Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).
Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein’s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.
Eiwit interactie netwerken (PIN's) bieden een lage resolutie kaart van hoe eiwitten functioneel worden georganiseerd in de cel 1. Elke fysieke verbinding tussen twee eiwitten of eiwit-eiwit interacties (PPI), kan een vereniging die stabiel in de tijd, zoals die in eiwitcomplexen vertegenwoordigen en die bijdragen aan de structurele organisatie van de cel. Deze verbindingen kunnen ook vertegenwoordigen voorbijgaande verenigingen die de activiteit, stabiliteit, lokalisatie en interacties van de twee partners te regelen. Het identificeren van de fysieke interactie tussen partners van een bepaald eiwit biedt daarom een rijke informatie over de functie en regulatie van dat eiwit 2,3. Daarom zijn grote inspanningen tot het karteren van pincodes in modelorganismen, zoals Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster <zetten/ Em> 13, Caenorhabditis elegans 14 en Homo sapiens 15. Deze studies hebben belangrijke inzichten in hoe eiwitten worden georganiseerd in de cel en daarmee de belangrijkste informatie over de eiwitten met voorheen onbekende functies voorzien.
Verschillende strategieën zijn ontwikkeld door de jaren heen om pincodes te bestuderen. Deze technologieën kunnen grofweg worden ingedeeld in drie categorieën op basis van de soort informatie die deze voor protonpompremmers (beoordeeld in 16-18). De eerste is gebaseerd op gist-twee-hybride en zijn derivaten 19. Deze technologieën bieden informatie over de directe associatie tussen paren van eiwitten, die het mogelijk maakt de aanleg van binaire netwerken. De tweede familie is gebaseerd op de affiniteitszuivering van lokaas eiwitten en de identificatie van hun geassocieerde partners, zoals affiniteitszuivering gevolgd door massaspectrometrie 20. Deze benaderingen identificeren groepen eiwitten die directof indirect geassocieerd algemeen op een stabiele wijze, en zijn uiterst krachtig eiwitcomplexen identificeren. De derde benadering is gebaseerd op eiwit fragment complementatie bepalingen (PCA) 11,21. Deze aanpak levert een gemiddeld niveau van de resolutie tussen de twee voormalige benaderingen, omdat het laat detecteren directe en proximale associaties tussen eiwitten. Elke techniek heeft zijn eigen sterke en zwakke punten, zoals onlangs beoordeeld 18.
De best beschreven eukaryote PIN is veruit één van de gist Saccharomyces cerevisiae, deels omdat de proteoom relatief minder complex dan die van andere model eukaryoten en omdat high-throughput assays detecteren protonpompremmers vooraf zijn bepaald en zijn efficiënter geïmplementeerd in dit model organisme 9-12. Een bijzonder krachtige methode voor het gistsysteem is het dihydrofolaatreductase-eiwit fragment complementatie bepaling (DHFR-PCA), een test die isgebruikt in verschillende contexten om de gist PIN in standaard en verstoorde omstandigheden 11,22-26 te bestuderen. Deze werkwijze berust op een survival test die de detectie van directe en bijna direct PPI maakt voor een gegeven aas eiwit zowel endogene expressieniveaus en inheemse subcellulaire lokalisaties van de interactiepartners 11,21 op een kwantitatieve wijze 27. De verkregen met deze assay (dwz koloniegrootte on high-density kolonie arrays) signaal geeft dus de hoeveelheid eiwit complexen gevormd tussen het aas en prooi in een cellulaire omgeving bijna gelijk aan die van wild-type cellen. De assay is gebaseerd op de reconstitutie van een reporter enzym betrokken bij folaat metabolisme, de dihydrofolaatreductase (DHFR), waarbij twee complementaire fragmenten van DHFR die zijn gefuseerd aan de twee eiwitten van belang worden in nabijheid gebracht wanneer de twee eiwitten interageren, waarbij leidt omkeerbaar reconstitutie van de enzymactiviteit 11 en groei van de spanning op een medium dat methotrexaat (MTX Figuur 1). Deze verbinding remt de endogene DHFR enzym, maar niet het gemuteerde gebruikt in de test 28. Twee verzamelingen van PCA stammen, één met ~ 4300 MATa stammen met een ORF gefuseerd aan de DHFR F [1,2] en fragment een met ~ 4800 MAT α stammen met een ORF gefuseerd aan het DHFR [3] fragment kan worden gekocht implementeren DHFR-PCA op kleine of grote schaal in een laboratorium. Hier beschrijven we een algemeen maar gedetailleerd protocol voor het screenen op PPI tussen een lokaas eiwitten en ~ 4800 prooi eiwitten met deze assay.
We beschrijven een protocol gebaseerd op het DHFR-PCA-test waarmee de systematische identificatie van fysieke interactoren voor een bepaalde aas eiwit op high-throughput. Dit protocol kan worden aangepast door het screenen voor aas, en dit op elk gewenst niveau van replicatie. We tonen de betrouwbaarheid van dit protocol door de identificatie van fysieke interactie partners voor een aas eiwit betrokken bij de Nuclear Pore Complex: Nup82. Onze analyse nodig om de vijf eerder gerapporteerde interactoren en één niet eerder gemeld interactor (Figuren 3F & 3G) vinden, aandacht voor de mogelijkheden van de methode om de gisteiwit interactoom bestuderen.
De hier beschreven protocol omvat verschillende kritische stappen waaraan de experimentator moet letten. We raden aan om 1) Zorg ervoor dat het aas DHFR- F [1,2] fusie juiste (Figuur 1B) is; Dit kan worden bereikt door sequencing de constructie en MEASURing juiste eiwitexpressie met behulp van een anti-DHFR F [1,2] of anti-DHFR F [3] antilichaam; 2) Voorafgaand aan het begin het scherm, is het raadzaam om te controleren of er een aas van belang vertoont promiscue interacties in PCA-schermen. Dit kan door controlefuncties schermen met aas gekruist met de juiste L-DHFR controle of handmatig paren het aas met de juiste L-DHFR besturing en het uitvoeren van een groei assay MTX medium. 3) De platen moeten worden gestort op de dag voordat ze worden gebruikt, zodat vocht optimaal is voor cel hechting op de agar oppervlak tijdens het drukproces; 4) Bron platen mag niet meer dan vier keer worden gebruikt om voldoende cellen te brengen op de plaats van bestemming plaat. Het verhogen van het aantal kopieën van de bestemming plaat kan worden gedaan door opeenvolgende stappen van expansie (bv 4 kopieën -> 16 kopieën -> 64 exemplaren). Alternatief kunnen cellen worden opgehaald op verschillende posities op de grasvelden of de kolonie verschillende ronden van replicatie; 5) Als er meerdere positions worden vermist na de diploïde selectie (s), zorg ervoor dat de bron platen niet te vaak werden gebruikt bij de paring stap (stappen 4,5-4,7); 6) Zorg ervoor dat de MTX medium bevat alle essentiële ingrediënten in de juiste concentraties. Inderdaad, als geen groei waargenomen op het MTX medium, kan het zijn omdat er geen interactie is detecteerbaar door PCA voor de eiwitten van belang of het MTX medium was niet goed voorbereid. Om het medium mogelijk maakt groei van stammen tonen DHFR fragmenten complementatie kan een constitutieve interactie toegevoegd lege posities van het verzamelen en gebruikt als een positieve controle zoals DHFR fragmenten gefuseerd aan leucine zipper eenheden 33 (figuur 1C). Parallel testen met behulp van de linker-DHFR fragmenten of de rits-linker-DHFR fragmenten zal toestaan om onderscheid te maken tussen de voorwaarden die het mogelijk maken alle cellen om te groeien (lage MTX concentratie of aas eiwit die de neiging hebben om vals positieve interacties te maken, als descrhieronder IBED) en omstandigheden die de groei van alle stammen (MTX concentratie te hoog of essentieel ingrediënt ontbreekt in het medium) te voorkomen; 7) Gezien het feit dat PCA wordt uitgevoerd door middel van opeenvolgende rondes van herhalingen van het ene medium naar het andere, kan kruisbesmetting tussen stammen tussen verschillende platen optreden als, bijvoorbeeld, de pin-tool is niet goed gesteriliseerd tussen replicatie rondes en / of de laatste water bad (dwz natte station) in het sterilisatieproces wordt verontreinigd door kolonies van replicatie eerdere rondes. Verschillende posities op de arrays zijn leeg en kan dus gebruikt worden als controle posities waar geen groei worden geobserveerd om cross-verontreinigingen te detecteren.
Beeldanalyse kan worden uitgevoerd met behulp van een aantal gepubliceerde software (zie hoofdstuk 5 van het protocol) of een aangepaste script. 1) Het script trekt pixelwaarden van een leeg bord om de waarden van elke plaat pixel om samen: in deze studie, de aangepaste script de volgende stappen uitvoertrrect voor verlichting vooroordelen. 2) Het script converteert elk-achtergrond gecorrigeerde foto naar binair behulp van een pixel waarde drempel van 10. 3) Voor elke 1.536 posities van elke plaat, bepaald door overlappen een rechthoek op de rand kolonies, het script loopt ImageJ "Analyseren deeltjes … "functie in een cirkelvormige selectie. De cirkelselectie wordt ingesteld met een straal gelijk aan het interval tussen twee posities minus 10 pixels. 4) Het script selecteert het dichtst deeltje van het centrum van de selectie en bevestigt als kolonie of de locatie is niet meer dan de helft tussen twee kolonies van het centrum van de selectie. 5) Het script meet pixelwaarden van de geselecteerde deeltjes op de achtergrond gecorrigeerde beeld. 6) Om eventuele resterende achtergrond verlichting vooroordelen verder te corrigeren, het script trekt de gemiddelde waarde van alle pixels uit de circulaire selectie die geen deel uitmaken van een deeltje te pixelwaarden van de kolonie waren. De som van deze gecorrigeerde pixelwaardes, opgeslagen in de kolom "IntDenBackSub" de aanvullende tabel 1 worden gebruikt als een maat voor koloniegrootte.
Een kritische stap in de analyse deel is de keuze van de significantiedrempel. Hier, kozen we een drempel op basis van de verdeling van de negatieve L-DHFR F [3] controles, maar afhankelijk van het doel van het scherm, kunnen dergelijke drempel te streng zijn. Inderdaad, L-DHFR F [3] controles overexpressie (sterke TEF promoter) dat de complementaire fragmenten spontaan vullen elkaar en deze zijn dus niet representatief voor de expressie van de meeste eiwitten. Dit wordt benadrukt door het feit dat de verdeling van de L-DHFR F [3] controles is hoger dan het gemiddelde van de achtergrond groei (figuur 3D). Dus sommige interacties met scores onder deze strenge drempel maar die duidelijk buiten de achtergrond groei verdeling kan worden beschouwd als mogelijke hits die kunnen voorstellen, bijvoorbeeld tijdelijke of zwakke interacties. Deze kunnen verder worden onderzocht en cross-gevalideerd als, bijvoorbeeld, worden de twee eiwitten niet tot expressie op niveaus die de spontane complementatie van de DHFR fragmenten zoals de L-DHFR controles kunnen toestaan. Als alternatief kan men een significantiedrempel gebaseerd op de verhouding van overlap met gerapporteerde fysieke interactors in databases zoals Biogrid 35 vastgesteld om het percentage ware positieven dan valse positieven te maximaliseren. Anders dan het gebruik van de L-DHFR distributie dit alternatief niet altijd haalbaar indien bijvoorbeeld het aantal bekende fysieke interactors niet voldoende hoog. Bovendien is de keuze van de significantiedrempel heeft een impact op het aandeel van valse positieven en valse negatieven in de uiteindelijke dataset. Inderdaad, als andere PPI detectietest, vals positieven resulteren uit aspecifieke interactie van een eiwit met het DHFR-fusie-eiwit als bijvoorbeeld het eiwit veel voorkomt als eerder vermeld. Ditwordt geïllustreerd door het feit dat sommige prooien systematisch interactie met lokaas eiwitten in PCA schermen en dus moet de analyse 11 (bijv Tef2 en Ade17 en aanvullende tabel 2) worden verwijderd. Om dit probleem, een controle PCA scherm van de twee collecties tegen de juiste L-DHFR- controle te omzeilen (F [1,2] of F [3]) om aas en prooien tentoonstellen spontane DHFR- fragmenteert complementatie kan in de bijzondere voorwaarden worden uitgevoerd identificeren van elk scherm. Bovendien uitvoeren van een Gene Ontology verrijking analyse kan het vertrouwen in de gegevens beter als de functie van een bepaalde aas bekend. Anderzijds kan DHFR-PCA tot valse negatieven geven om verschillende redenen: 1) niet alle eiwitten worden gefuseerd aan het DHFR fragmenten aangezien deze de proteïnen destabiliseren of indien de lokalisatie wijzigen, bijvoorbeeld het DHFR fusie met het C-terminus interfereert met lokalisatiesignaal; 2) DHFR- reconstitutie in een aantal cellulaire compartimenten benay produceert folaat, bijvoorbeeld als een essentiële precursor voor de synthese van foliumzuur niet beschikbaar is; 3) C-uiteinden moeten binnen een afstand van 8 nm voor DHFR complementatie optreden 11. Zo kan een bekende interactie niet gedetecteerd als hun C-termini niet dicht genoeg in de ruimte. Dit wordt hier geïllustreerd door het feit dat een groot deel van Nup82 fysieke interactie gerapporteerd in databases, waarvan de meeste zijn indirect, werden niet in onze assay gedetecteerd. Evenzo zullen de interacties tussen membraaneiwitten waarvan de C-uiteinden zijn trans ten opzichte van het membraan niet leidt tot DHFR fragmenten complementatie en niet wordt gedetecteerd 11. Beperkingen 1) en 3) kan relatief eenvoudig worden omzeild door het fuseren van het DHFR fragment met de N-termini van het eiwit. Hierdoor kan voorkomen dat te bemoeien met een lokalisatie signaal in de buurt van de C-uiteinden en kan toestaan om een interactie tussen membraaneiwitten wiens N- en C-terminus te detecteren zijn in cis relatievehet membraan.
Verschillende problemen blijven in de studie van PIN (besproken in 2,3). De kaarten van pincodes dusver geproduceerd zijn grotendeels beschreven in een enkele experimentele conditie voor elke soort en bieden daarmee een enkele momentopname van hoe eiwitten netwerken zouden kunnen worden georganiseerd. Er is daarom behoefte aan de verkenning van andere experimentele condities om te zien hoe pincodes kunnen worden gereorganiseerd in reactie op veranderingen in het milieu, specifieke stimuli, over ontwikkeling of volgende mutaties. Deze problemen worden overwonnen door de ontwikkeling van nieuwe technologieën voor het ondervragen PPI in real-time, in levende cellen en door aanpassing gangbare technieken zodat ze kunnen worden gebruikt door een grotere gemeenschap laboratoria. Als kwantitatieve techniek die veranderingen detecteren in de hoeveelheid DHFR complementatie complexen 27 kunnen DHFR PCA worden aangepast aan deze uitdagingen te overwinnen en is gebruikt om te bestuderen hoe PPI worden beïnvloed door een DNA beschadigend agens 22 </sup>, Chemische stoffen 25, gendeleties 23,26 of in andere gist soorten en hun hybriden 33. Het verkennen van deze nieuwe dimensies zullen steeds belangrijker geworden om de dynamiek van de PIN te onthullen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institute of Health Research (CIHR) Grants 191.597, 299.432 en 324.265, een Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery subsidie en een Human Frontier Science Program subsidie aan CRL. CRL is een CIHR New Investigator. Guillaume Diss wordt ondersteund door een PROTEO fellowship. Samuel Rochette wordt ondersteund door NSERC en FRQNT beurzen.
Name of Material/Equipement | Company | Catalog Number | Comments/Description |
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |