Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).
Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein’s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.
Protein-Interaktionsnetzwerke (PIN) bieten eine niedrige Auflösung der Karte, wie Proteine funktionell in der Zelle 1 organisiert. Jeder physikalische Verbindung zwischen zwei Proteinen oder Protein-Protein-Wechselwirkung (PPI) kann eine Verbindung, die zeitlich stabil ist, wie sie in Proteinkomplexe gefunden repräsentieren und die in die strukturelle Organisation der Zelle beitragen. Diese Verbindungen können auch stellen vorübergehenden Vereinigungen, die die Aktivität, Stabilität, Lokalisierung und Interaktionen der beiden Partner zu regeln. Die Ermittlung der physikalischen Interaktionspartner eines bestimmten Proteins bietet daher reichen Informationen über die Funktion und Regulation dieses Proteins 2,3. Aus diesen Gründen haben große Anstrengungen zur Kartierung von PINs in Modellorganismen wie Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster <gesetzt worden/ Em> 13, Caenorhabditis elegans 14 und Homo sapiens 15. Diese Studien haben wichtige Erkenntnisse darüber, wie Proteine in der Zelle und damit wichtige Informationen über Proteine mit bisher unbekannten Funktionen organisiert ist.
Mehrere Strategien sind in den letzten Jahren zu studieren PINs entwickelt. Diese Technologien lassen sich grob in drei Kategorien auf der Grundlage der Art der Informationen, die sie auf PPI bieten (in 16 bis 18 überprüft) gruppiert werden. Die erste ist auf die Hefe-Zwei-Hybrid und seine Derivate 19 basiert. Diese Technologien liefern Informationen über die direkte Verbindung zwischen Paaren von Proteinen, die die Konstruktion binärer Netzwerke ermöglicht. Die zweite Familie basiert auf der Affinitätsreinigung von Köderproteine und die Identifizierung ihrer zugehörigen Partner wie Affinitätsreinigung gefolgt von Massenspektrometrie 20 basiert. Diese Ansätze identifiziert Gruppen von Proteinen, die direktoder indirekt verbunden sind, im allgemeinen in einer stabilen Art und Weise und sind extrem leistungsfähig, um die Proteinkomplexe zu identifizieren. Der dritte Ansatz beruht auf Protein-Fragment Komplementierungsassays (PKA) 11,21 basiert. Dieser Ansatz bietet ein mittleres Niveau der Auflösung zwischen den beiden früheren Ansätzen, denn sie ermöglicht Erfassung direkter und proximalen Assoziationen zwischen Proteinen. Jede Technik hat ihre eigenen Stärken und Schwächen, wie vor kurzem überprüft 18.
Die beste beschriebenen eukaryotischen PIN ist bei weitem die eines der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, zum Teil wegen seiner Proteom ist relativ weniger komplex als bei anderen Modell Eukaryoten und wegen Hochdurchsatz-Assays zum Nachweis PPI haben zunächst untersucht worden und effizienter sind in diesem Modellorganismus 9-12 implementiert. Eine besonders leistungsfähige Methode für die Hefe-System ist das Dihydrofolatreduktase-Protein-Fragment Komplementierungsassay (DHFR-PCA) ist ein Test, der gewesen istin unterschiedlichen Zusammenhängen verwendet, um die Hefe-PIN in Standard- und gestörte Bedingungen 11,22-26 studieren. Dieses Verfahren beruht auf einem Überlebens-Assay, der die Detektion von direkt und nahezu direkte PPI für eine gegebene Köderprotein sowohl endogenen Expressionsniveaus und nativen subzellulären Lokalisation der Interaktionspartner 11,21 auf quantitative Weise 27 ermöglicht. Die unter Verwendung dieses Tests (dh Koloniegröße auf High-Density-Kolonie-Arrays) erhaltene Signal spiegelt somit die Menge an Proteinkomplexen zwischen Köder und Beute in einer zellulären Umgebung fast gleichbedeutend mit dem eines Wildtyp-Zellen gebildet. Der Test basiert auf der Rekonstitution eines Reporterenzym in Folatstoffwechsel berücksichtigt, die Dihydrofolatreduktase (DHFR), wobei zwei komplementäre Fragmente von DHFR, die an die beiden Proteine von Interesse fusioniert sind, in die Nähe gebracht wird, wenn die zwei Proteine interagieren, die wiederum zu einer reversiblen Rekonstitution der Enzymaktivität 11 und das Wachstum des Stammes auf einem Medium, das Methotrexat (MTX; Abbildung 1). Diese Verbindung hemmt die endogene DHFR-Enzym, nicht aber das mutierte im Test 28 verwendet. Zwei Sammlungen von PCA-Stämmen, von denen eine ~ 4300 MATa Stämme mit ein ORF fusioniert mit dem DHFR-F [1,2] Fragment und eine mit ~ 4800 MAT α-Stämme mit einem ORF fusioniert mit dem DHFR [3] Fragment kann erworben werden Umsetzung DHFR-PCA bei kleinen oder großen Maßstab in jedem Labor. Hier beschreiben wir eine allgemeine, aber ausführliches Protokoll, um Bildschirm für die PPI zwischen einem Köderprotein und ~ 4800 Beuteproteine unter Verwendung dieses Tests.
Wir beschreiben ein Protokoll auf Basis des DHFR-PCA-Test ermöglicht die systematische Ermittlung von physikalischen Interaktoren für einen bestimmten Köderprotein bei hohem Durchsatz. Dieses Protokoll kann durch Screenen auf mehr Köder ausgelegt werden, und dies in jeder gewünschten Höhe der Replikation. Wir demonstrieren die Zuverlässigkeit dieses Protokoll durch die Identifizierung von physischen Interaktionspartner für eine Köderprotein in der Kernporenkomplex beteiligt: Nup82. Unsere Analyse aktivieren, damit Sie fünf bereits berichtet Interaktoren und einer zuvor unbekannten Interaktor (3F und 3G) zu finden, Hervorhebung der Fähigkeit des Verfahrens, um die Hefe Protein Interaktom studieren.
Das hier beschriebene Protokoll enthält einige wichtige Schritte, denen der Experimentator sollte darauf achten. Wir empfehlen 1) Stellen Sie sicher, dass der Köder DHFR F [1,2] Fusion korrekt (Abbildung 1B) ist; dies kann durch Sequenzierung der Konstruktion und measur erreicht werdening korrekte Proteinexpression mit Hilfe eines Anti-DHFR F [1,2] oder Anti-DHFR F [3] Antikörper; 2) Vor dem Beginn des Bildschirms ist, wird empfohlen, um zu überprüfen, ob jeder Köder von Interesse aufweist Promiscuous Wechselwirkungen in PCA-Bildschirme. Dies kann durch die Steuerung Bildschirme mit Ködern mit den entsprechenden L-DHFR-Steuerung oder durch manuelle Paarung den Köder mit dem entsprechenden L-DHFR-Steuerung und Durchführung einer Wachstumstest in MTX Medium gekreuzt erfolgen. 3) Die Platten sollten gegossen werden der Tag, bevor sie verwendet werden, so dass die Feuchtigkeit optimal für Zellhaftung auf der Agar-Oberfläche während des Druckvorganges; 4) Quellplatten sollten nicht mehr als vier Mal verwendet, um genügend Zellen auf der Zielplatte zu übertragen. Eine Erhöhung der Anzahl der Kopien der Zielplatte durch aufeinanderfolgende Schritte der Expansion (-> 16 Kopien -> 64 Kopien zB 4 Kopien) erfolgen. Alternativ können die Zellen an unterschiedlichen Positionen auf dem Rasen oder in der Kolonie zwischen verschiedenen Replikationsrunden abgeholt werden; 5) Sind mehrere positions werden nach der diploiden Auswahl (en), stellen Sie sicher, dass die Quellplatten wurden nicht zu oft in der Paarungsschritt verwendet fehlt (Schritte von 4,5 bis 4,7); 6) Stellen Sie sicher, dass die MTX Medium enthält alle wesentlichen Bestandteile in den richtigen Konzentrationen. Wenn nämlich kein Wachstum bei allen auf der MTX Medium beobachtet, es sein kann, entweder weil keine Interaktion durch PCA nachweisbaren für die Proteine von Interesse oder weil MTX Medium wurde nicht richtig vorbereitet. Um sicherzustellen, daß das Medium erlaubt das Wachstum von Stämmen, welche DHFR-Fragmenten Komplementierung kann eine konstitutive Wechselwirkung an leeren Positionen der Sammlung hinzugefügt werden und als eine positive Kontrolle, wie DHFR-Fragmenten an Leucin-Zipper-Einheiten 33 (1C) fusioniert werden. Parallelversuche mit den Linker-DHFR-Fragmente oder die Reißverschluss-Linker-DHFR-Fragmenten wird es ermöglichen, zwischen den Bedingungen, die alle Zellen wachsen lassen (low MTX-Konzentration oder Köderprotein, die zu falsch positiven Wechselwirkungen machen neigen zu unterscheiden, wie described unten) und Bedingungen, die das Wachstum von allen Stämmen (MTX-Konzentration zu hoch oder wesentlicher Bestandteil in das Medium fehlt) zu verhindern; 7) Da PCA wird durch aufeinanderfolgende Runden von Replikationen von einem Medium zu einem anderen durchgeführt wird, kann eine Kreuzkontamination zwischen den Belastungen zwischen den verschiedenen Platten auftreten, wenn zum Beispiel der Pin-Werkzeug nicht richtig zwischen Replikationsrunden und / oder das letzte Wasser sterilisiert Bad (dh feuchte Station) in der Sterilisationsverfahren wird von Kolonien der vorherigen Replikationsrunden kontaminiert. Mehrere Positionen auf den Arrays sind leer und kann somit als Steuerpositionen, wo kein Wachstum zu beachten, um Kreuzkontaminationen zu erkennen sein werden.
Die Bildanalyse kann unter Verwendung von mehreren veröffentlichten Software (siehe Abschnitt 5 des Protokolls) oder ein benutzerdefiniertes Skript werden. In dieser Studie, die benutzerdefiniertes Skript führt die folgenden Schritte: 1) Das Skript subtrahiert Pixelwerte einem leeren Teller auf Werte von jeder Platte, um gemeinsam PixelRRECT für die Beleuchtung Vorurteile. 2) Das Skript wandelt jedes grundkorrigierte Bild in dual mit einem Pixelwert Schwelle von 10. 3) Für je 1536 Positionen jeder Platte, durch Überlagerung ein Rechteck auf den Rand Kolonien bestimmt, wird das Skript ImageJ "Analyze Partikel … "Funktion in einer Kreisauswahl. Die kreisförmige Auswahl mit einem Radius gleich dem Abstand zwischen zwei Positionen minus 10 Pixel eingestellt. 4) Das Skript wählt die am besten Teilchen von der Mitte der Auswahl und bestätigt sie als Kolonie, wenn die Lage nicht mehr als die Hälfte des Intervalls zwischen zwei Kolonien von der Mitte der Markierung. 5) Das Skript misst Pixelwerte des ausgewählten Teilchen auf dem Hintergrund-korrigierten Bild. 6), um alle verbleibenden Hintergrundbeleuchtung spannt weiter zu korrigieren, subtrahiert das Skript den Mittelwert aller Pixel von der Kreisauswahl, die nicht Teil eines Teilchens in Pixelwerte der Kolonie waren. Die Summe dieser korrigierten Pixelwerts, in der Spalte "IntDenBackSub" des Ergänzungs Tabelle 1 gespeichert sind, werden als Maß für die Koloniegröße verwendet.
Ein kritischer Schritt in dem Analyseteil die Wahl der Signifikanzschwelle. Hier haben wir uns für einen Schwellenwert basierend auf der Verteilung des negativen L-DHFR F [3] steuert, aber je nach dem Ziel auf dem Bildschirm kann eine solche Schwelle zu streng sein. Tatsächlich L-DHFR F [3] steuert überexprimiert werden (starke TEF-Promotor), so dass die komplementären Fragmente können spontan ergänzen einander und sind deshalb nicht repräsentativ für die Expression der meisten Proteine. Dies wird durch die Tatsache, dass die Verteilung der L-DHFR F [3] steuert ist höher als der Mittelwert der Hintergrund-Wachstum (Figur 3D) hervorgehoben. So dass Wechselwirkungen mit Noten unterhalb dieser Schwelle strengere, aber das sind eindeutig außerhalb des Hinterwachstumsverteilung kann als mögliche Treffer, die darstellen können, zum Beispiel, vorübergehende oder schwache inter betrachtenAktionen. Diese können weiter untersucht werden und eine Kreuzvalidierung, wenn beispielsweise die beiden Proteine nicht ausreichte, um die spontane Komplementation der DHFR-Fragmente, wie die L-DHFR Steuerelemente ermöglichen kann ausgedrückt. Alternativ könnte man eine Signifikanzschwelle bezogen auf den Anteil der Überlappung mit berichteten physischen Interaktoren in Datenbanken wie BIOGRID 35, um den Anteil der wahren Positiven über falsche Positive zu maximieren. Im Gegensatz zu der Verwendung des L-DHFR Verteilung Diese Alternative kann nicht immer möglich sein, wenn, zum Beispiel, ist die Anzahl von bekannten physikalischen Interaktoren nicht ausreichend hoch. Darüber hinaus hat die Wahl der Signifikanzschwelle einen Einfluss auf den Anteil der falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse in der letzten Datensatz. Tatsächlich, wie jede andere PPI-Nachweistest, Fehlalarme aus unspezifischen Wechselwirkung eines Proteins mit dem DHFR-Fusionsprotein führen, wenn beispielsweise sehr reichlich das Protein wie zuvor erwähnt. Diesewird durch die Tatsache, dass einige Beute systematisch alle Köder-Proteine interagieren in PCA-Bildschirme und so veranschaulicht, müssen vor der Analyse 11 (zB TEF2 und Ade17 und Ergänzungs Tabelle 2) entfernt werden. Um dieses Problem zu, ein Steuer PCA Bildschirm der beiden Sammlungen gegenüber dem entsprechenden L-DHFR Kontrolle zu umgehen (F [1,2] oder F [3]), um Köder und Beute zeigen spontane DHFR-Fragmente Ergänzung in den spezifischen Bedingungen durchgeführt werden, zu identifizieren auf jedem Bildschirm. Außerdem Durchführung eines Gene Ontology Bereicherung Analyse kann das Vertrauen in die Daten zu erhöhen, wenn die Funktion eines bestimmten Köder bekannt ist. Andererseits kann DHFR-PCA zu falschen Negativen aus mehreren Gründen: 1 zu ergeben) nicht alle Proteine können an die DHFR-Fragmenten, da diese die Proteine zu destabilisieren oder deren Lokalisation verändern, wenn beispielsweise verschmolzen werden, das DHFR-Fusion an die C-Terminus stört eines Lokalisierungssignals; 2) DHFR Rekonstitution in einigen zellulären Kompartimenten may keine Folsäure zu erzeugen, wenn zum Beispiel ein wesentlicher Vorläufer für Folat-Synthese ist nicht verfügbar; 3) C-Termini, ob innerhalb einer Distanz von 8 nm für DHFR Komplementation auftreten 11. So kann eine bekannte Interaktion nicht erkannt werden, wenn ihre C-Termini sind nicht nah genug im Raum. Dies wird hier durch die Tatsache, dass ein großer Anteil der Nup82 physikalische Wechselwirkungen in Datenbanken, von denen die meisten indirekten gemeldet werden, wurden in unserem Test nachgewiesen exemplifiziert. Ähnlich wird membrangebundene Proteine, für die die C-Termini sind in trans relativ zu der Membran nicht zu der DHFR-Fragmenten Komplementierung und nicht erkannt wird 11. Einschränkungen 1) und 3) kann relativ einfach durch Fusionieren des DHFR-Fragments mit dem N-Terminus des Proteins, umgangen werden. Andernfalls kann es zu verhindern, mit einem Lokalisierungssignal in der Nähe des C-Terminus beeinträchtigen und ermöglichen eine Interaktion zwischen Membranproteine, deren N- und C-Terminus zu erkennen sind in cis gegenauf die Membran.
Einige Herausforderungen bleiben in der Studie von PINs (in 2,3 überprüft). Die Karten von PINs bisher produziert wurden weitgehend in einem einzigen experimentellen Bedingungen für die einzelnen Arten beschrieben worden und bieten somit eine einzelne Momentaufnahme, wie Protein-Netzwerken organisiert werden könnte. Es besteht daher ein Bedarf an der Erforschung der anderen experimentellen Bedingungen, wie PINs können als Reaktion auf Umweltveränderungen, bestimmte Reize, in die Entwicklung oder die folgenden Mutationen reorganisiert werden. Diese Herausforderungen werden durch die Entwicklung neuer Technologien für die Abfrage von PPI in Echtzeit, in lebenden Zellen und durch Anpassung der aktuellen Techniken, so dass sie von einer größeren Gemeinschaft von Laboratorien verwendet werden, überwunden werden. Als quantitatives Verfahren, das Änderungen in der Menge des verwendeten DHFR Komplementation erfassen kann Komplexe 27 kann DHFR-PCA geeignet ist, diese Herausforderungen zu überwinden und wurde verwendet, um zu untersuchen, wie EPI durch einen DNA-schädigenden Mittel 22 sind betroffen </sup>, Chemikalien 25. Gendeletionen 23,26 oder in anderen Hefearten und ihre Hybriden 33. Erforschung dieser neuen Dimensionen wird mehr und mehr an Bedeutung gewinnen, um die Dynamik der PIN offenbaren.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Canadian Institute of Health Research (CIHR) Gewährt 191.597, 299.432 und 324.265, unterstützt ein Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada Discovery-Zuschuss und ein Human Frontier Science Program Stipendium CRL. CRL ist ein CIHR New Investigator. Guillaume Diss wird von einem PROTEO Gemeinschaft unterstützt. Samuel Rochette wird von NSERC und FRQNT Stipendien unterstützt.
Name of Material/Equipement | Company | Catalog Number | Comments/Description |
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |