Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.
HD-Fourier Transform Infrared (FT-IR) spektroskopiska avbildning är en framväxande strategi för att få detaljerade bilder som har associerade biokemisk information. FT-IR avbildning av vävnad bygger på principen att olika regioner i mittinfraröd absorberas av olika kemiska bindningar (t.ex. C = O, CH, NH) inom celler eller vävnad som sedan kan relateras till närvaron och sammansättning av biomolekyler (t ex lipider, DNA, glykogen, protein, kollagen). I en FT-IR-bild, varje pixel i bilden innefattar en hel Infraröd (IR) spektrum som kan ge information om den biokemiska statusen hos de celler som sedan kan utnyttjas för celltyp eller sjukdomstypen klassificering. I denna uppsats visar vi: hur man får IR-bilder från mänskliga vävnader med hjälp av en FT-IR-system, hur man ändra befintliga instrument för att möjliggöra HD-bildfunktioner, samt hur man kan visualisera FT-IR-bilder. Vi presenterar sedan några tillämpningar av FT-IRför patologi med hjälp lever och njure som exempel. FT-IR imaging rymmer spännande applikationer i att ge en ny väg att få biokemisk information från celler och vävnad i en helt etikettfria icke störande väg mot att ge nya insikter i biomolekylära förändringar som en del av sjukdomsprocesser. Dessutom kan denna biokemiska informationen potentiellt att objektivt och automatiserad analys av vissa aspekter av sjukdomsdiagnos.
IR-spektroskopi har varit ett analytiskt verktyg tillgängliga i någon form sedan 1930-talet; dock är det bara varit inom det senaste decenniet att området av vävnad avbildning med FT-IR har exploderat. Framstegen inom FT-IR för vävnads avbildning har drivits i en stor del av tre viktiga händelser: 1) ökad hastighet av datainsamling på grund av tillgången på stora Focal Plane Array (FPA) detektorer som typiskt har tusentals IR känsliga detektorer 1 , 2, 2) utveckling av avancerade algoritmer och beräkningskraft för att hantera stora hyperdatamängder 3, och 3) modellering av FT-IR bildsystem för att maximera rumsliga upplösningen 4,5. Det har varit många hög kvalitet och mycket omfattande artiklar granskar området FT-IR-spektroskopi nyligen 6-16, förutom en Nature Protocols papper som beskriver de åtgärder för att få poäng spektra eller kartor från vävnader 17. I denna uppsats kommer vi att fokusera på protocol att få bilder av vävnader med hjälp av en 128 x 128 FPA-detektor i en modifierad FT-IR-system med HD-kapacitet.
FT-IR avbildning har länge föreslagits vara ett potentiellt önskvärd metod för cell- och vävnads avbildning på grund av möjligheten att få bilder där varje pixel har en uppsjö av biokemisk information. FT-IR avbildning bygger på principen att olika biomolekyler i ett prov kvantitativt absorberar olika regioner i mitten infrarött; Detta gör det möjligt att härleda en "biokemisk fingeravtryck". Denna fingeravtryck hade visats i många studier att ändra mellan olika celltyper och sjukdomstillstånd. Till skillnad från vid konventionell patologi praktiken där fläckar och immunhistokemiska markörer måste användas för att visualisera och identifiera celltyper och vävnadsstrukturer som används för att styra diagnos och behandlingsalternativ, är bilderna från FT-IR konstitueras baserat på den inneboende biokemi av vävnaden. Den nuvarande technique färgningsvävnad för diagnos är tidskrävande, destruktiv, mödosam och kräver subjektiva expertis patologen, medan FT-IR har förutsättningar att göra denna process snabba, icke-förstörande, högt automatiserad och mer objektiv. Dessutom ger FT-IR en roman väg att få ytterligare biokemisk information som inte kan vara lätt tillgängliga med hjälp av konventionella färgningstekniker.
En av de mest spännande framstegen under de senaste åren har varit tillgången till högupplösta avbildning som nu kan möjliggöra visualisering och karakterisering av celltyper och vävnadsstrukturer som är kritiska för omfattande diagnossjukdom. En av dessa tekniker är dämpad totalreflektion (ATR) FT-IR som inkorporerar ett fast nedsänkning lins (SIL) av ett högt brytningsindex som gör det möjligt för högupplöst avbildning 18, med många mycket spännande studier visar dess tillämpningar 19-25. Dessutom, det wså nyligen visat att den ökade rumsliga upplösningen i samband med ATR avbildning kan möjliggöra visualisering och klassificering av endotelceller och myoepitelceller i bröstvävnad som utgör en viktig del av bröstcancer diagnos 26. Medan ATR avbildning är mycket användbar, kräver denna teknik SIL för att göra kontakt med vävnaden för att bilda FT-IR-bilder; Därför är dess användning något begränsad för vävnadspatologi där stora områden av vävnader snabbt måste avbildas.
Ett andra tillvägagångssätt demonstrerades genom att koppla en hög förstoring mål till en befintlig FT-IR-system som använder en synkrotron som en ljus källa av IR, är det möjligt att till fullo belysa en FPA och bild med en effektiv pixelstorlek på 0,54 x 0,54 um. Detta tillät oss att visualisera viktiga strukturer i bröst och prostata vävnader som inte var upplösningen med hjälp av konventionella FT-IR-system 4. Medan dessa dramatiska ökningar i IR-bilden rumslig Upplösning in var spännande, dess användning fortsatt begränsat på grund av att det krävs en synkrotron. Därefter blev ett optimalt system som utformats som också skulle kunna möjliggöra HD-bildfunktioner med 1,1 x 1,1 um pixelstorlek utan kravet på en synkrotron källa utan snarare använda en traditionell globar IR källa 5. I den här artikeln visar vi hur du ändrar en befintlig kommersiell FT-IR bildsystem för att möjliggöra diffraktionsbegränsad IR avbildning av vävnader med en acceptabel signalbrusförhållande använder flera IR mål (15X, 36x, och 74X). Den effektiva pixelstorleken med de tre målen är 5,5 x 5,5 m (15X), 2,2 x 2,2 m (36X) och 1,1 x 1,1 m (74X). Vi ger sedan några exempel på betydelsen av de vinster i rumslig upplösning för detektering sjukdom hos lever- och njurbiopsi 27.
FT-IR är en framväxande modalitet för etikettfria biokemiska avbildning av vävnadssnitt, med potential att ha en viktig roll för att förbättra den nuvarande standarden för diagnos i patologi. Den nuvarande standarden för patologi kräver vävnader som skall biopsier, fixerades i formalin, inbäddade i paraffin, sektione flera gånger, och färgas med flera fläckar. En högt utbildad patolog måste subjektivt visuellt bedöma vävnadsstruktur och cellulär morfologi för att fastställa en diagnos. Här visar vi hur man samlar högupplösta IR-bilder från samma typ av sektioner och diskutera några av de beräkningsmetoder för att undersöka kemiska skillnader mellan celltyper och sjukdomstillstånd.
De kritiska steg inom detta protokoll är att säkerställa att de vävnader mycket noga fokuserad och att systemet är väl kalibrerad för att säkerställa spektroskopiska data mycket hög kvalitet. Vården vid installation av systemet är särskilt criti cal när man arbetar med höga målsättningar förstoring. För att underlätta felsökning, täcker följande lista några av de potentiella svårigheterna;
Problem: Låg IR intensitet när avbildning i reflektion. Lösning: Kontrollera IR slide orientering som den reflekterande beläggningen kan vara på fel sida av bilden.
Problem: Låg signal / Röd varningsskylt i Lancer Control. Lösning: Cool detektorer med LN2. Flytande kväve krävs för FPA detektorer för att fungera och kräver periodvis vara laddat.
Problem: Velocity fel error / rörelse. Lösning: Återställ spektrometer och minska vibrationer. Vibrationer kommer att orsaka den rörliga spegeln i interferometern att störas.
Problem: Vattenånga spikar i data. Lösning: Öka utrensning på systemet och skydda provet från luften.
Problem: Ogiltig centerburst. Lösning: Hitta centerburst igen.
e_content "> Problem:. Låg flux skillnad i sändning, trots fokuserad Lösning:. Justera botten kondensor Detta kommer att ske när IR ljuset inte fokuseras till en punkt på provet.I denna uppsats har vi fokuserat på hur jag ska få högupplösta IR-bilder av vävnader i antingen sändning eller genomreflektionsläge. Den typ av FT-IR avbildning, är att det finns flera modifieringar som kan göras till datainsamling, till exempel, typ av substrat, bindningsteknik, provtjocklek, spektral upplösning, interferometer spegel hastighet etc. Effekten av dessa parametrar har diskuterats i omfattande detalj nyligen 4,5,17,51.
Det finns ett antal ändringar som kan göras för att avbildningssystemet inklusive avbildning i ATR-läge 10,24,26 och använder nanoskala termiska metoder 52,53 för att möjliggöra för högupplöst IR avbildning. Den största begränsningen med hög upplösning IR avbildning är att tissues måste noggrant förberedda och tunna nog för IR att passera (vanligtvis 4 um tjocklek). Dessutom kräver överföring och reflektans FT-IR-avbildning proverna ska vara torr på grund av absorbansen av IR genom vatten. Emellertid har FT-IR-avbildning betydande fördelar jämfört med andra tekniker, genom att den kan mycket snabbt bild stora områden av vävnad medan härrör rik och detaljerad biokemisk information. Andra liknande tekniker som härrör biokemisk information på en etikett fritt sätt inkluderar Ramanspektroskopi, men tiden för datainsamling är mycket långsammare att få bilder. Nya Raman avbildning växer fram bland stimulerad Ramanspridning (SRS) och sammanhängande Antistokes Ramanspridning (CARS); emellertid har de tillgång begränsat spektralområde eller enda frekvens avbildning.
Framstegen inom hastighet datainsamling, rumslig upplösning, och tillgången på beräkningsmetoder har varit av enormt värde i att göra FT-IR imaging av ett bättre tillvägagångssätt för översättning som ett nytt bild verktyg i patologi. De senaste framstegen inom rumslig upplösning har varit särskilt viktigt för vävnadspatologi pga viktiga celltyper som inte är upplösningen med hjälp av konventionella bildsystem FT-IR. Den senaste uppsats av Reddy et al. visade hur man modellera ett idealiskt system för att få optimal rumsliga upplösningen i en FT-IR bildsystem 5. Exemplet njurvävnad som presenteras i denna uppsats visar på betydelsen av högre rumsliga upplösningar för att utvinna biokemisk information från glomerulära strukturer (Figur 3 och Figur 5). I framtiden nya framsteg inom Quantum Cascade Lasers som mycket ljusa IR ljuskällor 54-57, 3D spektral avbildning 58 och genombrott inom nano IR teknik 52,53,59,60 håller nya spännande vägar för forskning som kan ha enorma konsekvenser i framtiden för vävnads avbildning.
<p class = "jove_content"> Vi har present exempel på tillämpningar i lever och njursjukdomar där det finns ett behov av ytterligare biokemisk information som kan vara av diagnostiskt värde. Den Spectral patologi Lab i avdelningen för patologi vid University of Illinois i Chicago är inriktad på översättningen av IR bildteknik för att förbättra sjukdomsdiagnos och förbättrad förutsägelse av patientens utfall. FT-IR imaging kan övervinna några av de nuvarande begränsningarna i patologi praktiken som kräver kvantitativ och objektiv information. I synnerhet är det framtida arbetet fokuserar på att identifiera områden i nuvarande patologi praxis där aktuella tekniker misslyckas med att ge tillräcklig diagnostisk känslighet eller ge begränsad information. En klart behov föreligger att förbättra nuvarande praxis patologi och mot att ge mer information till patologen om en patients sjukdomsstatus, vilket kan vara uppnåe med high-definition FT-IR avbildning.The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.
Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |