Abstract
De alta definición Transformada de Fourier de infrarrojos (FT-IR) imágenes espectroscópicas es un enfoque emergente para obtener imágenes detalladas que se han asociado información bioquímica. Imágenes FT-IR de tejido se basa en el principio de que las diferentes regiones de las infrarrojo medio son absorbidos por diferentes enlaces químicos (por ejemplo, C = O, CH, NH) dentro de las células o tejidos que luego pueden estar relacionados con la presencia y composición de biomoléculas (por ejemplo, lípidos, DNA, glucógeno, proteínas, colágeno). En una imagen FT-IR, cada píxel dentro de la imagen comprende un espectro de infrarrojos (IR) que puede dar información sobre el estado bioquímico de las células que a continuación pueden ser explotadas para el tipo celular o de tipo enfermedad de clasificación. En este artículo, nos muestran: cómo obtener imágenes infrarrojas de los tejidos humanos utilizando un sistema FT-IR, como modificar la instrumentación existente para permitir capacidades de imagen de alta definición, y cómo visualizar imágenes FT-IR. A continuación, presentamos algunas aplicaciones de FT-IRde la patología utilizando el hígado y el riñón como ejemplos. Imágenes FT-IR tiene aplicaciones interesantes en la prestación de una ruta nueva para obtener información bioquímica de las células y tejidos en una ruta que no cause interferencias enteramente etiqueta-libre hacia dar una nueva visión de los cambios biomoleculares como parte de los procesos de enfermedad. Además, esta información bioquímica potencialmente puede permitir un análisis objetivo y automatizado de ciertos aspectos de diagnóstico de la enfermedad.
Introduction
Espectroscopia IR ha sido una herramienta de análisis disponible en alguna forma desde la década de 1930; Sin embargo, sólo se ha sido en la última década que el área de formación de imágenes de tejido con FT-IR se ha disparado. Los avances de la FT-IR para obtener imágenes de tejidos se han impulsado en gran parte por tres acontecimientos fundamentales: 1) aumento de la velocidad de adquisición de datos debido a la disponibilidad de un gran conjunto de plano focal (FPA) detectores que típicamente tienen miles de infrarrojos detectores sensibles 1 , 2, 2) el desarrollo de algoritmos de procesamiento de avanzada y capacidad de cálculo para manejar grandes datos hiperespectrales establece 3, y 3) el modelado de sistemas de imágenes FT-IR para maximizar la resolución espacial de 4,5. Ha habido numerosos alta calidad y muy extensos artículos que analizan el campo de la espectroscopia FT-IR recientemente 6-16, además de un artículo de Nature Protocolos que detalla los pasos para obtener el punto espectros o mapas de los tejidos 17. En este artículo, nos centraremos en la protocol para obtener imágenes de los tejidos utilizando un detector de 128 x 128 FPA en un sistema de FT-IR modificado con capacidades de alta definición.
Imágenes FT-IR mucho tiempo se ha sugerido que es una herramienta potencialmente deseables para celular y imágenes de tejidos debido a la capacidad de obtener imágenes en las que cada píxel tiene una gran cantidad de información bioquímica. Formación de imágenes FT-IR se basa en el principio de que diferentes biomoléculas en una muestra absorberán cuantitativamente diferentes regiones del infrarrojo medio; esto permite la derivación de una "huella digital bioquímica '. Esta huella digital había sido demostrado en muchos estudios para alterar entre los diferentes tipos de células y estados de enfermedad. A diferencia de la patología en la práctica convencional, donde las manchas y marcadores inmunohistoquímicos necesitan ser utilizado para visualizar e identificar tipos de células y estructuras de tejido que se utilizan para guiar las opciones de diagnóstico y tratamiento, las imágenes de FT-IR se forman sobre la base de la bioquímica inherente del tejido. El techniq actualue tinción de tejido para el diagnóstico es que consume tiempo, destructivo, laborioso, y requiere experiencia subjetiva del patólogo, mientras que FT-IR ofrece el potencial para hacer de este proceso rápido, no destructivo, altamente automatizada, y más objetiva. Además, FT-IR proporciona una nueva ruta para la obtención de información bioquímica adicional que puede no ser fácilmente accesible a través de técnicas de tinción convencionales.
Uno de los avances más emocionantes en los últimos años ha sido la disponibilidad de métodos de formación de imágenes de alta resolución que ahora se puede permitir la visualización y caracterización de los tipos de células y estructuras de tejido que son críticos para el diagnóstico de enfermedades integral. Una de estas técnicas es de reflectancia total atenuada (ATR) FT-IR que incorpora una lente de inmersión sólido (SIL) de un alto índice de refracción que permite la formación de imágenes de alta resolución 18, con muchos estudios muy interesantes que muestra sus aplicaciones 19-25. Además, wcomo ha demostrado recientemente que el aumento de la resolución espacial asociada con las imágenes de ATR puede permitir la visualización y clasificación de células endoteliales y mioepiteliales en el tejido mamario que forman un componente clave de diagnóstico de cáncer de mama 26. Mientras que las imágenes ATR es muy útil, esta técnica requiere que el SIL para hacer contacto con el tejido para formar imágenes FT-IR; por lo tanto, su uso es algo limitada para patología del tejido donde grandes regiones de tejidos deben ser reflejados rápidamente.
Un segundo enfoque se demostró mediante el acoplamiento de un objetivo de gran aumento a un sistema de FT-IR existente que utiliza un sincrotrón como fuente luminosa de IR, es posible iluminar plenamente de FPA y la imagen con un tamaño efectivo de píxel de 0,54 x 0,54 m. Esto permitió a visualizar las estructuras clave en tejidos de mama y de próstata que no se puede resolver utilizando sistemas de FT-IR convencional 4. Si bien estos aumentos dramáticos en la imagen IR resolutio espacialn eran alucinantes, su uso sigue siendo limitado debido a que requiere un sincrotrón. Posteriormente, un sistema óptimo fue diseñado, que también podría permitir capacidades de imagen de alta definición con un tamaño de 1,1 x 1,1 m píxeles sin el requisito de una fuente de sincrotrón, sino más bien el uso de una fuente de IR GLOBAR tradicional 5. En este artículo, mostramos cómo modificar un sistema de imagen existente comercial FT-IR para permitir la difracción de imágenes IR limitado de tejidos con una señal aceptable a ruido utilizando múltiples objetivos IR (15X, 36X, 74X y). El tamaño efectivo de píxeles con los tres objetivos es de 5,5 x 5,5 m (15X), 2,2 x 2,2 m (36X) y 1,1 x 1,1 m (74X). A continuación damos algunos ejemplos de la importancia de los avances en la resolución espacial para la detección de la enfermedad en el hígado y el riñón biopsias 27.
Protocol
1. La creación de un FT-IR Microscopio y adquisición de tejidos Imágenes
- Sección de un bloque de tejido incluido en parafina fijado en formol al 4 micras de espesor a una diapositiva compatible IR utilizando un microtomo. Alternativamente, la sección un nitrógeno tejido congelado líquido a 4 micras de espesor sobre una diapositiva compatible IR utilizando un criostato.
NOTA: Por lo general, una sección de serie también será adquirida en un portaobjetos de vidrio y se tiñó con un especial (como hematoxilina y eosina (H & E)) o tinción inmunohistoquímica. Además, las líneas celulares cultivadas pueden ser cultivadas en portaobjetos compatibles IR. Diapositivas compatibles IR pueden ser diapositivas reflectantes IR para imágenes reflexión modo (por ejemplo, diapositivas mirrir, oro) o IR diapositivas transparentes para la imagen modo de transmisión (por ejemplo, BaF2, CaF2). - Purgar el microscopio FT-IR y el espectrómetro utilizando aire seco o gas nitrógeno seco para eliminar el agua atmosférica del sistema. Espere al menos 45 minutos antes de la proyección de imagen para asegurar una minuciosa Purge.
- Enfriar tanto el detector FPA (a 79 K) y el detector MCT interna en el microscopio FT-IR usando nitrógeno líquido. Enfriar los detectores aproximadamente cada 6 horas.
¡CUIDADO! El nitrógeno líquido es un fluido criogénico y puede causar quemaduras por frío, congelación y en espacios cerrados asfixia. - Montar la diapositiva muestra sobre la platina del microscopio para imágenes FT-IR.
- Asegúrese de que la luz visible es "ON" y, a continuación, ya sea usando los binoculares o el programa de captura de la muestra (que proporciona una imagen en tiempo real visible del tejido), se centran en la muestra.
- Abra el paquete de software de paquete como resoluciones a favor y haga clic en "recoger", a continuación, haga clic en 'Diagnósticos' y seleccione 'Alinear Espectrómetro'. Asegúrese de que la trayectoria del haz al detector interno espectrómetro no esté obstruido.
- Haga clic en "Configuración de imagen".
- En la pestaña de 'Electrónica', seleccione la 'velocidad' adecuada 'Bajo SaRatio mpling (UDR) "y" ajustes de filtros 'en función del sistema.
NOTA: En este ejemplo, el entorno es Velocidad = 2,5 KHz, UDR = 4 y Filtros = Ninguno. - En la pestaña 'Óptica' aseguran que se seleccionan "fuente de mitad de IR ',' apertura abierto 'y' 100% atenuador de haz '.
- Para calibrar el sistema, en la pestaña 'Óptica', seleccione 'detector' como 'tierra', 'Microscopio Detector' como 'Izquierda', y luego seleccione ya sea "transmitancia" o "Reflexión" en "modo de Óptica" en función del tipo de la corredera que se utiliza.
- Haga clic en Configuración, que abrirá la ventana "Control Lancer '.
NOTA: Para el modo de reflexión siga las instrucciones en 1,12 y 1,13 y para el modo de transmisión sigue las instrucciones en 1.14 a 1.16. Continúe desde 1,17 tanto para la reflexión y transmisión. - Para el modo de reflexión, en y# 8216; 'clic' Control de Lancer Raw '. Utilizando la palanca de control de la etapa y ver la imagen en directo de la imagen interferograma FT-IR (imagen superior derecha), vaya a un área limpia en la diapositiva.
- Ajuste el tiempo de integración a aproximadamente 8.000 cargos. A continuación, mover la etapa de encontrar un pedazo de tejido con la estructura, preferiblemente el borde de un tejido, y perfeccionar el enfoque de la imagen. Cambiar "calor" y las opciones de 'contraste' para ayudar a formar una imagen para mejorar el enfoque, esto no tendrá ningún efecto en los datos de IR. Continúe desde 1,18.
- Para el modo de transmisión, en haga clic en 'Control de Lancer' en 'Raw'. Utilizando la palanca de control de la etapa y ver la imagen en directo de la imagen interferograma FT-IR (imagen superior derecha), vaya a un área limpia de la diapositiva.
- Ajuste el tiempo de integración a aproximadamente 8.000 cargos.
- Ajustar la parte inferior de enfoque / objetivo condensador para aumentar el número de cuentas a su maximum. Ver la forma de la imagen inferior derecha en el control de Lancer para asegurarse de que es gaussiana en apariencia y relativamente uniforme. Ajuste el tiempo de integración de nuevo a alrededor de 8.000 cuentas.
NOTA: Si cualquiera de los píxeles en la imagen interferograma FT-IR gire blanco, reducir el tiempo de integración. - Mover la etapa de encontrar un pedazo de tejido con la estructura, preferiblemente el borde de un tejido y perfeccionar el enfoque de la imagen. Opcionalmente, cambie las opciones calor y contraste para ayudar a formar una imagen para mejorar el enfoque, pero no tendrá ningún efecto en los datos de IR.
- Utilizando la palanca de control de la etapa, vaya a un área limpia de la diapositiva. Pulse el botón "Calibrar". Asegúrese de que el 'Out Of Range (FQ) «valor es menor que 50 y la diferencia entre el' High Flux 'y cuenta' Low Flux 'es al menos 4.000 recuentos.
- Seleccione "Aceptar" dos veces. En las fichas de óptica seleccionar; 'MCT' 'detector' = 'Microsfrente Detector '=' derecho 'y haga clic en "Configuración". En este punto habrá un interferograma FT-IR en la pantalla. Haga clic en "Buscar Centerburst '. Haga clic en 'OK'.
- En la pestaña 'Óptica', vuelva a seleccionar 'detector' = 'tierra', 'Microscopio Detector' = "izquierda" y seleccione "Configuración".
- En Control de Lancer - que la imagen es aún en un área limpia y haga clic en 'Calibrar' de nuevo. Haga clic en 'OK'.
- A continuación, recoger una imagen de FT-IR de fondo para corregir la absorbancia de la atmósfera, del sistema y de diapositivas. Ve a la pestaña 'Electrónica' y seleccione una resolución espectral adecuada, típicamente de 4 cm-1 o 8 cm -1 para el tejido.
- Ve a la pestaña "fondo" y escriba 128 en 'Scans para co-add'. Seleccione la opción 'Nuevo archivo ... "botón y colocar el archivo de fondo en pliegue apropiadoer. Compruebe la pestaña 'Imaging' para asegurarse de mosaicos es de 1 por 1. Haga clic en el "fondo", esperar a que la exploración hasta el final y confirmar que desea guardar el archivo. Haga clic en una región en la imagen de fondo FT-IR y comprobar el espectro.
- Para tomar una imagen grande mosaico de la muestra, seleccione la pestaña 'Imaging' e introduzca el número de cuadros X e Y para el tamaño del mosaico que desea adquirir.
- Haga clic en "Configuración" y en el Control Lancer utilizar la vista de IR en vivo para encontrar el área de interés. Si se toma un mosaico, centrar la transmisión en vivo en el medio de la zona de interés. Haga clic en 'OK'. Ve a la pestaña 'Electrónica' y escriba el número de exploraciones para co-add (normalmente un valor entre 2 y 16 exploraciones para el tejido). Haga clic en «Buscar».
- Compruebe la imagen FT-IR recogido en la pantalla para asegurarse de que se ve enfocado. Haga clic sobre la imagen para que aparezca un espectro IR de ese lugar y comprobar que parece tener una señal aceptable al ruido. Acquire una imagen visible de la muestra.
- Guarda la imagen y exportarla al formato requerido, tales como ENVI-IDL.
2. Adaptación de un microscopio FT-IR para capacidades de alta definición
NOTA: La mayoría de los sistemas de FT-IR están equipadas con un objetivo aproximadamente con un aumento de 15x y 0,5 apertura numérica (NA). Para la imagen en modo de alta definición, un IR compatible 36X o 74X objetivo puede ser usado para dar difracción capacidades de imagen limitados.
- Retire 15X el objetivo del sistema desatornillando hacia la izquierda.
- Atornillar ya sea en el objetivo 36X o 74X en su lugar. Alinear el objetivo antes de su uso. Utilice tubos de extensión de la lente para llevar el objetivo lo suficientemente cerca de la muestra.
- Coloque el tejido bajo el nuevo objetivo y enfoque utilizando la luz visible ya sea utilizando los prismáticos o programa Capture de la muestra.
NOTA: Imágenes de alta definición debe hacerse de modo de transmisión. La estrecha distancia de trabajo de laobjetivos en sí (1-2 mm) y muy poca profundidad de foco requiere centrarse despacio y con cuidado, teniendo tiempo para bajar el objetivo sin tocar la muestra. - Siga las instrucciones de 1,6 a 1,11.
NOTA: Debido a ser mucho más difícil de enfocar y mucho menos luz que llega al detector, el siguiente protocolo se ajusta basándose en 1.14. - En el modo de transmisión, haga clic en 'Raw'. Utilizando la palanca de control de la etapa y ver la imagen en directo de la imagen interferograma FT-IR (imagen superior derecha), mover a los tejidos y centrarse (idealmente en un borde).
NOTA: Esto puede ser difícil, por lo tanto, ajustar el "calor" y las opciones de 'contraste' para ayudar a formar una imagen para mejorar el enfoque (estas opciones no afectan a los datos IR). - Una vez centrado, con el joystick de control de la etapa y la vista IR vivo traslado a una zona limpia de la diapositiva. Ajuste el tiempo de integración a aproximadamente 8.000 cargos. Ajustar la parte inferior de enfoque objetivoaumentar el número de recuentos a su máximo. Ajuste el tiempo de integración de nuevo a alrededor de 8.000 cuentas.
- Mover la etapa de encontrar un pedazo de tejido con la estructura, preferiblemente el borde de un tejido, y perfeccionar el enfoque de la imagen.
- Si mosaicos de una imagen en alta resolución, ajuste la etapa para permitir el movimiento correcto requerido a través de distancias para los mosaicos de precisión. Para cambiar los ajustes de distancia de la etapa, vaya a 'fase de instalación "en el Control Lancer y ajustar la configuración de alineación horizontal y vertical para permitir la creación de mosaicos correcta.
- Utilizando la palanca de control de movimiento etapa a una zona limpia de la diapositiva. Pulse el botón "Calibrar". Asegúrese de que el fuera de rango (FQ) valor es inferior a 50, tanto para 36X y 74X objetivos. Asegúrese de que la diferencia entre el alto flujo y los valores Low Flux es de al menos 1.000 cuentas para el objetivo 74X y 2000 conteos para el objetivo de 36X.
- Continuar 1,19-1,27. El número de exploraciones en 1,23 y1.25 tendrá que ser ajustado debido a la señal reducida a aproximadamente 256 exploraciones para la imagen de fondo y de 16 a 128 barridos para la imagen de los tejidos.
3. Visualización de y clasificar al espectro IR Conjuntos de datos
NOTA: En esta sección, vamos a discutir la forma de visualizar y extraer datos de imágenes espectrales utilizando el procesamiento de imágenes geoespaciales y análisis de software tales como ENVI + IDL, sin embargo, el proceso es muy similar para cualquier software alternativo, como MATLAB, el software libre como Cytospec o el propio software del desarrollador instrumento. Hay algunas diversas técnicas de procesamiento espectral que se pueden realizar en los datos infrarrojos.
- Abrir el procesamiento de imágenes geoespaciales y software de análisis y cargar el archivo de datos IR.
- Aplicar un algoritmo de corrección de línea de base a los datos de IR seleccionando "Herramientas espectrales" y desplácese hacia abajo y haga clic en "espectros de absorción". Observar un menú emergente y seleccione "corre Línea Basección "
NOTA: La corrección de línea de base eliminará una pendiente de compensación de línea de base a partir de los datos debido a la dispersión - Realizar la normalización espectral, por ratioing los datos a un cierto pico espectral (típicamente de amida I (1650 cm -1) o amida II (1550 cm -1)) o área bajo una región definida de los espectros. Para ello, seleccione "Normal espectros" en el capítulo "Absorbancia Spectra" Opciones del menú.
NOTA: Spectral normalización se lleva a cabo de modo que las diferencias en los espectros son verdaderas diferencias bioquímicas y no debido a espesor o diferencias de densidad entre las muestras. - Usa un algoritmo de reducción de ruido para eliminar el ruido de los espectros 28 si es necesario.
NOTA: Hay varios enfoques disponibles por los cuales la corrección de línea de base, la normalización espectral y la reducción de ruido se pueden lograr, con la mayoría del software que tiene algoritmos automatizados construidos en Además, hay un número emergente de enfoques que corregir para.aberraciones espectrales, que han sido discutidos en detalle 29-42; Sin embargo, la comunidad aún no está de acuerdo en cuales de ellas son necesarias. - Observar una lista de todas las frecuencias IR recogidos dentro de la imagen (típicamente de un rango espectral de 900 a 4000 cm -1). Haga clic en las frecuencias que corresponden a biomoléculas específicas para observar una imagen del tejido en la frecuencia seleccionada.
- Por ejemplo, haga clic en la banda de 1650 cm -1 para observar la distribución de las proteínas en la muestra. Alternativamente, haga clic en la banda de 1080 cm -1 para observar la distribución de los ácidos nucleicos en la muestra. Utilice el número de onda 1650 cm -1.
- Crear imágenes adicionales mediante el cálculo de coeficientes espectrales pico de altura, relaciones de área de pico, etc., que permitan la visualización de los diferentes componentes biomoleculares. Haga clic en "Herramientas espectrales 'y luego seleccione' Ratios altura del pico" o "Calcular el área de imagen 'para crear imágenes.
- Busque en la sección de tejido adyacente correspondiente que se tiñeron utilizando un sistema de imágenes de diapositivas todo único que captura imágenes de campo claro. Junto a la imagen IR, que aparezca la imagen digital del tejido teñido con un programa de imagen visible.
- Haga clic derecho sobre la imagen en una región de interés y seleccione el perfil de Z '. Esto le dará a la información espectral en el píxel seleccionado.
- Mira los espectros IR de múltiples píxeles de varias clases, tales como la comparación de tipos celulares, estados de enfermedad. Marcar píxeles específicos sobre la imagen utilizando el 'regiones de interés "herramienta (ROI). Para realizar esto, haga clic derecho sobre la imagen y selecciona "herramienta de ROI. Crear las clases que estén etiquetados, por ejemplo normal, displasia, y clases de cáncer. A continuación, seleccione "Tipo de retorno de la inversión '-' Point '. A continuación, seleccione la clase para seleccionar píxeles para y se basan en los píxeles correspondientes en la imagen IR. Derivar los espectros promedio fo cada una de las clases utilizando la herramienta 'ROI promedio'.
- Comparación de los espectros obtenidos por el trazado de en software de gráficos.
Representative Results
Formación de imágenes FT-IR permite la derivación de imágenes IR de tejido que pueden dar diferentes contrastes dependiendo de la frecuencia IR de interés. Además, en una imagen IR, cada píxel se compone de todo el espectro IR, con diferentes picos correspondientes a diferentes biomoléculas que pueden dar información acerca de las propiedades bioquímicas de tipos de células o estados de enfermedad (Figura 1). Aquí, hemos demostrado cómo comparar las firmas espectrales entre las clases, clasificación automatizada sin embargo más avanzado es posible el uso de algoritmos adicionales 3,43-50, como la clasificación bayesiana, Random Forests, Redes Neuronales Artificiales y Análisis Cluster Jerárquico se puede realizar en la datos. Enfoques clasificación supervisada permitirán la construcción de un clasificador que puede ser entrenado para permitir el reconocimiento automático de tipos de células o estados de enfermedad. Enfoques de clasificación no se pueden utilizar para buscar natural difconferencias en el tejido o células debido a la variación de bioquímica.
Instrumentación FT-IR ha evolucionado a lo largo de las últimas décadas, a partir de la medición en un punto único modo / mapeo usando IR aberturas opacos a modo de imagen usando objetivos Cassegrain, utilizando un objetivo que ilumina junto con un objetivo recolectar en el modo de transmisión o un solo objetivo que ambos se ilumina y se acumula en-modo de reflexión (Figura 2). Se ha demostrado recientemente que el objetivo recoger en el modo de transmisión podría ser cambiado para un mayor aumento y objetivo numérico de abertura para permitir la formación de imágenes IR de difracción limitada, que conduce a aumentos sustanciales en la resolución espacial de las imágenes IR recogidos 4,5. Los avances en la resolución espacial de las imágenes de tejidos han sido de vital importancia ya que ahora podemos identificar los tipos de células y estructuras de tejido, por ejemplo, las unidades funcionales del riñón, los glomérulos, mediante la adaptación de la casaSistemas de FT-IR (Figura 3).
De alta definición de imagen FT-IR permite obtener imágenes más detalladas de los tejidos para ser examinados para identificar las regiones anormales e identificar diferencias bioquímicas entre diferentes tipos de células. En un núcleo de tejido hepático, es posible visualizar los hepatocitos y las regiones de la infiltración de fibrosis que divide dos áreas distintas de la displasia y cirrosis no displásico (Figura 4). Estamos trabajando para explotar este hacia la fabricación de herramientas de diagnóstico automatizados para uso en casos difíciles de enfermedad hepática.
Es importante destacar que el aumento de la resolución espacial puede ahora nos permitirá aislar las características estructurales específicas que pueden ser modificados químicamente por la enfermedad antes de los cambios histológicos son evidentes. Por ejemplo, estamos enfocados en la identificación de los cambios bioquímicos en las estructuras glomerulares del riñón como la cápsula de Bowman, mesangio, la membrana basal glomerular y la membrana basal tubular, antes cambios identificados por el patólogo se pueden observar (Figura 5). En particular, estamos interesados en la identificación de los cambios asociados con la progresión de la nefropatía diabética y el rechazo crónico en pacientes trasplantados, donde las técnicas actuales no logran identificar los cambios de una manera lo suficientemente temprano para una intervención exitosa.
Figura 1. imágenes FT-IR y el espectro de un núcleo de hígado. Imagen de (A) H & E manchadas núcleo de la biopsia hepática e imágenes de absorbancia IR de la sección de serie del mismo núcleo en (B) 3286 cm -1 y (C) 2603 cm-1, que puso de relieve las diferentes características estructurales. (D) Espectro de IR típico de tejido, con picos importantes rotulados. Barra de escala = 100 micras.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Óptica detallan los modos de operación del microscopio FT-IR esquemáticos. (A) En el modo de transmisión, la muestra se ilumina a través del objetivo de fondo, y la luz que pasa a través de la muestra se recoge por el objetivo superior. (B) En el modo de reflexión, el objetivo superior sirve para iluminar la muestra y para recoger la luz reflejada. El objetivo final no se usa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Comparación de diferencamisetas objetivos de microscopio en las imágenes FT-IR de un glomérulo renal en 2925 cm -1. (A) 15X objetivas recogiendo con NA = 0,5 (tamaño 5.5 x 5.5 m pixel). (B) 36X objetivo de recogida con NA = 0,5 (tamaño 2.2 x 2.2 m pixel). (C) 74X recogiendo objetivo con NA = 0,65 (tamaño de 1,1 x 1,1 m píxeles). La barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. diferencias espectrales entre fibrosis y hepatocitos en un núcleo de hígado. (A) H & E manchadas núcleo de biopsia de hígado. (B) Imagen de una sección de núcleo en serie escaneada en FT-IR (36X configuración objetiva). (C) Repespectros repre- de los hepatocitos y fibrosis, tomada desde regiones de tejido indicadas por las flechas en (A) y (B). Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Diferenciación de las características de la biopsia de tejido renal mediante el uso de alta definición de imagen FT-IR. (A) sección teñida de ácido periódico de Schiff con las características que se extrae la etiqueta. (B) de alta definición de imagen FT-IR de la región CH 2 estiramiento asimétrico (36X configuración objetiva) de una sección de serie del mismo tejido. (C) Características etiquetado en (A) extraído por medio de la imagen de FT-IR en (B) para poder químicamente differentiate las cuatro características del tejido. La barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
FT-IR es una modalidad emergente de libre de etiquetas de imágenes bioquímica de las secciones de tejido, con el potencial de tener un papel importante en la mejora del nivel actual de diagnóstico en la patología. El actual estándar de oro para la patología requiere tejidos para realizar una biopsia, se fijaron en formol, embebidos en parafina, seccionadas varias veces, y se tiñeron con múltiples manchas. Un patólogo altamente capacitado tiene que evaluar subjetivamente visualmente la estructura del tejido y la morfología celular para determinar un diagnóstico. Aquí te mostramos cómo recoger imágenes infrarrojas de alta resolución desde el mismo tipo de secciones y discutir algunos de los enfoques computacionales para examinar las diferencias químicas entre los tipos de células y estados de enfermedad.
Los pasos críticos dentro de este protocolo son asegurar que los tejidos se centran mucho cuidado y que el sistema está bien calibrados para asegurar que los datos espectroscópicos de muy alta calidad. El cuidado al configurar el sistema es particularmente criti cal cuando se trabaja con objetivos de gran aumento. Para ayudar en la solución de problemas, la siguiente lista cubre algunos de los potenciales dificultades encontradas;
Problema: Baja intensidad de IR cuando se generan imágenes en la reflexión. Solución: Compruebe la orientación de diapositivas IR como el revestimiento reflectante puede estar en el lado equivocado de la diapositiva.
Problema: Baja señal / señal de alerta roja en el Control de Lancer. Solución: detectores frescos con LN2. Se requiere de nitrógeno líquido para los detectores FPA para funcionar y requiere periódicamente rellenada.
Problema: Velocity errores error / movimiento. Solución: Cambiar espectrómetro y reducir las vibraciones. Las vibraciones harán que el espejo móvil en el interferómetro a ser perturbado.
Problema: los picos de vapor de agua en los datos. Solución: Aumentar la purga del sistema y proteger la muestra de aire.
Problema: centerburst válido. Solución: Encuentra centerburst nuevo.
e_content "> Problema:. diferencia de bajo flujo en la transmisión, a pesar de que se centró Solución:. Ajuste condensador inferior Esto ocurrirá cuando la luz IR no se está enfocada a un punto en la muestra.En este trabajo, nos hemos centrado en la forma de adquirir imágenes de alta definición IR de los tejidos, ya sea en el modo de transmisión o transflectancia. La naturaleza de las imágenes FT-IR, es que hay múltiples modificaciones que se pueden hacer a la adquisición de datos, tales como, el tipo de sustrato, la técnica de fijación, espesor de la muestra, la resolución espectral, interferómetro velocidad Espejo etc. El efecto de estos parámetros tiene ha discutido en extenso detalle recientemente 4,5,17,51.
Hay una serie de modificaciones que pueden introducirse en el sistema de formación de imágenes incluyendo imágenes en modo ATR 10,24,26 y el uso de enfoques térmicas nanoescala 52,53 para permitir la formación de imágenes IR de alta resolución. La principal limitación con imágenes de infrarrojos de alta resolución es que el tiEMAS deben ser cuidadosamente preparados y lo suficientemente delgada para IR para pasar a través (típicamente 4 micras de espesor). Además, las imágenes de FT-IR de transmisión y reflectancia requiere las muestras a ser seco debido a la absorbancia de IR por el agua. Sin embargo, las imágenes de FT-IR tiene ventajas significativas sobre otras técnicas, ya que puede imagen muy rápidamente grandes áreas de tejido mientras que se derivan información bioquímica rica y detallada. Otras técnicas similares que se derivan información bioquímica de una manera libre de etiquetas incluyen la espectroscopia Raman, sin embargo el tiempo de adquisición de datos es mucho más lento para adquirir imágenes. Están surgiendo enfoques de imagen Nueva Raman incluyendo la dispersión Raman estimulada (SRS) y coherente Antistokes dispersión Raman (CARS); sin embargo, tienen rango espectral de acceso limitado o imágenes de una sola frecuencia.
Los avances en la velocidad de adquisición de datos, la resolución espacial, y la disponibilidad de métodos de cálculo han sido de gran valor en la toma de FT-IR imaging un enfoque más factible para la traducción como una nueva herramienta de imagen en patología. Los recientes avances en la resolución espacial han sido especialmente importantes para la patología del tejido debido a tipos de células clave no son resolubles mediante sistemas de imágenes de FT-IR convencionales. El trabajo reciente de Reddy et al. mostró cómo modelar un sistema ideal para obtener la resolución espacial óptima de un sistema de imagen FT-IR 5. El ejemplo tejido renal se presenta en este trabajo se demuestra la importancia de una mayor resolución espacial con el fin de extraer información bioquímica de las estructuras glomerulares (Figura 3 y Figura 5). En el futuro, los nuevos avances en Quantum Cascade Lasers como muy brillantes fuentes de luz IR 54-57, imagen espectral 3D de 58 años, y los avances en el campo de las tecnologías de nanoescala IR 52,53,59,60 sostienen emocionantes nuevas vías de investigación que pueden tener enormes implicaciones en el futuro de la imagen de tejidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
| Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
| Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
| MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
| Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
| Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
| Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
| Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
| Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
| ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
| Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |
References
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