Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.
High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spektroskopisk imaging er en spirende tilgang for at opnå detaljerede billeder, der er forbundet biokemisk information. FT-IR billeddannelse af væv er baseret på princippet om, at forskellige regioner i midten af infrarøde absorberes af forskellige kemiske bindinger (fx C = O, CH, NH) inden celler eller væv, kan derefter blive relateret til tilstedeværelsen og sammensætning af biomolekyler (fx lipider, DNA, glycogen, protein, collagen). I et FT-IR billede, hver pixel i billedet omfatter en hel Infrarød (IR) spektrum, der kan give oplysninger om den biokemiske status for de celler, der kan udnyttes til celletype eller sygdom type klassificering. I dette papir viser vi: hvordan du kan få IR-billeder fra humane væv ved hjælp af en FT-IR-systemet, hvordan du ændrer eksisterende instrumenter for at muliggøre high-definition billeddannelse kapaciteter, og hvordan man kan visualisere FT-IR-billeder. Vi derefter præsentere nogle anvendelser af FT-IRfor patologi ved hjælp af lever og nyre som eksempler. FT-IR imaging holder spændende applikationer i at tilvejebringe en ny rute for at få biokemisk information fra celler og væv i en helt label-fri som ikke medfører forstyrrelser vej mod at give ny indsigt i biomolekylære ændringer som en del af sygdomsprocesser. Derudover kan denne biokemiske information potentielt give mulighed for objektiv og automatiseret analyse af visse aspekter af sygdomsdiagnose.
IR-spektroskopi har været et analytisk værktøj til rådighed i en eller anden form siden 1930'erne; er det imidlertid kun været inden for det sidste årti, at området af væv billeddannelse med FT-IR er eksploderet. De fremskridt i FT-IR for væv billeddannelse er blevet drevet i en stor del af tre vigtigste udvikling: 1) øget hastighed dataopsamling på grund af tilgængeligheden af store Focal Plane Array (FPA) detektorer, der typisk har tusindvis af IR følsomme detektorer 1 , 2, 2) udvikling af avancerede algoritmer og datakraft til at håndtere store hyperspektrale datasæt 3, og 3) modellering af FT-IR billeddannende systemer til at maksimere rumlig opløsning 4,5. Der har været talrige høj kvalitet og meget omfattende artikler gennemgå området for FT-IR-spektroskopi nylig 6-16, i tillæg til en Nature Protocols papir, der beskriver de skridt til at opnå point spektre eller kort fra væv 17. I dette papir vil vi fokusere på protocol at opnå billeder af væv ved hjælp af en 128 x 128 FPA detektor i en modificeret FT-IR system med høj definition kapaciteter.
FT-IR imaging har længe været foreslået at være et potentielt ønskeligt værktøj til celler og væv billeddannelse på grund af evnen til at opnå billeder, hvor hver pixel har et væld af biokemisk information. FT-IR imaging er baseret på princippet om, at forskellige biomolekyler i en prøve kvantitativt vil absorbere forskellige regioner i mid-infrarød; dette giver mulighed for at udlede en "biokemisk fingeraftryk '. Denne fingeraftryk var blevet vist i mange undersøgelser for at ændre mellem forskellige celletyper og sygdomstilstande. I modsætning til konventionel patologi praksis, hvor pletter og immunhistokemiske markører skal anvendes til at visualisere og identificere celletyper og vævsstrukturer, der anvendes til at lede diagnose og behandlingsmuligheder er billederne fra FT-IR dannet baseret på iboende biokemi af vævet. Den nuværende Technique af farvning væv til diagnose er tidskrævende, destruktiv, besværlig og kræver subjektive ekspertise patolog, mens FT-IR giver mulighed for at gøre denne proces hurtig, ikke-destruktiv, højt automatiseret, og mere objektiv. Desuden FT-IR tilvejebringer en hidtil ukendt vej til at opnå yderligere biokemiske information, som måske ikke være let tilgængelig ved anvendelse af traditionelle farvningsteknikker.
En af de mest spændende fremskridt i de senere år har været tilgængeligheden af høj opløsning billeddannelse tilgange, der kan nu giver mulighed for visualisering og karakterisering af celletyper og vævsstrukturer, som er kritiske for omfattende sygdomsdiagnose. En af disse teknikker er svækket Total Reflectance (ATR) FT-IR, som inkorporerer en fast nedsænkning linse (SIL) af et højt brydningsindeks, som giver mulighed for høj opløsning billeddannelse 18 med mange meget spændende undersøgelser, der viser dens anvendelsesmuligheder 19-25. Desuden wsom for nylig viste, at den øgede rumlige opløsning er forbundet med ATR imaging kan give mulighed for visualisering og klassifikation af endotel og myoepitelcellerne i brystvæv, som udgør en vigtig del af brystkræft diagnose 26. Mens ATR billeddannelse er meget nyttig, kræver denne teknik SIL at komme i kontakt med vævet til dannelse af FT-IR-billeder; Derfor er dens anvendelse noget begrænset for væv patologi, hvor store områder af væv skal hurtigt afbildes.
En anden fremgangsmåde blev demonstreret ved kobling af en høj objektivforstørrelse til en eksisterende FT-IR system, der bruger en synkrotron som en lys kilde til IR, er det muligt fuldt ud at belyse et FPA billede og med en effektiv pixelstørrelse på 0,54 x 0,54 um. Dette gav mulighed for os at visualisere vigtige strukturer i bryst og prostata væv, der ikke var løses ved anvendelse af traditionelle FT-IR-systemer 4. Mens disse dramatiske stigninger i IR billede rumlig resolution var spændende, dets anvendelse fortsat begrænset på grund af at kræve en synkrotron. Efterfølgende blev et optimalt system, der, som også giver mulighed for HD-billeddannelse kapaciteter med en 1,1 x 1,1 um pixelstørrelse uden krav om en synkrotron kilde, men snarere ved hjælp af en traditionel globar IR kilde 5. I denne artikel viser vi, hvordan du ændrer en eksisterende kommerciel FT-IR imaging system til at give mulighed for diffraktion begrænset IR billeddannelse af væv med et acceptabelt signal støjforhold at bruge flere IR mål (15X, 36x, og 74X). Den effektive pixel størrelse med de tre mål er 5,5 x 5,5 um (15X), 2,2 x 2,2 um (36X) og 1,1 x 1,1 um (74X). Så giver vi nogle eksempler på betydningen af de gevinster i rumlig opløsning til påvisning sygdom i lever og nyre biopsier 27.
FT-IR er en ny modalitet til label-fri biokemisk billeddannelse af vævssnit, med potentiale til at spille en vigtig rolle i at forbedre den nuværende standard for diagnosen i patologi. Den nuværende gold standard for patologi kræver væv, der skal biopsi, fikseret i formalin, indlejret i paraffin, snittet flere gange og farvet med flere pletter. En højt uddannet patolog skal subjektivt visuelt vurdere vævsstruktur og cellemorfologi for at bestemme en diagnose. Her viser vi, hvordan at indsamle højopløselige IR-billeder fra den samme type af sektioner og diskutere nogle af de beregningsmæssige metoder til at undersøge kemiske forskelle mellem celletyper og sygdomstilstande.
De kritiske trin i denne protokol er at sikre, at vævet er meget omhyggeligt fokuseret og at systemet er kalibreret til at sikre høj kvalitet spektroskopiske data. Den når indførelsen af systemet pleje er særlig criti cal når der arbejdes med høj forstørrelse mål. For at hjælpe i fejlfinding, følgende liste omfatter nogle af de potentielle vanskeligheder;
Problem: Lav IR intensitet, når billeddannelse i refleksion. Løsning: Kontroller IR slide retning som reflekterende belægning kan være på den forkerte side af slæden.
Problem: Lav signal / Rød advarselsskilt i Lancer Control. Løsning: Cool detektorer med LN2. Flydende nitrogen er påkrævet for FPA detektorer til at fungere og kræver periodisk blive toppede.
Problem: Velocity fejl / bevægelse fejl. Løsning: Reset spektrometer og reducere vibrationer. Vibrationer vil få bevægelige spejl i interferometeret at blive forstyrret.
Problem: Vanddamp spidser i data. Løsning: Forøg udrensning på systemet og beskytte prøve fra luften.
Problem: Ugyldig centerburst. Løsning: Find centerburst igen.
e_content "> Problem:. lav flux forskel i transmission, selv om fokus. Løsning: Juster bund kondensator Dette vil ske som IR lys ikke bliver fokuseret på et punkt på prøven.I dette papir, har vi fokuseret på, hvordan man kan erhverve høj opløsning IR-billeder af væv ved enten transmission eller transflectance mode. Arten af FT-IR-billeddannelse, er, at der er flere modifikationer, der kan gøres til datafangst, såsom typen af substrat, fiksering teknik, prøvetykkelse, spektral opløsning, interferometer spejl hastighed etc. Virkningen af disse parametre har blevet drøftet i omfattende detaljer nylig 4,5,17,51.
Der er en række ændringer, der kan gøres til billeddannende system herunder billeddannelse i ATR-modus 10,24,26 og bruge nanoskala termiske metoder 52,53 for at tillade høj opløsning IR billeddannelse. Den største begrænsning med høj opløsning IR billeddannelse er at TIssues skal omhyggeligt forberedt og tynd nok til IR til at passere gennem (typisk 4 um tykkelse). Desuden transmission og reflektans FT-IR-billeddannelse kræver prøverne at være tør på grund af absorbansen af IR ved vand. Men FT-IR imaging har betydelige fordele i forhold til andre teknikker, da det kan meget hurtigt billede store områder af væv, mens stammer rig og detaljeret biokemisk information. Andre lignende teknikker, der stammer biokemisk information på en etiket-fri mode omfatter Raman spektroskopi dog overtagelsestidspunktet data er meget langsommere til at erhverve billeder. Ny Raman billedteknik dukker herunder stimuleret Raman spredning (SRS) og sammenhængende Antistokes Raman spredning (CARS); Men de har adgang begrænset spektralområde eller enkelt frekvens billeddannelse.
De fremskridt i hastighed dataopsamling, rumlig opløsning, og tilgængeligheden af beregningsmæssige metoder har været af enorm værdi i at gøre FT-IR imaging en mere realistisk tilgang til oversættelse som ny imaging værktøj i patologi. De seneste fremskridt inden for rumlig opløsning har været særligt vigtigt for væv patologi grundet vigtige celletyper ikke er løses ved anvendelse af traditionelle FT-IR billeddannelse. Den nylige papir af Reddy et al. viste, hvordan at modellere et ideelt system til at opnå den optimale rumlige opløsning af et FT-IR imaging system 5. Nyrevævet eksempel i dette papir viser betydningen af højere rumlige opløsninger for at udtrække biokemisk information fra glomerulære strukturer (figur 3 og figur 5). I fremtiden nye fremskridt inden Quantum Cascade Lasers som meget lyse IR lyskilder 54-57, 3D spektral billeddannelse 58 og gennembrud inden for nanoskala IR teknologier 52,53,59,60 holde spændende nye muligheder for forskning, der kan have enorme konsekvenser i fremtiden af væv billeddannelse.
<p class = "jove_content"> Vi har præsenteret eksempler på anvendelser i lever og nyre sygdom, hvor der er behov for yderligere biokemiske information, som kan være af diagnostisk værdi. Spectral Patologi Lab i Patologisk Institut på University of Illinois i Chicago er fokuseret på oversættelsen af IR imaging teknologier til at forbedre sygdomsdiagnose og forbedret forudsigelse af patientens udfald. FT-IR-billeddannelse kan overvinde nogle af de nuværende begrænsninger i patologi praksis, hvor der kræves kvantitativ og objektiv information. Især er det fremtidige arbejde fokuseret på at identificere områder i nuværende patologi praksis, hvor de nuværende teknikker ikke giver tilstrækkelig diagnostisk sensitivitet eller give begrænsede oplysninger. En klart behov eksisterer i at forbedre den nuværende praksis med patologi og til at give mere information til patologen om en patients sygdom status, hvilket kan være opnåelige ved anvendelse af high-definition FT-IR-billeddannelse.The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.
Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |