The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.
Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.
Estratégias para descrever minuciosamente características da hemodinâmica do cérebro no sistema nervoso central de animais pequenos são necessários para fazer avançar o campo de neuroscience 1-3. A técnica apresentada demonstra como executar acústica não-invasivo e de imagem fotoacústica no cérebro pequeno animal a fim de examinar a biologia vascular, arranjo e função.
Técnicas de imagem Optical permitir a localização de eventos relacionados com a atividade neural 2,4-5 e adquirir simultaneamente os sinais gerados pela hemoglobina, tanto em estados oxigenada e não oxigenados 6. No entanto, devido à absorção e espalhamento fotônico, imageamento óptico puro sofre de baixa resolução espacial e tecido limitada profundidade de penetração 7-8. Por outro lado, a acústica oferecem a oportunidade de realizar imagem mais profunda com maior resolução espacial espaço, mas é impedido por salpico e limitado contraste 9-11. Através da combinação de características de fotônica with ultra-som, técnica fotoacústica melhora tanto de imagem e potencialidades de diagnósticos de métodos únicos 12-16.
Imaging Fotoacústica do cérebro tem o potencial para elucidar questões de múltipla em neurobiologia, no entanto, a calota craniana que naturalmente protege o encéfalo, dramaticamente limita tanto a 17-19 penetração nos tecidos fotônicos e ultra-som. Além disso, os ossos promover dispersão de luz e som, resultando em perda de sensibilidade e de imagem aberrações 17-18. Como conseqüência, ultra-som e de imagem fotoacústica cérebro pode ser facilmente realizada em animais recém-nascidos antes de ossificação 20, mas a anatomia profunda e fisiologia do cérebro adulto são claramente acessível apenas após craniotomia 21,22. Infelizmente, a cirurgia necessária para a remoção do crânio é tecnicamente difícil e os seus efeitos podem ser prejudicial para alguns fins experimentais, tornando assim difícil para monitorar a progressão da doença neural nomesmo animal ao longo do tempo. Portanto, um método não-invasivo para a imagem biologia cerebral profunda em pequenos modelos animais é altamente desejável. Na literatura o método de fotões reciclador 17 é relatado como uma forma de reduzir a perda de telefone e aumentar a transmissão através do crânio intactos, melhorando o sinal fotoacústico para ruído (SNR) e o contraste do alvo.
O protocolo apresentado tem como objetivo fornecer um método confiável para acústica cérebro subcortical e imagem fotoacústica em roedores de uso investigação (especificamente em ratos), sem qualquer cirurgia invasiva. O procedimento baseia-se no uso de dispositivos portáteis de transdução de ultra-som de alta frequência e de imagem fotoacústica. Em contraste com a tecnologia de imagens tomográficas 23, portátil e transdutores direcionais 24 permitem a seleção de regiões específicas do crânio com espessura naturalmente reduzido, denominado fissuras ou scissures. As fendas principais (forames) presentes no vertebrado umnimal crânio são necessárias para localizar os feixes de nervos, vasos ou outras estruturas que ligam os circuitos internos do encéfalo para outras partes do corpo. As fendas principais são encontrados em aberturas osso de diferentes tamanhos que podem ser explorados como passagens específicas para as ondas de ultra-som e de laser. Tal imagem alvo reduz efeitos de reflexão de ondas causados pelas interfaces de osso e aumenta a sensibilidade, aumentando a profundidade de penetração de imagem. Nesta perspectiva, o transdutor de imagem podem ser dispostos de modo a ser perpendicular às fissuras localizadas no temporal e occipital do lado do crânio (Figura 1), de modo a convergir maximamente o ultra-som e vigas fotónicas sobre estas áreas. Esta orientação aumenta tanto a qualidade do sinal e força o sinal para prosseguir através de uma camada de osso mais fino em relação a outras orientações cranianos. Assim, as ondas transmitidas e reflectidas sofrer um menor grau de espalhamento, permitindo recolha de sinais intensos provenientes de mais profundocamadas de tecido. Ao contrário dos procedimentos anteriores, esta configuração experimental requer que raspa a cabeça apenas animal, enquanto nenhuma outra cirurgia é necessária.
Com o protocolo proposto, a imagem latente é realizada a relativamente alta resolução espacial, revelando tanto, estruturas anatômicas de referência específicos e vasos sanguíneos mais profundos do que estado atual de métodos de arte, tudo ao mesmo tempo a pele do animal e do crânio permanecem intactos. Imagens coronais e axiais exclusivos podem ser adquiridos através da exploração de diversas modalidades de aquisição de imagens de ultra-som (B, Doppler, Doppler colorido, modo de onda pulsada) em paralelo à imagem fotoacústica. Um repertório extenso de parâmetros podem ser extraídos a partir dessas imagens, permitindo representação da anatomia vascular do parênquima e ao lado de um conjunto de características que afectam toda a dinâmica de circulação sanguínea. Este protocolo pode ser usado para imagem características básicas parênquima cortical em High Frequency modalidade Ultrasonic B Mode, as artérias carótidas basilar e internos (BA e ICA respectivamente) compondo o Círculo de Willis, a artéria cerebral média (MCA) e outros detalhes do aparelho circulatório. Além disso, o sangue quantificação do fluxo, a média de velocidades de transmissão, descrição direcional movimento e dados de saturação de oxigênio podem ser coletadas de cortical para regiões profundas do cérebro.
Esta nova estratégia tem um grande potencial para uma variedade de aplicações e satisfaz a necessidade urgente de procedimentos seguros para descrever características profundas do cérebro que são cruciais em várias patologias. Além disso, devido à sua capacidade de invasão mínima, o protocolo apresentado pode permitir estudos de imagem possíveis inúmeras sobre o sistema nervoso central, particularmente aqueles que necessitam de um acompanhamento a longo prazo ou envolvendo modelos animais patológicas delicados.
O protocolo foi optimizado apresentados a fim de proporcionar um desempenho altamente eficaz de imagens do cérebro em animais de pequeno porte. As imagens podem ser adquiridas em diferentes modalidades, seguindo exatamente as indicações sobre os parâmetros de aquisição e o posicionamento do transdutor na foramina crânio. Em particular, o posicionamento no lado temporal é a mais crítica, uma vez que os EUA e o laser tem de ser centrados com tanta precisão quanto possível penetrar correctamente o forame, que é menor do que o occipital. No entanto, graças a essa configuração experimental, características hemodinâmicas relacionadas com concursos fisiológicos ou mesmo patológicos são acessíveis e podem ser avaliadas, mesmo em regiões profundas do cérebro, que geralmente são de difícil caracterização.
Desde a aquisição da imagem de sucesso depende da precisão do posicionamento do transdutor, esta dependência tem de ser cuidadosamente levado em conta, pois pode afetar o desempenho de imagem. Por exemplo,algumas estruturas anatômicas de interesse não pode ser completamente incluído no plano de imagem aquisição e sua identificação a partir de imagens que oferecem apenas uma visão parcial pode resultar abaixo do ideal. Além disso, uma aquisição de imagem e US AF realizada em uma modalidade tridimensional (3D Modo) não seria compatível com o ambiente experimental descrito anteriormente, uma vez que requer que o transdutor se mover ao longo de um caminho pré-definido de forma automatizada. Finalmente, devido à variabilidade natural da anatomia, a dimensão de aberturas crânio pode variar significativamente entre animais, tendo, portanto, consequências imprevisíveis sobre o processo de aquisição. Este facto faz com que a qualidade de imagem dependente das características de cada indivíduo. Consequentemente, a impossibilidade de aplicar esta estratégia para alguns animais tem que ser considerado na concepção do protocolo experimental.
Especificamente, um notável interesse é dirigido a hemodinâmica, devido ao seu papel fundamental na determinação dabiodistribuição de drogas ou outras moléculas exógenas após administração sistémica 28-29. As implicações aplicativas no campo da Imagem Molecular são muitos, que vão desde a validação de agentes de contraste de imagem piscina de sangue para estudos de distribuição de drogas monitoradas-imagem que requerem induzida por ultra-som BBB abertura 30. Todos esses fins de pesquisa certamente vai se beneficiar da capacidade de invasão mínima do protocolo, considerando-se que, sem qualquer tipo de cirurgia adicional, o risco de morte ou efeitos colaterais indesejados é substancialmente reduzido e monitoramento de longo prazo sobre os mesmos modelos animais é viável.
Em resumo, o protocolo apresentado permitirá ao praticante eficientemente imagem e para interpretar correctamente a topografia anatómica e do padrão vascular de tecidos normais ou patológicos cerebrais em-uso investigação modelos animais. Enquanto os métodos atuais são principalmente limitado a imagem tomográfica cortical 25-27, esta definição dá a oportunidade to ilustram vários processos que influenciam a fisiologia cerebral profunda, através da fusão de vantagens concedidas tanto de imagem dos EUA e PA.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
High frequency ultrasound and photoacoustic imaging station (VEVO LAZR 2100 system) | FUJIFILM VisualSonics Inc. | ||
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | FUJIFILM VisualSonics Inc. | http://www.visualsonics.com/anesthesiasystem#sthash.opODt Sht.dpuf |
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Ultrasound Transmission Gel (Aquasonic 100) | PARKER LABORATORIES INC. | 01-08 | http://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp |
Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | Three helathy 6-weeks old Sprague-Dawley rats were purchased by Charles River Laboratories and kept in standard housing (12 h light-dark cycles) with a standard rodent chow and water available ad libitum. Provided by: http://www.criver.com/ |