Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).
Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein’s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.
רשתות אינטראקציה חלבון (PIN) מציעות מפה ברזולוציה נמוכה של כמה חלבונים מאורגנים מבחינה תפקודית בתא 1. כל חיבור פיזי בין שני חלבונים, או אינטראקציה בין חלבונים (PPI), עשוי לייצג עמותה כי הוא יציב בזמן, כמו אלה שנמצאו בתוך קומפלקסי חלבונים ושתורם לארגון המבני של התא. קשרים אלה עשויים גם לייצג עמותות חולפות המסדירות את הפעילות, יציבות, הלוקליזציה ואינטראקציות של שני השותפים. זיהוי שותפי אינטראקציה הפיזי של חלבון נתון לכן מספק מידע עשיר על התפקוד והרגולציה של החלבון ש2,3. מסיבות אלה, כבר לשים מאמצים גדולים למיפוי של סיכות באורגניזמים מודל, כולל Escherichia coli 4-6, thaliana ארבידופסיס 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, דרוזופילה melanogaster </ Em> 13, Caenorhabditis elegans 14 וההומו ספיינס 15. מחקרים אלה סיפקו תובנות חשובות כיצד חלבונים מאורגנים בתא ומידע ובכך מפתח בחלבונים עם פונקציות ידועות קודם לכן.
כמה אסטרטגיות שפותחו במשך השנים ללמוד מספרי זיהוי אישיים. טכנולוגיות אלה יכולות להיות מקובצים באופן כללי בשלוש קטגוריות המבוססות על הסוג של מידע שהם מספקים ב- PPI (שנסקר ב16-18). הראשון מבוסס על שמרי שתי-היברידי ונגזרותיו 19. טכנולוגיות אלו מספקות מידע על העמותה הישירה בין הזוגות של חלבונים, המאפשר בניית רשתות בינארי. המשפחה השנייה מבוססת על טיהור הזיקה של חלבוני פיתיון וזיהוי של השותפים הקשורים בם, כגון טיהור זיקה ואחריו ספקטרומטריית מסת 20. גישות אלה לזהות קבוצות של חלבונים אשר מתייחסות ישירותאו קשור באופן עקיף, בדרך כלל באופן יציב, והם חזקים מאוד לזהות קומפלקסי חלבונים. הגישה השלישית מתבססת על מבחני חלבון-בר שלמה (PCAs) 11,21. גישה זו מספקת רמה בינונית של החלטה בין שתי הגישות הקודמות, שכן היא מאפשרת איתור עמותות ישירות והפרוקסימלי בין חלבונים. לכל אחד יש טכניקה עוצמות משלה וחולשות, כפי שנסקר 18 לאחרונה.
PIN אוקריוטים ביותר שתואר הוא ללא ספק אחד משמרי ניצני Saccharomyces cerevisiae, בין שאר משום שproteome היא יחסית פחות מורכבת מאלה של אאוקריוטים מודל אחרים וכי מבחני תפוקה גבוהה כדי לזהות PPIs ראשון כבר assayed ויעילות רב יותר מיושם באורגניזם מודל זה 9-12. שיטה חזקה במיוחד למערכת השמרים היא assay דיהידרופולאט רדוקטאז שלמת חלבון-בר (DHFR-PCA), assay כי כברמשמש בהקשרים שונים כדי ללמוד את PIN השמרים בתנאים סטנדרטיים ומוטרדים 11,22-26. שיטה זו מסתמכת על assay הישרדות המאפשר זיהוי של PPI ישיר וכמעט ישיר לחלבון פיתיון ניתנו בשתי רמות ביטוי אנדוגני והמגוירים subcellular יליד שותפי האינטראקציה 11,21 באופן כמותי 27. האות שהושגה באמצעות assay זה (גודל מושבה כלומר על מערכי מושבה בצפיפות גבוהה) ובכך משקפת את הסכום של קומפלקסי חלבונים שנוצרו בין הפיתיון והטרף בסביבה סלולרית כמעט שווה ערך לאחד מתאי wild-type. Assay מבוסס על הכינון מחדש של אנזים כתב המעורב במטבוליזם של חומצה פולית, דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR), לפיה שני שברים משלימים של DHFR שהתמזגו שני חלבונים של עניין הם הביאו לקרבה כאשר שני חלבוני האינטראקציה, ש בתורו מוביל לכינון מחדש הפיך של פעילות אנזים 1גידול של 1 ושל העומס על methotrexate בינוני מכיל (MTX; איור 1). מתחם זה מעכב את אנזים אנדוגני DHFR, אבל לא אחד שעבר מוטציה בשימוש assay 28. שני אוספים של זני PCA, אחד המכיל ~ 4,300 מאטה זנים עם ORF התמזג DHFR F [1,2] ובר אחד המכיל ~ 4,800 MAT α זנים עם ORF התמזג DHFR [3] שבר, ניתן לרכוש ל ליישם DHFR-PCA בקנה מידה קטנה או גדול בכל מעבדה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כללי אבל מפורט למסך ל- PPI בין חלבון פיתיון אחד ו~ 4,800 חלבוני טרף באמצעות assay זה.
אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על assay DHFR-PCA מאפשר זיהוי השיטתי של interactors הפיזי לכל חלבון פיתיון ניתנו בתפוקה גבוהה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם על ידי בדיקות סקר ליותר פיתיונות, וזה בכל רמה רצויה של שכפול. אנחנו מדגימים את האמינות של פרוטוקול זה על ידי זיהוי של שותפי אינטראקציה פיזיים לחלבון פיתיון המעורב במתחם הגרעיני נקבובי: Nup82. הניתוח שלנו אפשר למצוא חמישה interactors שדווח בעבר ואחד interactor (איורים 3F & 3G) לא פורסם בעבר, המדגיש את היכולת של השיטה ללמוד interactome שמרי החלבון.
הפרוטוקול המתואר כאן כולל מספר שלבים קריטיים שהנסיין צריך לשים לב. אנו ממליצים ל1) ודאו שDHFR הפיתיון F [1,2] היתוך נכון (איור 1); זו יכולה להיות מושגת על ידי רצף הבנייה וmeasuring ביטוי חלבון נכון באמצעות אנטי-DHFR F [1,2] או אנטי DHFR-F [3] נוגדן; 2) לפני תחילת המסך, מומלץ לבדוק אם כל פיתיון של עניין מציג אינטראקציות מופקרות במסכי PCA. ניתן לעשות זאת על ידי ביצוע מסכי שליטה עם פיתיונות חצו עם הבקרה הנאותה L-DHFR או על ידי הזדווגות ידנית את הפיתיון עם הבקרה הנאותה L-DHFR וביצוע assay צמיחה במדיום MTX. 3) צלחות צריכה להיות שפכו היום לפני שהם נמצאים בשימוש, כך שהלחות היא אופטימלית לדבקות תא על פני השטח אגר במהלך תהליך ההדפסה; 4) אין להשתמש בצלחות מקור יותר מארבע פעמים להעביר מספיק תאים בצלחת היעד. הגדלת מספר העותקים של צלחת היעד יכול להיעשות על ידי צעדים רצופים של התרחבות (למשל 4 עותקים -> 16 עותקים -> 64 עותקים). לחלופין, ניתן לאסוף תאים בעמדות שונות על המדשאות או במושבה בין סבבים השונים של שכפול; 5) אם מספר positions חסרים לאחר בחירת דיפלואידי (s), לוודא כי צלחות המקור לא היו בשימוש פעמים רבות מדי בשלב החיזור (שלבים 4.5-4.7); 6) ודא שמדיום MTX מכיל את כל המרכיבים החיוניים בריכוזים הנכונים. ואכן, אם אין צמיחה בכלל הוא ציין על מדיום MTX, זה יכול להיות גם משום שאין אינטראקציה ניתן לזהות על ידי PCA לחלבונים של עניין, או משום בינוני MTX לא היה מוכן כראוי. כדי להבטיח שהמדיום מאפשר צמיחה של זנים מראים DHFR ברי שלמה, ניתן להוסיף אינטראקציה מכוננת בעמדות ריקות של האיסוף ושימשה כביקורת חיובית כגון DHFR-ברים התמזגו moieties הרוכסן לאוצין 33 (איור 1 ג). בדיקות מקבילות באמצעות שברי המקשר DHFR או שברי הרוכסן-מקשר DHFR יאפשרו להבחין בין תנאים שיאפשר לכל התאים לגדול (ריכוז MTX נמוך או חלבון פיתיון שנוטים לעשות אינטראקציות חיוביות כוזבות, כdescribed להלן) ותנאים המונעים צמיחה של כל הזנים (מרכיב ריכוז MTX גבוה או חיוני מדי חסר במדיום); 7) בהתחשב בכך שPCA מתבצעת באמצעות סיבובים רצופים של משוכפלים ממדיום אחד למשנהו, זיהום צולב בין זנים בין לוחות שונים עלול להתרחש אם, למשל, פיני הכלי אינו מעוקר כראוי בין סיבובי שכפול ו / או המים שעבר אמבטיה (תחנה כלומר רטובה) בהליך העיקור מזוהם על ידי מושבות של סיבובי שכפול קודמים. מספר התפקידים במערכים ריקים ולכן יכולים לשמש כעמדות שליטה שבו אין צמיחה, יש לשים לב לגילוי זיהומים צולבים.
ניתוח תמונה יכול להתבצע באמצעות כמה תוכנות שפורסמו (ראה סעיף 5 לפרוטוקול) או כל תסריט מותאם אישית. במחקר זה, את התסריט המותאם אישית מבצע את השלבים הבאים: 1) התסריט גורע ערכי פיקסל של צלחת ריקה לפיקסל ערכים של כל צלחת כדי לשתףrrect להטיות תאורה. 2) התסריט ממיר כל תמונה מתוקנת רקע בינארית באמצעות סף ערך פיקסל של 10. 3) לכל 1,536 עמדות של כל צלחת, שנקבעו על ידי שכיסה מלבן במושבות הקצה, התסריט פועל ImageJ "לנתח חלקיקים … "פונקציה בבחירה חוזר. הבחירה החוזר מוגדרת ברדיוס שווה לרווח בין שתי עמדות מינוס 10 פיקסלים. 4) התסריט בוחר את החלקיקים הקרובים ביותר ממרכז הבחירה ומאשר את זה כמושבה אם המיקום שלה הוא לא יותר ממחצית המרווח בין שתי מושבות מהמרכז של הבחירה. 5) התסריט מודד ערכי פיקסל של החלקיקים שנבחרו על התמונה מתוקנת רקע. 6) כדי לתקן עוד כל הטיות תאורת רקע שנותרו, את התסריט מחסיר את הערך הממוצע של כל הפיקסלים מהבחירה בחוזר, כי לא היו חלק מחלקיקים לערכי פיקסל של המושבה. הסכום של ערך פיקסל תיקן אלהים, מאוחסן בטור "IntDenBackSub" לוח משלים 1, משמש כמדד לגודל מושבה.
שלב קריטי בחלק הניתוח הוא הבחירה של סף המשמעות. כאן, בחרנו סף המבוסס על חלוקת L-DHFR F השלילי [3] הבקרה, אך בהתאם למטרה של המסך, סף כזה עשוי להיות מחמיר מדי. ואכן, L-DHFR F [3] פקדי ביטוי יתר (אמרגן TEF חזק) באופן שהברים המשלימים עשויים באופן ספונטני משלימים אחד את השני ואלה ובכך אינם מייצגים את הביטוי של רוב החלבונים. זה מודגש על ידי העובדה שההפצה של L-DHFR F [3] הבקרות היא גבוהה מהממוצע של צמיחת הרקע (איור 3D). לכן, כמה אינטראקציות שיש ציונים מתחת לסף מחמיר זה אבל זה בבירור מחוץ להפצת צמיחת רקע יכול להיחשב כלהיטים משוערים שעשויות לייצג, למשל היתר, חולף או חלשפעולות. ניתן ללמוד אלה נוספים ומאומתים צולבים אם, למשל, שני החלבונים אינם באים לידי ביטוי ברמות שיכולות להרשות לשלמה הספונטנית של שברי DHFR כמו פקדי L-DHFR. כחלופה, אפשר להגדיר סף משמעות בהתאם לחלק היחסי של חפיפה עם interactors הפיזי דווח במסדי נתונים כמו 35 BioGRID על מנת למקסם את חלקם של תוצאות חיוביות האמיתיות על תוצאות חיוביות שגויות. עם זאת, בניגוד לשימוש בהפצת L-DHFR, חלופה זו עשויה שלא להיות תמיד אפשרית אם, למשל, מספר interactors הפיזי הידוע הוא לא גבוה מספיק. יתר על כן, הבחירה של סף המשמעות יש השפעה על השיעור של תוצאות חיוביות שגויות וגם שליליים שווא בערכת הנתונים הסופי. ואכן, כמו כל assay זיהוי PPI אחר, חיוביים שגוי יכול להיגרם כתוצאה מאינטראקציה נוקבת של חלבון עם חלבון DHFR-ההיתוך אם, למשל, החלבון הוא נרחב ביותר כאמור. זהמודגם על ידי העובדה שחלק פושט שיטתי אינטראקציה עם כל חלבוני הפיתיון במסכי PCA, ולכן, יש צורך להסיר מהניתוח 11 (לדוגמא Tef2 וAde17 ולוח משלים 2). כדי לעקוף בעיה זו, מסך PCA שליטה של שני אוספים נגד הבקרה הנאותה L-DHFR (F [1,2] או F [3]) כדי לזהות פיתיונות ופושט מציגים ספונטני DHFR ברי שלמה יכולה להתבצע בתנאים מסוימים של כל מסך. יתר על כן, ביצוע ניתוח העשרת Gene אונטולוגיה יכול להגדיל את האמון בנתונים אם הפונקציה של פיתיון נתון ידועה. מצד השני, DHFR-PCA יכולה להצמיח שליליים שגוי מכמה סיבות: 1) לא ניתן התמזגו כל החלבונים לברי DHFR כמו אלה עלולים לערער את היציבות בחלבונים או לשנות את הלוקליזציה שלהם, אם, למשל, היתוך DHFR ל C-הסופי מפריע לאות לוקליזציה; 2) הכינון מחדש DHFR בכמה תאים סלולריים מ 'איי לא לייצר חומצה פולית אם, למשל, מבשר חיוני לסינתזה של חומצה פולית אינו זמין; 3) C-Termini צורך להיות במרחק של 8 ננומטר לשלמת DHFR להתרחש 11. לפיכך, אינטראקציה ידועה לא תזוהה אם C-Termini שלהם לא קרוב מספיק בחלל. זה בא לידי ביטוי כאן בעובדה שחלק גדול מאינטראקציות פיזיות Nup82 דווחו במאגרי מידע, אשר רובם עקיפים, לא התגלה assay שלנו. בדומה לכך, אינטראקציות בין חלבוני קרום שC-טרמיני נמצאים בטרנס ביחס לקרום לא יובילו לDHFR ברי שלמה ולא יזוהה 11. מגבלות 1) ו -3) ניתן לעקוף יחסית פשוט על ידי איחוי שבר DHFR לN-Termini של החלבון. פעולה זו עלולה למנוע להפריע לאות לוקליזציה ליד C-Termini ועשוי לאפשר לגילוי אינטראקציה בין החלבונים בממברנה שN ו- C-הסופי נמצא ביחסי cisהקרום.
כמה אתגרים להישאר במחקר של מספרי זיהוי אישיים (שנסקר ב2,3). המפות של סיכות הופקו עד כה במידה רבה תוארו בתנאי ניסוי יחידים עבור כל מין ובכך להציע תמונת מצב אחת לאופן שעשויות להיות מאורגנים רשתות חלבון. אין אפוא צורך בבדיקה של תנאי ניסוי אחרים כדי לראות איך מספרי זיהוי אישיים עשויים להיות מחדש בתגובה לשינויים סביבתיים, גירויים מסוימים, על פני פיתוח או המוטציות הבאות. אתגרים אלה יהיו להתגבר על ידי פיתוח הטכנולוגיות חדשות לחקירת PPIs בזמן אמת, בתאים חיים ועל ידי התאמת טכניקות הנוכחיות, כך שהם יכולים להיות בשימוש על ידי קהילה גדולה יותר של מעבדות. כטכניקה כמותית שיכול לזהות שינויים בכמות של שלמת DHFR קומפלקסי 27, ניתן להתאים DHFR-PCA להתגבר על אתגרים אלה ונעשה שימוש כדי ללמוד איך PPIs מושפע DNA נזק סוכן 22 </sup>, חומרים כימיים 25, מחיקות גן 23,26 או במינים שמרים אחרים והכלאיים שלהם 33. היכרות עם הממדים החדשים אלה תהפוך ליותר ויותר חשובים לחשוף את הדינמיקה של PIN.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מכון הקנדי לחקר בריאות (CIHR) מעניק 191,597, 299,432 324,265 ו, מדעי טבע והנדסת מועצת מחקר של מענק Discovery קנדה ומענק Frontier אדם תכנית המדע לCRL. CRL הוא חוקר CIHR חדש. גיום Diss נתמך על ידי מענק PROTEO. סמואל Rochette נתמך על ידי מלגות NSERC וFRQNT.
Name of Material/Equipement | Company | Catalog Number | Comments/Description |
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |