Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).
Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein’s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.
شبكات التفاعل البروتين (دبابيس) تقدم قرارا خريطة منخفضة من كيفية تنظيم البروتينات وظيفيا في الخلية 1. كل اتصال فعلي بين اثنين من البروتينات، أو تفاعل البروتين البروتين (PPI)، قد تمثل الجمعية التي هي مستقرة في الوقت المناسب، مثل تلك التي وجدت داخل المجمعات البروتين والتي تساهم في التنظيم الهيكلي للخلية. قد تمثل هذه الاتصالات أيضا الجمعيات عابرة التي تنظم النشاط والاستقرار والتوطين والتفاعلات بين الشريكين. تحديد الشركاء التفاعل المادي للبروتين معين بالتالي يوفر المعلومات الغنية على وظيفة والتنظيم لهذا البروتين 2،3. لهذه الأسباب، وقد وضعت جهود كبيرة نحو رسم الخرائط من الدبابيس في الكائنات النموذج، بما في ذلك كولاي 4-6 ونبات الأرابيدوبسيس thaliana 7، خميرة الخباز 8-12، ذبابة الفاكهة البطن </ م> 13، انواع معينة ايليجانس 14 والانسان العاقل 15. وقد وفرت هذه الدراسات معلومات هامة عن كيفية تنظيم البروتينات في الخلية وبالتالي المعلومات الأساسية على البروتينات مع وظائف لم تكن معروفة سابقا.
وقد وضعت عدة استراتيجيات على مر السنين لدراسة الدبابيس. هذه التقنيات يمكن تصنيفها على نطاق واسع في ثلاث فئات على أساس هذا النوع من المعلومات التي يقدمونها على مثبطات مضخة البروتون (استعراضها في 16-18). ويستند أول واحد على الخميرة اثنين الهجين ومشتقاته 19. توفر هذه التقنيات من المعلومات عن ارتباط مباشر بين أزواج من البروتينات، التي تسمح ببناء شبكات الثنائية. ويستند الأسرة الثانية على تنقية تقارب من البروتينات الطعم وتحديد الشركاء المرتبطة بها، مثل تنقية تقارب تليها قياس الطيف الكتلي 20. هذه النهج تحديد مجموعات من البروتينات التي هي مباشرةأو المرتبطة بشكل غير مباشر، عموما بطريقة مستقرة، وتكون قوية للغاية لتحديد المجمعات البروتين. ويستند هذا النهج الثالث على المقايسات تكامل البروتين شظية (PCAs) 11،21. ويوفر هذا النهج على المستوى المتوسط من قرار بين النهجين السابقة، لأنها تتيح الكشف عن جمعيات مباشرة والداني بين البروتينات. كل تقنية لها قوتها الخاصة والضعف، كما استعرضت مؤخرا 18.
وPIN حقيقية النواة أفضل وصف هو إلى حد بعيد واحدة من الخميرة في مهدها خميرة الخباز، ويرجع ذلك جزئيا بروتيوم منه هو نسبيا أقل تعقيدا من تلك التي حقيقيات النوى نموذج الأخرى، ولأن المقايسات الإنتاجية العالية للكشف عن وأول مرة يتم يعاير مثبطات مضخة البروتون وأكثر كفاءة تنفيذها في هذا النموذج الحي 9-12. وهناك طريقة قوية بشكل خاص لنظام الخميرة هو اختزال ثنائي هيدروالفولات البروتين شظية تكامل فحص (DHFR-PCA)، مقايسة التي كانتيستخدم في سياقات مختلفة لدراسة PIN الخميرة في الظروف القياسية ومضطرب 11،22-26. ويعتمد هذا الأسلوب على فحص البقاء على قيد الحياة التي تمكن من الكشف عن مثبطات مضخة البروتون المباشرة وشبه المباشرة لبروتين الطعم يعطى في كل من مستويات التعبير الذاتية وتعريب التحت خلوية الأصلية للشركاء التفاعل 11،21 بطريقة كمية 27. إشارة تم الحصول عليها باستخدام هذا الاختبار (أي حجم مستعمرة على صفائف مستعمرة عالية الكثافة) وبالتالي يعكس كمية البروتين المجمعات التي تشكلت بين الطعم والفريسة في بيئة الخلوية يعادل تقريبا إلى واحدة من الخلايا من النوع البري. ويستند هذا الفحص على إعادة تشكيل انزيم مراسل تشارك في عملية الأيض حمض الفوليك، واختزال ثنائي هيدروالفولات (DHFR)، حيث يتم جلب اثنين من شظايا التكميلية للDHFR التي تنصهر فيها لاثنين من البروتينات ذات الاهتمام إلى القرب عندما تتفاعل البروتينات اللتين بدوره يؤدي إلى إعادة عكسها من نشاط انزيم 11 ونمو السلالة على المتوسط تحتوي على الميثوتريكسيت (MTX، الشكل 1). هذا المركب يثبط انزيم DHFR الذاتية، ولكن ليست واحدة تحور المستخدمة في فحص 28. مجموعتين من سلالات PCA، واحدة تحتوي على ~ 4،300 ماتا سلالات مع تنصهر ORF إلى DHFR F [1،2] شظية واحدة تحتوي على ~ 4،800 MAT α سلالات مع تنصهر ORF إلى DHFR [3] جزء، ويمكن شراؤها ل تنفيذ DHFR-PCA على نطاق صغير أو كبير في أي مختبر. هنا، نحن تصف بروتوكول عام ولكن مفصلا إلى الشاشة لمثبطات مضخة البروتون بين واحد من البروتين الطعم و~ 4،800 البروتينات فريسة باستخدام هذا الاختبار.
نحن تصف البروتوكول على أساس فحص DHFR-PCA تمكين تحديد منهجي لinteractors المادية لأي بروتين الطعم يعطى في الإنتاجية العالية. هذا البروتوكول يمكن تكييفها عن طريق فحص لمزيد من الطعم، وهذا على أي مستوى المطلوب من النسخ المتماثل. ونحن لشرح موثوقية هذا البروتوكول من قبل تحديد الشركاء التفاعل الجسدي لبروتين الطعم المشاركة في مجمع المسام النووية: Nup82. تحليلنا تمكين للعثور على خمسة interactors عنها سابقا واحد غير المبلغ عنها سابقا interactor ل(أرقام 3F & 3G)، وتسليط الضوء على قدرة طريقة لدراسة interactome بروتين الخميرة.
بروتوكول الموصوفة هنا يتضمن العديد من الخطوات الهامة التي المجرب وينبغي الالتفات. ونحن نوصي ل1) تأكد من أن DHFR الطعم F [1،2] الانصهار هو الصحيح (الشكل 1B)؛ هذا يمكن تحقيقه من خلال تسلسل البناء وقياس آثافةجي تعبير البروتين الصحيح باستخدام مضاد للDHFR F [1،2] أو مكافحة DHFR F [3] الأجسام المضادة. 2) قبل بداية الشاشة، فمن المستحسن للتحقق إن وجدت الطعم من مصلحة المعارض التفاعلات منحل في شاشات PCA. ويمكن القيام بذلك عن طريق أداء شاشات التحكم مع الطعوم عبرت مع سيطرة L-DHFR المناسبة أو عن طريق التزاوج يدويا الطعم مع سيطرة L-DHFR المناسبة وإجراء فحص النمو في MTX المتوسطة. 3) ينبغي صب لوحات اليوم قبل استخدامها بحيث الرطوبة المثلى لتمسك الخلايا على سطح أجار أثناء عملية الطباعة. 4) لوحات المصدر لا ينبغي أن تستخدم أكثر من أربع مرات لنقل ما يكفي من الخلايا على لوحة الوجهة. زيادة عدد النسخ من لوحة جهة يمكن أن تقوم به خطوات متتالية من التوسع (على سبيل المثال 4 نسخ -> 16 نسخ -> 64 نسخة). بدلا من ذلك، والخلايا يمكن التقاطها في مواقع مختلفة على مروج أو في المستعمرة بين جولات مختلفة من تكرارها. 5) إذا كان عدة صositions مفقودة بعد اختيار مضاعفا (ق)، وتأكد من أن لوحات مصدر لم تستخدم في كثير من الأحيان في الخطوة التزاوج (الخطوات 4،5-4،7)؛ 6) التأكد من أن متوسط MTX يحتوي على جميع المكونات الأساسية في تركيزات الصحيحة. في الواقع، إذا لوحظ أي نمو على الإطلاق على المدى المتوسط MTX، يمكن أن يكون إما لأنه لا يوجد التفاعل هو للكشف عن طريق PCA للبروتينات في المصالح أو لأنه لم يتم إعداد المتوسطة MTX بشكل صحيح. للتأكد من أن يسمح المتوسطة نمو سلالات تظهر DHFR شظايا تكامل، ويمكن إضافة التفاعل التأسيسي في مواقع فارغة من جمع واستخدام مثل مراقبة إيجابية مثل DHFR-شظايا تنصهر ليسين الأنصاف سحاب 33 (الشكل 1C). سوف الاختبارات المتوازية باستخدام شظايا رابط-DHFR أو شظايا سحاب-رابط-DHFR تسمح للتمييز بين الشروط التي تسمح لجميع الخلايا لتنمو (تركيز منخفض MTX أو البروتين الطعم التي تميل إلى جعل تفاعلات إيجابية كاذبة، كما أن described أدناه)، والظروف التي تحول دون نمو جميع سلالات (المكون تركيز MTX عالية جدا أو أساسي مفقود في المتوسط)؛ 7) ونظرا إلى أن PCA يتم تنفيذ من خلال جولات متعاقبة من مكررات من وسط إلى آخر، قد يحدث التلوث العرضي بين سلالات بين لوحات مختلفة إذا، على سبيل المثال، لا يتم تعقيمها دبوس أداة بشكل صحيح بين جولات تكرار و / أو الماء الماضي حمام (محطة أي الرطب) في إجراء التعقيم ملوثة من قبل مستعمرات جولات النسخ السابقة. عدة مناصب على صفائف فارغة وبالتالي يمكن استخدامها كمواقع السيطرة حيث ينبغي مراعاة أي نمو للكشف عن التلوث عبر.
لا يمكن أن يؤديها تحليل الصور باستخدام عدة برامج نشرت (انظر القسم 5 من البروتوكول) أو أي برنامج نصي مخصص. في هذه الدراسة، وسيناريو مخصص ينفذ الخطوات التالية: 1) السيناريو يطرح القيم بكسل لوحة فارغة إلى بكسل القيم من كل لوحة من أجل أن تشاركrrect عن التحيزات الإضاءة. 2) البرنامج النصي بتحويل كل صورة لتصحيح الخلفية لثنائي باستخدام عتبة قيمة بكسل 10. 3) لكل 1،536 مواقف كل لوحة، والتي تحددها تتراكب مستطيل على المستعمرات الحافة، والنصي يعمل يماغيج "تحليل الجزيئات … "وظيفة في مجموعة دائرية. يتم تعيين اختيار دائرية نصف قطرها يساوي الفترة الفاصلة بين موقعين ناقص 10 بكسل. 4) السيناريو يختار أقرب الجسيمات من مركز التحديد ويؤكد على أنها مستعمرة إذا موقعها ليست أكثر من نصف الفترة الزمنية الفاصلة بين مستعمرتين بعيدا عن مركز التحديد. 5) ويقيس النصي القيم بكسل من الجسيمات المختارة على الصورة لتصحيح الخلفية. 6) لمزيد من تصحيح أي المتبقية التحيزات الإضاءة الخلفية، والسيناريو يطرح قيمة متوسط من كل بكسل من الاختيار الدائرية التي لم تكن جزءا من الجسيمات إلى القيم بكسل للمستعمرة. مجموع هذه القيمة بكسل تصحيحالصورة، المخزنة في العمود "IntDenBackSub" من الجدول التكميلي 1، وتستخدم كمقياس لحجم مستعمرة.
والخطوة الحاسمة في الجزء التحليل هو الخيار عتبة أهمية. هنا، اخترنا عتبة على أساس توزيع السلبي L-DHFR F [3] ضوابط، ولكن اعتمادا على الهدف من الشاشة، قد تكون هذه العتبة صارمة للغاية. في الواقع، L-DHFR F [3] overexpressed الضوابط (المروج TEF قوي) بحيث شظايا التكميلية قد عفويا يكمل كل منهما الآخر، وهذه هي بالتالي لا تمثل التعبير عن معظم البروتينات. ويبرز هذا من حقيقة أن توزيع L-DHFR F [3] ضوابط أعلى من متوسط النمو الخلفية (الشكل 3D). وهكذا، وبعض التفاعلات وجود عشرات أدناه هذه العتبة صارمة ولكن هذا بشكل واضح خارج لتوزيع النمو الخلفية يمكن اعتبار الزيارات المفترضة التي قد تمثل، على سبيل المثال، بين عابرة أو ضعيفةالإجراءات. ويمكن مزيد من الدراسة والتحقق من صحتها عبر إذا، على سبيل المثال، لا يتم أعرب عن البروتينات اثنين على المستويات التي يمكن أن تسمح للتكامل عفوية من شظايا DHFR مثل الضوابط L-DHFR. وكبديل لذلك، يمكن للمرء أن وضع عتبة أهمية على أساس نسبة من التداخل مع interactors المادية التي أعلن عنها في قواعد البيانات مثل BioGRID 35 من أجل تعظيم نسبة الإيجابيات الحقيقية على ايجابيات كاذبة. ومع ذلك، خلافا للاستخدام توزيع L-DHFR، هذا البديل قد لا يكون دائما مجديا إذا، على سبيل المثال، فإن عدد interactors المادية المعروفة ليست عالية بما فيه الكفاية. وعلاوة على ذلك، فإن اختيار عتبة أهمية له تأثير على نسبة كاذبة ايجابيات وسلبيات كاذبة في مجموعة البيانات النهائي. في الواقع، مثل أي دولة أخرى فحص الكشف عن مؤشر أسعار المنتجين، ويمكن ايجابيات كاذبة تنجم عن تفاعل غير محدد من البروتين مع البروتين DHFR الانصهار إذا، على سبيل المثال، والبروتين وفيرة للغاية كما ذكر في وقت سابق. هذاويتضح من حقيقة أن بعض يفترس تتفاعل بشكل منتظم مع جميع البروتينات الطعم في شاشات PCA، وبالتالي تحتاج إلى إزالتها من تحليل 11 (على سبيل المثال Tef2 وAde17 والجدول التكميلي 2). للتحايل على هذه المشكلة، وشاشة تحكم PCA من المجموعتين ضد السيطرة L-DHFR المناسبة (F [1،2] أو F [3]) لتحديد الطعم ويفترس واظهار عفوية DHFR شظايا تكامل لا يمكن أن يؤديها في شروط محددة كل شاشة. وعلاوة على ذلك، إجراء تحليل لتخصيب جين علم الوجود يمكن أن تزيد من الثقة في البيانات إذا كان من المعروف وظيفة الطعم معين. من ناحية أخرى، يمكن أن DHFR-PCA تؤدي إلى السلبيات كاذبة لعدة أسباب: 1) ليس كل البروتينات يمكن أن تنصهر إلى شظايا DHFR لأن هذه قد زعزعة الاستقرار في البروتينات أو تعديل التعريب في حال، على سبيل المثال، والانصهار DHFR ل C-محطة يتداخل مع إشارة توطين. 2) إعادة DHFR في بعض الأجزاء الخلوية Mالمنعم يوسف لا تنتج حمض الفوليك إذا، على سبيل المثال، شرطا ضروريا لتخليق حمض الفوليك غير متوفر؛ 3) C مصطلحات حاجة إلى أن يكون على مسافة من 8 نانومتر لDHFR تكامل تحدث 11. وبالتالي، قد لا يتم الكشف عن تفاعل المعروفة إذا بهم C-مصطلحات ليست قريبة بما فيه الكفاية في الفضاء. ويتمثل هذا هنا من حقيقة أن جزءا كبيرا من التفاعلات الفيزيائية Nup82 التي أعلن عنها في قواعد البيانات، ومعظمها غير مباشرة، لم تكتشف في فحص لدينا. وبالمثل، فإن التفاعلات بين البروتينات الغشاء من أجلها C-مصطلحات هي في غير المشبعة نسبة إلى الغشاء لا يؤدي إلى DHFR شظايا تكامل ولن يتم الكشف عن 11. القيود 1) و 3) يمكن التحايل ببساطة نسبيا عن طريق دمج جزء DHFR إلى N-مصطلحات من البروتين. القيام بذلك قد يمنع التدخل في إشارة توطين بالقرب من C-مصطلحات وقد تسمح للكشف عن وجود تفاعل بين البروتينات الغشاء الذي N و C-محطة هي في قريب رابطة الدول المستقلةلغشاء.
لا تزال العديد من التحديات في دراسة الصنوبر (استعراضها في 2،3). إلى حد كبير وصفت الخرائط من الدبابيس أنتجت حتى الآن في حالة تجريبية واحدة لكل نوع وبالتالي توفر لقطة واحدة من كيفية تنظيم شبكات البروتين. ولذا فإن هناك حاجة لاستكشاف ظروف تجريبية أخرى لنرى كيف يمكن إعادة تنظيم المسامير في استجابة للتغيرات البيئية، منبهات محددة، عبر تطوير أو الطفرات التالية. سيتم التغلب على هذه التحديات من خلال تطوير تقنيات جديدة لاستجواب مثبطات مضخة البروتون في الوقت الحقيقي، في الخلايا الحية والتكيف مع التقنيات الحالية بحيث يمكن استخدامها من قبل مجتمع أكبر من المختبرات. كأسلوب الكمية التي يمكن الكشف عن التغييرات في كمية DHFR تكامل المجمعات 27، DHFR-PCA يمكن تكييفها للتغلب على هذه التحديات واستخدمت لدراسة كيفية تأثر مثبطات مضخة البروتون من قبل DNA الإضرار الوكيل 22 </sup>، العوامل الكيميائية 25، الحذف الجين 23،26 أو في أنواع الخميرة الأخرى والهجينة من 33. سوف استكشاف هذه الأبعاد الجديدة تصبح أكثر وأكثر أهمية للكشف عن ديناميكية PIN.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) المنح 191597، 299432 و324265، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث منحة كندا ديسكفري ومنحة برنامج العلوم الحدودي الإنسان إلى CRL. CRL غير محقق CIHR الجديد. ويدعم غيوم ديس من قبل زمالة PROTEO. ويدعم صموئيل روشيت التي كتبها NSERC وFRQNT المنح الدراسية.
Name of Material/Equipement | Company | Catalog Number | Comments/Description |
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |