Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.
HD-Fourier Transform Infrared (FT-IR) spektroskopiske imaging er en voksende tilnærming for å få detaljerte bilder som har knyttet biokjemiske informasjonen. FT-IR avbildning av vev er basert på prinsippet om at ulike regioner av mid-infrarøde absorberes av ulike kjemiske bindinger (f.eks, C = O, CH, NH) innenfor celler eller vev som kan deretter bli knyttet til tilstedeværelse og sammensetning av biomolekyler (f.eks, lipider, DNA, glykogen, protein, kollagen). I et FT-IR-bildet, omfatter hver piksel i bildet en hel infrarød (IR) spektrum som kan gi informasjon om den biokjemiske status for de celler som deretter kan utnyttes for celle-type eller sykdomstypen klassifisering. I denne artikkelen viser vi: hvordan du får tak IR-bilder fra menneskelige vev ved hjelp av en FT-IR-systemet, for å tillate HD-imaging evner, og hvordan å visualisere FT-IR-bilder hvordan du kan endre eksisterende instrumentering. Vi deretter presentere noen anvendelser av FT-IRfor patologi ved hjelp av lever og nyre som eksempler. FT-IR bildebehandling holder spennende applikasjoner i å gi en ny rute for å få biokjemiske informasjon fra celler og vev i en helt etikett-fri ikke-perturbing rute mot å gi ny innsikt i biomolekylære endringer som en del av sykdomsprosesser. I tillegg kan denne biokjemiske informasjonen potensielt tillate for objektiv og automatisk analyse av visse aspekter av sykdomsdiagnose.
IR-spektroskopi har vært et analytisk verktøy tilgjengelig i noen form siden 1930-tallet; er det imidlertid bare vært i løpet av det siste tiåret at arealet av vev avbildning med FT-IR har eksplodert. Fremskrittene i FT-IR for vev avbildning har vært drevet i en stor del av tre sentrale utviklingstrekk: 1) økt hastighet av datainnsamling på grunn av tilgjengeligheten av stor Focal Plane Array (FPA) detektorer som typisk har tusenvis av IR-følsomme detektorer 1 , 2, 2) utvikling av avanserte prosesseringsalgoritmer og regnekraft til å håndtere store hyperspektral datasett 3, og 3) modellering av FT-IR imaging-systemer for å maksimere spatial oppløsning 4,5. Det har vært mange høy kvalitet og svært omfattende artikler gjenn feltet av FT-IR spektroskopi nylig 6-16, i tillegg til Nature Protokoller papir med detaljer om trinn for å få poeng spektra eller kart fra vev 17. I denne artikkelen vil vi fokusere på protocol å få bilder av vev ved hjelp av en 128 x 128 FPA detektor i en modifisert FT-IR system med HD-evner.
FT-IR-avbildning har lenge vært foreslått å være et potensielt ønskelige verktøy for celler og vev avbildning på grunn av evnen til å oppnå bilder hvor hvert piksel har et mangfold av biokjemisk informasjon. FT-IR-avbildning er basert på det prinsipp at forskjellige biomolekyler i en prøve vil kvantitativt absorbere forskjellige regioner av mid-IR; Dette gjør det mulig for avledning av en biokjemisk fingeravtrykk ". Denne fingeravtrykk hadde blitt vist i mange studier for å endre mellom ulike celletyper og sykdomstilstander. I motsetning til konvensjonell praksis patologi hvor flekker og immunhistokjemiske markører trenger å bli brukt til å visualisere og identifisere celletyper og vev strukturer som brukes for å lede diagnose og behandling, blir bildene fra FT-IR dannet basert på den iboende biokjemi av vevet. Den nåværende technique av farging vev for diagnostisering er tidkrevende, destruktive, arbeidskrevende, og krever subjektive ekspertise av patologen, mens FT-IR gir mulighet for å gjøre denne prosessen rask, ikke-destruktiv, svært automatisert, og mer objektiv. I tillegg gir FT-IR en ny vei til å skaffe ytterligere biokjemisk informasjon som kanskje ikke er lett tilgjengelige ved hjelp av konvensjonelle fargeteknikker.
En av de mest spennende fremskritt de siste årene har vært tilgjengeligheten av høyoppløste bilde tilnærminger som nå kan tillate for visualisering og karakterisering av celletyper og vev strukturer som er kritiske for omfattende sykdomsdiagnose. En av disse teknikker er attenuert total refleksjon (ATR) FT-IR som inkorporerer en fast nedsenking linse (SIL) av en høy brytningsindeks, som gjør det mulig for oppløsningen avbildning 18 høy, med mange meget spennende studier som viser dens anvendelser 19-25. I tillegg, det wsom nylig vist at økt romlig oppløsning forbundet med ATR bildebehandling kan tillate for visualisering og klassifisering av endothelial og korg cellene i brystvevet som danner en viktig del av brystkreftdiagnose 26. Mens ATR avbildning er meget nyttig, krever denne teknikk SIL å komme i kontakt med vevet til å danne FT-IR-bilder; Derfor er bruken noe begrenset til vev patologi der store områder av vev må raskt avbildes.
En annen tilnærming ble demonstrert ved kobling av en høy forstørrelse objektiv til en eksisterende FT-IR-system som bruker en synkrotron som en lysende kilde til IR, er det mulig å fullt belyse en FPA og bilde med en effektiv pikselstørrelse på 0,54 x 0,54 um. Dette er mulig for oss å visualisere viktige strukturer i bryst og prostata vev som ikke ble løses ved hjelp av konvensjonelle FT-IR-systemer fire. Mens disse dramatiske økninger i IR bilde romlig resolution var spennende, bruken forble begrenset på grunn krever en synkrotron. Deretter ble et optimalt system designet som kunne også gi rom for HD-imaging evner med en 1,1 x 1,1 mikrometer pikselstørrelse uten kravet om en synkrotron kilde, men heller bruke en tradisjonell globar IR kilde 5. I denne artikkelen viser vi hvordan du kan endre en eksisterende kommersielle FT-IR imaging system for å tillate diffraksjon begrenset IR avbildning av vev med et akseptabelt signal til støyforhold ved hjelp av flere IR mål (15X, 36X og 74X). Den effektive pikselstørrelse med de tre målene er 5,5 x 5,5 mikrometer (15X), 2,2 x 2,2 mikrometer (36X) og 1,1 x 1,1 mikrometer (74X). Vi da gi noen eksempler på viktigheten av gevinstene i romlig oppløsning for sykdom deteksjon i lever og nyre biopsier 27.
FT-IR er en ny modalitet for etikett-fri biokjemisk avbildning av vevssnitt, med potensial til å ha en viktig rolle i å forbedre dagens standard av diagnose i patologi. Dagens gullstandard for patologi krever vev som skal biopsied, fast i formalin, dyppet i parafin, seksjonert flere ganger, og farget med flere flekker. Et høyt utdannet patolog må subjektivt visuelt bedømme vevet struktur og cellulær morfologi for å bestemme en diagnose. Her viser vi hvordan du kan samle høyoppløselige IR-bilder fra samme type seksjoner og diskutere noen av de beregnings tilnærminger for å undersøke kjemiske forskjeller mellom celletyper og sykdomstilstander.
De kritiske trinn i denne protokollen, er å sikre at vevet er svært nøye fokusert, og at systemet er godt kalibrert for å sikre meget høy kvalitet spektroskopiske data. Omsorg når du setter opp systemet er spesielt Criti cal når du arbeider med høye forstørring. Til hjelp i feilsøking dekker følgende liste noen av de potensielle vanskelighetene;
Problem: Lav IR intensitet når bildebehandling i refleksjon. Løsning: Kontroller IR lysbilde orientering som den reflekterende belegg kan være på feil side av raset.
Problem: Lav signal / Rød varselskilt i Lancer Control. Løsning: Cool detektorer med LN2. Flytende nitrogen er nødvendig for FPA detektorer for å fungere, og krever jevnlig blir toppet.
Problem: Velocity feil / bevegelses feil. Løsning: Tilbakestill spektrometer og redusere vibrasjoner. Vibrasjoner vil føre til det bevegelige speil i interferometeret til å bli forstyrret.
Problem: Vanndamp toppene i data. Løsning: Øk utrenskning på systemet og beskytte prøve fra luften.
Problem: Ugyldig centerburst. Løsning: Finn centerburst igjen.
e_content "> Problem:. lav fluks forskjell i transmisjonen, selv om konsentrert løsning. Juster bunnkjøler Dette vil skje som IR-lyset ikke blir fokusert til et punkt på prøven.I denne artikkelen har vi fokusert på hvordan å skaffe seg HD-IR-bilder av vev i enten overføring eller transflektans modus. Naturen av FT-IR-avbildning, er at det er flere modifikasjoner som kan gjøres til datainnsamlings-, så som type-substrat, fikseringsteknikk, prøvetykkelse, spektral oppløsning, interferometer speilhastighet etc. Effekten av disse parametre har vært diskutert i omfattende detalj nylig 4,5,17,51.
Det finnes en rekke modifikasjoner som kan gjøres til avbildningssystem som innbefatter avbildning i ATR-modus 10,24,26, og ved hjelp av nanoskala termiske metoder 52,53 for å tillate høy oppløsning IR-avbildning. Den største begrensningen med høy oppløsning IR bildebehandling er at tissues må være nøye forberedt og tynn nok for IR kan passere (vanligvis fire mikrometer tykkelse). I tillegg krever transmisjon og refleksjon FT-IR-avbildning prøvene å være tørr på grunn av IR-absorbansen av vann. Imidlertid har FT-IR-avbildning betydelige fordeler i forhold til andre teknikker, ved at det kan meget hurtig bilde store områder av vevet, mens stammer rik og detaljert biokjemisk informasjon. Andre lignende teknikker som henter biokjemiske informasjonen i en etikett-free mote inkluderer Raman-spektroskopi, men tidspunktet for datainnsamling er mye tregere å hente bilder. New Raman bildebehandling tilnærminger dukker blant annet stimulert Raman spredning (SRS) og Coherent Antistokes Raman spredning (CARS); Men de har tilgang begrenset spektralområde eller enkel frekvens bildebehandling.
Fremskritt i hastigheten på datainnsamling, romlig oppløsning, og tilgjengeligheten av beregningsorientert tilnærminger har vært av enorm verdi i å gjøre FT-IR imaging et mer gjennomførbare tilnærming for oversettelse som en ny bilde verktøy i patologi. De siste fremskritt i romlig oppløsning har vært spesielt viktig for vev patologi grunn til viktige celletyper som ikke er løses ved hjelp av konvensjonelle FT-IR bildesystemer. Den nylige papir ved Reddy et al. viste hvordan å modellere et ideelt system for å oppnå optimal romlig oppløsning på en FT-IR imaging system 5. Nyrevevet eksempel presentert i denne avhandlingen viser viktigheten av høyere romlig oppløsning for å trekke biokjemiske informasjon fra glomerulær strukturer (Figur 3 og Figur 5). I fremtiden, nye fremskritt i Quantum Cascade Lasere som svært lyse IR lyskilder 54-57, 3D spektral avbildning 58, og gjennombrudd innen nanoskala IR teknologier 52,53,59,60 holde spennende nye muligheter for forskning som kan ha enorme implikasjoner i fremtiden av vev bildebehandling.
<p class = "jove_content"> Vi har presentert eksempler på applikasjoner i lever og nyre sykdom hvor det er behov for ytterligere biokjemisk informasjon som kan være av diagnostisk verdi. Spectral Pathology Lab i Avdeling for patologi ved University of Illinois i Chicago er fokusert på oversettelsen av IR teknologier mot å forbedre sykdom diagnose og bedre prediksjon av pasientens utfall. FT-IR bildebehandling kan overvinne noen av dagens begrensninger i patologi praksis der kvantitativ og objektiv informasjon er nødvendig. Spesielt er det videre arbeidet fokusert på å identifisere områder i dagens patologi praksis der dagens teknikker ikke klarer å gi tilstrekkelig diagnostisk sensitivitet eller gi begrenset informasjon. Et klart behovet eksisterer i å forbedre dagens praksis med patologi og mot å gi mer informasjon til patologen om en pasients sykdomsstatus, noe som kan være oppnåelig ved hjelp av high-definition FT-IR imaging.The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.
Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |