen de las características de cada individuo. En consecuencia, la imposibilidad de aplicar esta estrategia para algunos animales tiene que ser considerado en el diseño del protocolo experimental.
En concreto, un notable interés está dirigido a la hemodinámica, debido a su papel fundamental en la determinación de labiodistribución de medicamentos u otras moléculas exógenas después de la administración sistémica 28-29. Las consecuencias aplicativas en el campo de la Imagen Molecular son muchas, que van desde la validación de los agentes de contraste de imagen piscina de sangre para estudios de administración de fármacos imagen supervisado requieren inducida por ultrasonidos BBB abertura 30. Todos estos propósitos de investigación sin duda beneficiarse de la mínima invasividad del protocolo, teniendo en cuenta que, sin ningún tipo de cirugía adicional, el riesgo de muerte o efectos secundarios no deseados se reduce sustancialmente y el seguimiento a largo plazo en los mismos modelos animales es factible.
En resumen, el protocolo presentado permitirá al practicante de manera eficiente imagen e interpretar correctamente la topografía anatómica y el patrón vascular de los tejidos normales o patológicos cerebrales en modelos animales de investigación de uso. Mientras que los métodos actuales son principalmente limitadas a tomográficos de imagen cortical 25-27, esta configuración da la oportunidad de ePara ilustrar varios procesos que influyen en la fisiología cerebral profunda, mediante la fusión de ventajas que ofrece tanto imágenes Unidos y PA.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
High frequency ultrasound and photoacoustic imaging station (VEVO LAZR 2100 system) | FUJIFILM VisualSonics Inc. | ||
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | FUJIFILM VisualSonics Inc. | http://www.visualsonics.com/anesthesiasystem#sthash.opODt Sht.dpuf |
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Ultrasound Transmission Gel (Aquasonic 100) | PARKER LABORATORIES INC. | 01-08 | http://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp |
Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | Three helathy 6-weeks old Sprague-Dawley rats were purchased by Charles River Laboratories and kept in standard housing (12 h light-dark cycles) with a standard rodent chow and water available ad libitum. Provided by: http://www.criver.com/ |