Abstract
HD-Fourier Transform Infrared (FT-IR) spektroskopiska avbildning är en framväxande strategi för att få detaljerade bilder som har associerade biokemisk information. FT-IR avbildning av vävnad bygger på principen att olika regioner i mittinfraröd absorberas av olika kemiska bindningar (t.ex. C = O, CH, NH) inom celler eller vävnad som sedan kan relateras till närvaron och sammansättning av biomolekyler (t ex lipider, DNA, glykogen, protein, kollagen). I en FT-IR-bild, varje pixel i bilden innefattar en hel Infraröd (IR) spektrum som kan ge information om den biokemiska statusen hos de celler som sedan kan utnyttjas för celltyp eller sjukdomstypen klassificering. I denna uppsats visar vi: hur man får IR-bilder från mänskliga vävnader med hjälp av en FT-IR-system, hur man ändra befintliga instrument för att möjliggöra HD-bildfunktioner, samt hur man kan visualisera FT-IR-bilder. Vi presenterar sedan några tillämpningar av FT-IRför patologi med hjälp lever och njure som exempel. FT-IR imaging rymmer spännande applikationer i att ge en ny väg att få biokemisk information från celler och vävnad i en helt etikettfria icke störande väg mot att ge nya insikter i biomolekylära förändringar som en del av sjukdomsprocesser. Dessutom kan denna biokemiska informationen potentiellt att objektivt och automatiserad analys av vissa aspekter av sjukdomsdiagnos.
Introduction
IR-spektroskopi har varit ett analytiskt verktyg tillgängliga i någon form sedan 1930-talet; dock är det bara varit inom det senaste decenniet att området av vävnad avbildning med FT-IR har exploderat. Framstegen inom FT-IR för vävnads avbildning har drivits i en stor del av tre viktiga händelser: 1) ökad hastighet av datainsamling på grund av tillgången på stora Focal Plane Array (FPA) detektorer som typiskt har tusentals IR känsliga detektorer 1 , 2, 2) utveckling av avancerade algoritmer och beräkningskraft för att hantera stora hyperdatamängder 3, och 3) modellering av FT-IR bildsystem för att maximera rumsliga upplösningen 4,5. Det har varit många hög kvalitet och mycket omfattande artiklar granskar området FT-IR-spektroskopi nyligen 6-16, förutom en Nature Protocols papper som beskriver de åtgärder för att få poäng spektra eller kartor från vävnader 17. I denna uppsats kommer vi att fokusera på protocol att få bilder av vävnader med hjälp av en 128 x 128 FPA-detektor i en modifierad FT-IR-system med HD-kapacitet.
FT-IR avbildning har länge föreslagits vara ett potentiellt önskvärd metod för cell- och vävnads avbildning på grund av möjligheten att få bilder där varje pixel har en uppsjö av biokemisk information. FT-IR avbildning bygger på principen att olika biomolekyler i ett prov kvantitativt absorberar olika regioner i mitten infrarött; Detta gör det möjligt att härleda en "biokemisk fingeravtryck". Denna fingeravtryck hade visats i många studier att ändra mellan olika celltyper och sjukdomstillstånd. Till skillnad från vid konventionell patologi praktiken där fläckar och immunhistokemiska markörer måste användas för att visualisera och identifiera celltyper och vävnadsstrukturer som används för att styra diagnos och behandlingsalternativ, är bilderna från FT-IR konstitueras baserat på den inneboende biokemi av vävnaden. Den nuvarande technique färgningsvävnad för diagnos är tidskrävande, destruktiv, mödosam och kräver subjektiva expertis patologen, medan FT-IR har förutsättningar att göra denna process snabba, icke-förstörande, högt automatiserad och mer objektiv. Dessutom ger FT-IR en roman väg att få ytterligare biokemisk information som inte kan vara lätt tillgängliga med hjälp av konventionella färgningstekniker.
En av de mest spännande framstegen under de senaste åren har varit tillgången till högupplösta avbildning som nu kan möjliggöra visualisering och karakterisering av celltyper och vävnadsstrukturer som är kritiska för omfattande diagnossjukdom. En av dessa tekniker är dämpad totalreflektion (ATR) FT-IR som inkorporerar ett fast nedsänkning lins (SIL) av ett högt brytningsindex som gör det möjligt för högupplöst avbildning 18, med många mycket spännande studier visar dess tillämpningar 19-25. Dessutom, det wså nyligen visat att den ökade rumsliga upplösningen i samband med ATR avbildning kan möjliggöra visualisering och klassificering av endotelceller och myoepitelceller i bröstvävnad som utgör en viktig del av bröstcancer diagnos 26. Medan ATR avbildning är mycket användbar, kräver denna teknik SIL för att göra kontakt med vävnaden för att bilda FT-IR-bilder; Därför är dess användning något begränsad för vävnadspatologi där stora områden av vävnader snabbt måste avbildas.
Ett andra tillvägagångssätt demonstrerades genom att koppla en hög förstoring mål till en befintlig FT-IR-system som använder en synkrotron som en ljus källa av IR, är det möjligt att till fullo belysa en FPA och bild med en effektiv pixelstorlek på 0,54 x 0,54 um. Detta tillät oss att visualisera viktiga strukturer i bröst och prostata vävnader som inte var upplösningen med hjälp av konventionella FT-IR-system 4. Medan dessa dramatiska ökningar i IR-bilden rumslig Upplösning in var spännande, dess användning fortsatt begränsat på grund av att det krävs en synkrotron. Därefter blev ett optimalt system som utformats som också skulle kunna möjliggöra HD-bildfunktioner med 1,1 x 1,1 um pixelstorlek utan kravet på en synkrotron källa utan snarare använda en traditionell globar IR källa 5. I den här artikeln visar vi hur du ändrar en befintlig kommersiell FT-IR bildsystem för att möjliggöra diffraktionsbegränsad IR avbildning av vävnader med en acceptabel signalbrusförhållande använder flera IR mål (15X, 36x, och 74X). Den effektiva pixelstorleken med de tre målen är 5,5 x 5,5 m (15X), 2,2 x 2,2 m (36X) och 1,1 x 1,1 m (74X). Vi ger sedan några exempel på betydelsen av de vinster i rumslig upplösning för detektering sjukdom hos lever- och njurbiopsi 27.
Protocol
1. Installera en FT-IR Mikroskop och Förvärva Vävnads Images
- § en formalinfixerad paraffininbäddad vävnad block vid 4 | im tjocklek på till en IR-kompatibel slid med hjälp av en mikrotom. Alternativt, avsnitt ett flytande kväve fryst vävnad vid 4 ^ m tjocklek på en IR-kompatibel slide med hjälp av en kryostat.
OBS: Vanligtvis kommer en seriell avsnitt också förvärvas på ett objektglas och färgades med en speciell (t.ex. Haematoxylin och eosin (H & E)) eller immunhistokemisk färgning. Dessutom kan odlade cellinjer odlas på IR kompatibla diabilder. IR kompatibla diabilder kan vara IR reflekterande bilder för eftertanke läge imaging (t.ex. MirrIR slide, guld) eller IR transparenta diabilder för sändningsläge imaging (t.ex. BaF2, CaF2). - Purge FT-IR-mikroskop och spektrometer med användning av antingen torr luft eller torr kvävgas för att avlägsna vatten i atmosfären från systemet. Vänta minst 45 minuter innan avbildning för att säkerställa en grundlig purge.
- Cool både FPA detektor (till 79 K) och den inre MCT detektor i FT-IR-mikroskop med användning av flytande kväve. Kyl detektorerna ungefär var 6 tim.
OBSERVERA! Flytande kväve är en kryogen vätska och kan orsaka köldskador, förfrysning och i slutna utrymmen kvävning. - Montera provglas på mikroskop scenen för FT-IR avbildning.
- Se till synligt ljus är "ON" och sedan antingen med hjälp av kikare eller prov capture program (som ger en realtids synlig bild av vävnaden), fokusera på provet.
- Öppna bunt programpaket exempelvis resolutioner pro och klicka på "Collect", klicka sedan på "Diagnos" och välj sedan "Justera Spectrometer". Se till att strålgången till spektrometern interna detektorn inte hindras.
- Klicka på "Imaging Setup".
- Under fliken "Electronics, välj lämplig" Speed "," Under Sampling Ratio (UDR) "och" Filter "inställningar beroende på systemet.
OBS: I det här exemplet, är inställningen Hastighet = 2,5 kHz, UDR = 4 och filter = None. - Under fliken "Optik" se till att "Mid-IR källa", "Öppna bländare" och "100% beam dämparen" väljs.
- För att kalibrera systemet, i "Optik" fliken, välj "Detector" som "Ground", "Mikroskop Detector" som "vänster", och välj sedan antingen "Tran" eller "Reflectance" under "Optics läge" beroende på typ av skjut används.
- Klicka på Inställningar, vilket kommer att öppna upp "Lancer Control" fönstret.
OBS: För reflektionsmod följ instruktionerna i 1.12 och 1.13 samt för överföring läge följ instruktionerna i 1,14-1,16. Fortsätt från 1,17 för både reflektion och transmission. - För eftertanke läget i &# 8216; Lancer Control ", klicka på" Raw ". Använda scenen styrspaken och titta på live view på FT-IR interferogram bild (överst till höger bild), flytta till ett rent område på bilden.
- Justera integrationstiden till cirka 8000 pulser. Därefter flyttar scenen för att hitta en bit vävnad med struktur, företrädesvis i kanten av en vävnad, och perfekt fokus i bilden. Ändra "Värme" och "Kontrast" alternativ för att hjälpa bilda en bild för att förbättra fokus, kommer detta att ha någon effekt på IR-data. Fortsätt från 1,18.
- För sändningsläge, i 'Lancer Control ", klicka på" Raw ". Använda scenen styrspaken och titta på live view på FT-IR interferogram bild (överst till höger bild), flytta till ett rent område av bilden.
- Justera integrationstiden till cirka 8000 pulser.
- Justera nedre fokusering / kondensor mål att öka antalet räknas till dess Högstam. Titta formen på nedre högra bilden i Lancer Control för att säkerställa att den är Gauss i utseende och relativt jämn. Justera integrationstiden igen för ca 8000 räknas.
OBS: Om någon av pixlarna i FT-IR interferogram bild blir vita, minska tids integrationen. - Flytta scenen för att hitta en bit vävnad med struktur, företrädesvis i kanten av en vävnad och perfekt fokus i bilden. Eventuellt ändrar värme och kontrast alternativ för att hjälpa bilda en bild för att förbättra fokus, men kommer att ha någon effekt på IR-data.
- Använda scenen styrspaken, flytta till ett rent område av bilden. Tryck på "Kalibrera" -knappen. Se till att "Out Of Range (OOR) värdet är mindre än 50 och skillnaden mellan" High Flux "och" Low Flux "räknas är minst 4.000 punkter.
- Välj två gånger "OK". I optik flikarna väljer; "Detektor" = "MCT", "Microsklara Detector '=' rätt 'och klicka sedan på "Inställningar". Vid denna punkt kommer det att finnas en FT-IR-interferogrammet på skärmen. Klicka på "Hitta Centerburst". Klicka på "Okej".
- Under fliken "Optik", markera "detektor" = "Ground", "Mikroskop Detector '=' Vänster 'och välj' Inställningar '.
- I Lancer Control - se bilden fortfarande på en ren yta och klicka på "Kalibrera" igen. Klicka på "Okej".
- Nästa, samla in en bakgrund FT-IR-bild för att korrigera för absorbans från atmosfären, systemet och bild. Gå till fliken "Elektronik" och välj en lämplig spektral upplösning, typiskt av 4 cm -1 eller 8 cm -1 för mjukpapper.
- Gå till "Bakgrund" fliken och skriv 128 i "Scans att samarbeta lägga till". Välj "Ny fil ... 'knappen och placera bakgrunden filen i lämplig vikninger. Kontrollera "Imaging" fliken för att säkerställa mosaicing är 1 av 1. Klicka "Bakgrund", vänta på att avsökningen till slut och bekräfta var du vill spara filen. Klicka på en region på bakgrunden FT-IR-bilden och kontrollera spektrumet.
- För att ta en stor mosaik bild av provet, välj fliken "Bilder" och för in numret på X- och Y-ramar för mosaik storlek du vill köpa.
- Klicka på "Inställningar" och i Lancer Kontroll använda levande IR för att hitta det intressanta området. Om du tar en mosaik, centrera levande foder i mitten av området av intresse. Klicka på "Okej". Gå till fliken "Elektronik" och skriv antalet scanningar att samarbeta lägga (typiskt ett värde mellan 2 och 16 skanningar för vävnad). Klicka på "Sök".
- Kontrollera insamlade FT-IR bild på skärmen så att den ser fokuserad. Klicka på bilden för att få upp ett IR-spektrum från den platsen och kontrollera att det ser ut att ha en acceptabel signal-brus. Acquire en synlig bild av provet.
- Spara bilden och exportera den till önskat format, såsom ENVI-IDL.
2. Anpassning en FT-IR Mikroskop för HD Capabilities
OBS: De flesta FT-IR-system är utrustade med ett mål ca 15X förstoring och 0,5 numerisk apertur (NA). Att bild i HD-läge kan en IR-kompatibel 36X eller 74X objektiv användas för att ge diffraktion begränsad bildhanteringsfunktioner.
- Ta systemets 15X mål genom att skruva moturs.
- Skruva i antingen 36X eller 74X objektiv i dess ställe. Rikta målet före användning. Använd lins förlängningsrör för att föra målet tillräckligt nära provet.
- Placera vävnad under det nya målet och fokusera med synligt ljus med antingen kikaren eller Sample Capture-programmet.
OBS: HD-avbildning måste göras i sändningsläge. Den mycket nära arbetsavståndSE mål (1-2 mm) och mycket grunt skärpedjup kräver fokusering långsamt och försiktigt, tar tid att sänka målet utan att röra provet. - Följ instruktionerna 1,6-1,11.
OBS: På grund av att vara betydligt svårare att fokusera och mycket mindre ljus når detektorn, är följande protokoll justeras baserat på 1,14. - I sändningsteknik, klicka på "Raw". Använda scenen styrspaken och titta på live view på FT-IR interferogram bild (överst till höger bild), flytta till vävnaden och fokusera (helst på en kant).
OBS: Det kan vara svårt, därför justera "Värme" och "Kontrast" alternativ för att hjälpa till att bilda en bild för att förbättra fokus (dessa alternativ har ingen effekt på IR-data). - När fokuserad, med hjälp av scenen styrspaken och den levande IR vyn flytta till ett rent område av bilden. Justera integrationstiden till cirka 8000 pulser. Justera nedre fokuserings mål attöka antalet räkningar till sin högsta. Justera integrationstiden igen för ca 8000 räknas.
- Flytta scenen för att hitta en bit vävnad med struktur, företrädesvis i kanten av en vävnad, och perfekt fokus i bilden.
- Om mosaik en bild med hög upplösning, justera scenen för att möjliggöra korrekta rörelser krävs över avstånd för exakt mosaicing. För att ändra avståndsinställningarna scenen, gå till "Inställningar skede" i Lancer Kontroll och justera de horisontella och vertikala inställningar inriktnings att möjliggöra korrekt mosaikteknik.
- Använda scenen styrspak flytta till ett rent område av bilden. Tryck på "Kalibrera" -knappen. Se till Out Of Range (OOR) värde är mindre än 50 för både 36X och 74X mål. Se till att skillnaden mellan den höge Flux och Låg Flux värden är minst 1.000 punkter för 74X objektiv och 2000 räknas för 36X objektiv.
- Fortsätt 1,19-1,27. Antalet skannar i 1,23 och1.25 kommer att behöva justeras på grund av minskad signal till cirka 256 skanningar för bakgrundsbilden och 16-128 söker efter vävnaden bilden.
3. Visualisera och klassificera IR Spectral Dataset
OBS: I detta avsnitt kommer vi att diskutera hur man kan visualisera och extrahera data från spektrala bilder med hjälp av geospatial bildbehandling och analys programvara såsom ENVI + IDL, processen är dock mycket lika för varje alternativ program som MATLAB, fri programvara såsom CytoSpec eller instrument utvecklarens egen programvara. Det finns några olika spektral processtekniker som kan utföras på IR-data.
- Öppna geospatial bildbehandling och analys programvara och ladda IR datafil.
- Applicera en baslinje korrigering algoritm till IR-data genom att välja "Spectral verktyg" och scrolla ner och klicka på "absorbansspektra". Observera en pop-up-menyn och välj "Baseline motsvaction "
OBS: Baseline korrigering kommer att ta bort en baslinje offset lutning från data på grund av spridning - Utför Spectral normalisering, genom proportionerings data till en viss spektraltopp (typiskt Amid I (1650 cm -1) eller amid II (1550 cm -1)) eller området under en definierad region av spektra. Gör detta genom att välja "Normal spektra" under "absorbansspektra" menyalternativ.
OBS: Spectral normalisering utförs så att eventuella skillnader i spektra är verkliga biokemiska skillnader och inte på grund av tjocklek eller densitetsskillnader mellan prover. - Använd en brusreduceringsalgoritm att ta bort brus från spektrumet om nödvändigt 28.
OBS: Det finns flera metoder tillgängliga genom som kan uppnås baslinje korrigering, spektral normalisering och brusreducering, med de flesta program som har automatiserade algoritmer byggnadsår Dessutom finns en framväxande antal metoder som kommer att korrigera för.spektrala avvikelser, som har diskuterats i detalj 29-42; dock inte samhället ännu inte överens om vilken av dem som behövs. - Observera en lista med alla IR frekvenser som samlats i bilden (typiskt av en spektralområdet från 900 till 4.000 cm -1). Klicka på de frekvenser som motsvarar specifika biomolekyler för att observera en bild av vävnaden vid den valda frekvensen.
- Till exempel, klicka på 1650 cm -1 band att observera fördelningen av proteiner i provet. Alternativt klicka på 1080 cm -1 band att observera fördelningen av nukleinsyror i provet. Använd vågtal 1650 cm -1.
- Skapa ytterligare bilder genom att beräkna spektrala topphöjden nyckeltal, toppareaförhållanden etc. som kommer att möjliggöra visualisering av olika biomolekylära komponenter. Klicka på "Spectral Tools och välj sedan antingen" topphöjd Ratios "eller" Beräkna bildområde "för att skapa bilder.
- Skanna den intilliggande vävnadssnitt motsvarande som är färgade med en separat helhet slide imager system som fångar ljusfält bilder. Vid sidan av IR-bilden, ta upp den digitala bilden av färgade vävnaden med en synlig bildprogrammet.
- Högerklicka på bilden på ett område av intresse och välj "Z-profil". Detta kommer att ge den spektrala informationen vid den valda pixel.
- Titta på IR-spektra av flera pixlar från flera klasser, såsom att jämföra celltyper, sjukdomstillstånd. Markera specifika pixlar på bilden med hjälp av "regioner av intresse" (ROI) verktyg. För att utföra detta, högerklicka på bilden och välj "ROI verktyg". Skapa de klasser som ska märkas, till exempel normal, dysplasi och cancer klasser. Välj sedan "ROI typ" - "Point". Välj sedan klassen att välja bildpunkter för och rita på lämpliga pixlar på IR-bilden. Härled genomsnittliga spektra feller var och en av klasserna som använder "Average ROI" verktyg.
- Jämför härlett spektra genom att rita i grafiska program.
Representative Results
FT-IR-avbildning medger härledning av IR-bilder av vävnad som kan ge olika kontraster beroende på IR frekvensen av intresse. Dessutom, i en IR-bild, innefattar varje bildpunkt för hela IR-spektrat, med olika toppar motsvarande olika biomolekyler som kan ge information om de biokemiska egenskaperna hos celltyper eller sjukdomstillstånd (Figur 1). Här har vi visat hur man kan jämföra spektrala signaturer mellan klasserna, men mer avancerad automatiserad klassificering är möjligt med ytterligare algoritmer 3,43-50, såsom Bayesiansk klassificering, Random Forests, Artificiella neuronnät och hierarkiska klusteranalys kan utföras på data. Övervakade klassificeringsmetoder kommer att möjliggöra byggandet av en klassificerare som kan tränas för att möjliggöra automatiserad erkännande av celltyper eller sjukdomstillstånd. Oövervakad klassificerings metoder kan användas för att leta efter naturligt förekommande difnader i vävnader eller celler på grund av biokemisk varians.
FT-IR instrumentering har utvecklats under de senaste decennierna, från mätning i en enda punkt / kartläggning läge med IR ogenomskinliga öppningar till bildläge med Cassegrain mål, med hjälp av antingen en lysande mål i kombination med ett uppsamlings mål i transmissionsläge eller ett enda mål att både tänds och samlar i reflektions-läge (Figur 2). Det har nyligen visat att kunde kopplas uppsamlings mål i sändningsläge för en högre förstoring och numerisk mål bländare för att möjliggöra diffraktionsbegränsad IR imaging, som leder till betydande ökningar av den rumsliga upplösningen av insamlade IR-bilder 4,5. Framstegen inom rumslig upplösning för vävnads avbildning har varit av avgörande betydelse som vi nu kan identifiera celltyper och vävnadsstrukturer, till exempel de funktionella enheter av njuren, glomeruli, Använda anpassad interntFT-IR-system (Figur 3).
HD-FT-IR imaging möjliggör detaljerade bilder av vävnader som skall undersökas för att identifiera onormala regioner och identifiera biokemiska skillnader mellan olika celltyper. I en levervävnad kärna, är det möjligt att visualisera hepatocyter och regioner i infiltrerande fibros som delar två skilda områden av dysplasi och icke-dysplastiska cirros (Figur 4). Vi arbetar för att utnyttja detta för att göra automatiserade diagnostiska verktyg för användning i svåra fall av leversjukdom.
Viktigt kan den ökade rumsliga upplösningen nu möjligt för oss att isolera specifika strukturella särdrag som kan vara kemiskt modifierade genom sjukdom före histologiska förändringar är uppenbara. Till exempel är vi fokuserade på att identifiera biokemiska förändringar i njur glomerulära strukturer såsom Bowmans kapsel, mesangium, glomerulära basalmembranet och tubulär basalmembranet, innan förändringar som identifierats av patologen kan observeras (Figur 5). Framför allt är vi intresserade av att identifiera förändringar i samband med utvecklingen av diabetesnefropati och kronisk avstötning hos transplanterade patienter, där aktuella tekniker misslyckas med att identifiera förändringar i ett tillräckligt tidigt mode för framgångsrik intervention.
Figur 1. FT-IR-bilder och spektrum från en lever kärna. Bild av (A) H & E färgade kärnan från leverbiopsi och bilder av IR absorbans av serie sektion av samma kärna på (B) 3286 cm -1 och (C) 2603 cm -1, som belyste olika strukturella egenskaper. (D) Typisk IR-spektrum av vävnad, med viktiga toppar märkta. Skalstreck = 100 | im.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Optik schemat detailing FT-IR mikroskop funktionslägen. (A) i sändningsläge, är provet belyses genom botten målet, och det ljus som passerar genom provet samlas in av den övre målet. (B) I reflektionsläge, tjänar den översta målet både för att belysa provet och att samla det reflekterade ljuset. Botten målet används inte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Jämförelse av different målen mikroskop på FT-IR-bilder av en njurglomerulus vid 2925 cm -1. (A) 15X samla sakliga med NA = 0,5 (5,5 x 5,5 um pixelstorlek). (B) 36X uppsamlings mål med NA = 0,5 (2,2 x 2,2 um pixelstorlek). (C) 74X samla mål med NA = 0,65 (1,1 x 1,1 um pixelstorlek). Skala bar = 50 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Spekt skillnader mellan fibros och hepatocyter i en lever kärna. (A) H & E färgade kärnan från leverbiopsi. (B) Bild på en serie avsnitt kärna skannas i FT-IR (36X objektiv inställning). (C) Reptant spektra av hepatocyter och fibros, tagen från regioner av vävnad som anges med pilar i (A) och (B). Skala bar = 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Differentiering av njurvävnadsbiopsi funktioner med hjälp av HD-FT-IR avbildning. (A) Perjodsyra-Schiff färgade avsnittet med funktioner som ska extraheras märkas. (B) HD FT-IR bild av CH 2 asymmetriska stretching region (36X objektiv inställning) i en serie sektion av samma vävnad. (C) Funktioner märkt i (A) extraherats med FT-IR bild i (B) för att kunna kemiskt differentiate de fyra funktionerna i vävnaden. Skala bar = 50 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
FT-IR är en framväxande modalitet för etikettfria biokemiska avbildning av vävnadssnitt, med potential att ha en viktig roll för att förbättra den nuvarande standarden för diagnos i patologi. Den nuvarande standarden för patologi kräver vävnader som skall biopsier, fixerades i formalin, inbäddade i paraffin, sektione flera gånger, och färgas med flera fläckar. En högt utbildad patolog måste subjektivt visuellt bedöma vävnadsstruktur och cellulär morfologi för att fastställa en diagnos. Här visar vi hur man samlar högupplösta IR-bilder från samma typ av sektioner och diskutera några av de beräkningsmetoder för att undersöka kemiska skillnader mellan celltyper och sjukdomstillstånd.
De kritiska steg inom detta protokoll är att säkerställa att de vävnader mycket noga fokuserad och att systemet är väl kalibrerad för att säkerställa spektroskopiska data mycket hög kvalitet. Vården vid installation av systemet är särskilt criti cal när man arbetar med höga målsättningar förstoring. För att underlätta felsökning, täcker följande lista några av de potentiella svårigheterna;
Problem: Låg IR intensitet när avbildning i reflektion. Lösning: Kontrollera IR slide orientering som den reflekterande beläggningen kan vara på fel sida av bilden.
Problem: Låg signal / Röd varningsskylt i Lancer Control. Lösning: Cool detektorer med LN2. Flytande kväve krävs för FPA detektorer för att fungera och kräver periodvis vara laddat.
Problem: Velocity fel error / rörelse. Lösning: Återställ spektrometer och minska vibrationer. Vibrationer kommer att orsaka den rörliga spegeln i interferometern att störas.
Problem: Vattenånga spikar i data. Lösning: Öka utrensning på systemet och skydda provet från luften.
Problem: Ogiltig centerburst. Lösning: Hitta centerburst igen.
e_content "> Problem:. Låg flux skillnad i sändning, trots fokuserad Lösning:. Justera botten kondensor Detta kommer att ske när IR ljuset inte fokuseras till en punkt på provet.I denna uppsats har vi fokuserat på hur jag ska få högupplösta IR-bilder av vävnader i antingen sändning eller genomreflektionsläge. Den typ av FT-IR avbildning, är att det finns flera modifieringar som kan göras till datainsamling, till exempel, typ av substrat, bindningsteknik, provtjocklek, spektral upplösning, interferometer spegel hastighet etc. Effekten av dessa parametrar har diskuterats i omfattande detalj nyligen 4,5,17,51.
Det finns ett antal ändringar som kan göras för att avbildningssystemet inklusive avbildning i ATR-läge 10,24,26 och använder nanoskala termiska metoder 52,53 för att möjliggöra för högupplöst IR avbildning. Den största begränsningen med hög upplösning IR avbildning är att tissues måste noggrant förberedda och tunna nog för IR att passera (vanligtvis 4 um tjocklek). Dessutom kräver överföring och reflektans FT-IR-avbildning proverna ska vara torr på grund av absorbansen av IR genom vatten. Emellertid har FT-IR-avbildning betydande fördelar jämfört med andra tekniker, genom att den kan mycket snabbt bild stora områden av vävnad medan härrör rik och detaljerad biokemisk information. Andra liknande tekniker som härrör biokemisk information på en etikett fritt sätt inkluderar Ramanspektroskopi, men tiden för datainsamling är mycket långsammare att få bilder. Nya Raman avbildning växer fram bland stimulerad Ramanspridning (SRS) och sammanhängande Antistokes Ramanspridning (CARS); emellertid har de tillgång begränsat spektralområde eller enda frekvens avbildning.
Framstegen inom hastighet datainsamling, rumslig upplösning, och tillgången på beräkningsmetoder har varit av enormt värde i att göra FT-IR imaging av ett bättre tillvägagångssätt för översättning som ett nytt bild verktyg i patologi. De senaste framstegen inom rumslig upplösning har varit särskilt viktigt för vävnadspatologi pga viktiga celltyper som inte är upplösningen med hjälp av konventionella bildsystem FT-IR. Den senaste uppsats av Reddy et al. visade hur man modellera ett idealiskt system för att få optimal rumsliga upplösningen i en FT-IR bildsystem 5. Exemplet njurvävnad som presenteras i denna uppsats visar på betydelsen av högre rumsliga upplösningar för att utvinna biokemisk information från glomerulära strukturer (Figur 3 och Figur 5). I framtiden nya framsteg inom Quantum Cascade Lasers som mycket ljusa IR ljuskällor 54-57, 3D spektral avbildning 58 och genombrott inom nano IR teknik 52,53,59,60 håller nya spännande vägar för forskning som kan ha enorma konsekvenser i framtiden för vävnads avbildning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
| Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
| Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
| MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
| Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
| Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
| Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
| Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
| Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
| ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
| Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |
References
- Lewis, E. N., et al. Fourier transform spectroscopic imaging using an infrared focal-plane array detector. Anal Chem. 67 (19), 3377-3381 (1995).
- Dorling, K. M., Baker, M. J. Rapid FTIR chemical imaging: highlighting FPA detectors. Trends Biotechnol. 31 (8), 437-438 (2013).
- Fernandez, D. C., Bhargava, R., Hewitt, S. M., Levin, I. W. Infrared spectroscopic imaging for histopathologic recognition. Nat Biotechnol. 23 (4), 469-474 (2005).
- Nasse, M. J., et al. High-resolution Fourier-transform infrared chemical imaging with multiple synchrotron beams. Nat Methods. 8 (5), 413-416 (2011).
- Reddy, R. K., Walsh, M. J., Schulmerich, M. V., Carney, P. S., Bhargava, R.
- Walsh, M. J., Bhargava, R. Chapter 10; Infrared spectroscopic imaging: an integrative approach to pathology. Nanobiophotonics. , McGraw Hill. (2010).
- Walsh, M. J., Reddy, R. K., Bhargava, R. Label-Free Biomedical Imaging With Mid-IR Spectroscopy. Ieee J Sel Top Quant. 18 (4), 1502-1513 (2012).
- Matthaus, C., et al. Chapter 10: Infrared and Raman microscopy in cell biology. Methods Cell Biol. 89, 275-308 (2008).
- Walsh, M. J., et al. IR microspectroscopy: potential applications in cervical cancer screening. Cancer Lett. 246 (1-2), 1-11 (2007).
- Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138 (7), 1940-1951 (2013).
- Sahu, R. K., Mordechai, S. Spectral signatures of colonic malignancies in the mid-infrared region: from basic research to clinical applicability. Future Oncol. 6 (10), 1653-1667 (2010).
- Kendall, C., et al. Vibrational spectroscopy: a clinical tool for cancer diagnostics. Analyst. 134 (6), 1029-1045 (2009).
- Steiner, G., Koch, E. Trends in Fourier transform infrared spectroscopic imaging. Anal Bioanal Chem. 394 (3), 671-678 (2009).
- Biswas, S., Walsh, M. J., Bhargava, R.
- Bhargava, R. Infrared Spectroscopic Imaging: The Next Generation. Appl Spectrosc. 66 (10), 1091-1120 (2012).
- Malek, K., Wood, B. R., Bambery, K. R.
- Martin, F. L., et al. Distinguishing cell types or populations based on the computational analysis of their infrared spectra. Nat Protoc. 5 (11), 1748-1760 (2010).
- Sommer, A. J., Tisinger, L. G., Marcott, C., Story, G. M. Attenuated Total Internal Reflection Infrared Mapping Microspectroscopy Using an Imaging Microscope. Appl Spectrosc. 55 (3), 252-256 (2001).
- Glassford, S. E., Byrne, B., Kazarian, S. G. Recent applications of ATR FTIR spectroscopy and imaging to proteins. Biochim Biophys Acta. 1834 (12), 2849-2858 (2013).
- Andanson, J. M., Chan, K. L., Kazarian, S. G. High-throughput spectroscopic imaging applied to permeation through the skin. Appl Spectrosc. 63 (5), 512-517 (2009).
- Kuimova, M. K., Chan, K. L., Kazarian, S. G. Chemical imaging of live cancer cells in the natural aqueous environment. Appl Spectrosc. 63 (2), 164-171 (2009).
- Chan, K. L., Kazarian, S. G. Attenuated total reflection-Fourier transform infrared imaging of large areas using inverted prism crystals and combining imaging and mapping. Appl Spectrosc. 62 (10), 1095-1101 (2008).
- Gajjar, K., et al. Diagnostic segregation of human brain tumours using Fourier-transform infrared and/or Raman spectroscopy coupled with discriminant analysis. Anal Methods. 5, 89-102 (2012).
- Holton, S. E., Walsh, M. J., Bhargava, R. Subcellular localization of early biochemical transformations in cancer-activated fibroblasts using infrared spectroscopic imaging. Analyst. 136 (14), 2953-2958 (2011).
- Gulley-Stahl, H. J., Bledsoe, S. B., Evan, A. P., Sommer, A. J. The advantages of an attenuated total internal reflection infrared microspectroscopic imaging approach for kidney biopsy analysis. Appl Spectrosc. 64 (1), 15-22 (2010).
- Walsh, M. J., Kajdacsy-Balla, A., Holton, S. E., Bhargava, R. Attenuated total reflectance Fourier-transform infrared spectroscopic imaging for breast histopathology. Vib Spectrosc. 60, 23-28 (1016).
- Investigating the Biochemical Progression of Liver Disease Through Fibrosis, Cirrhosis, Dysplasia and Hepatocellular Carcinoma using Fourier Transform Infrared Spectroscopic Imaging. Sreedhar, H., et al. Biomedical Vibrational Spectroscopy VI: Advances in Research and Industry, , 89390J (2014).
- Reddy, R. K., Bhargava, R. Accurate histopathology from low signal-to-noise ratio spectroscopic imaging data. Analyst. 135 (11), 2818-2825 (2010).
- Bassan, P., et al. The inherent problem of transflection-mode infrared spectroscopic microscopy and the ramifications for biomedical single point and imaging applications. Analyst. 138 (1), 144-157 (2013).
- Bassan, P., et al. FTIR microscopy of biological cells and tissue: data analysis using resonant Mie scattering (RMieS) EMSC algorithm. Analyst. 137 (6), 1370-1377 (2012).
- Bassan, P., et al. Resonant Mie scattering in infrared spectroscopy of biological materials--understanding the 'dispersion artefact'. Analyst. 134 (8), 1586-1593 (2009).
- Bassan, P., et al. RMieS-EMSC correction for infrared spectra of biological cells: extension using full Mie theory and GPU computing. J Biophotonics. 3 (8-9), 609-620 (2010).
- Bassan, P., et al. Resonant Mie scattering (RMieS) correction of infrared spectra from highly scattering biological samples. Analyst. 135 (2), 268-277 (2010).
- Bassan, P., et al. Reflection contributions to the dispersion artefact in FTIR spectra of single biological cells. Analyst. 134 (6), 1171-1175 (2009).
- Davis, B. J., Carney, P. S., Bhargava, R. Theory of mid-infrared absorption microspectroscopy: II. Heterogeneous samples. Anal Chem. 82 (9), 3487-3499 (2010).
- Davis, B. J., Carney, P. S., Bhargava, R. Theory of midinfrared absorption microspectroscopy: I. Homogeneous samples. Anal Chem. 82 (9), 3474-3486 (2010).
- Kohler, A., et al. Estimating and correcting mie scattering in synchrotron-based microscopic fourier transform infrared spectra by extended multiplicative signal correction. Appl Spectrosc. 62 (3), 259-266 (2008).
- Miljkovic, M., Bird, B., Lenau, K., Mazur, A. I., Diem, M. Spectral cytopathology: new aspects of data collection, manipulation and confounding effects. Analyst. 138 (14), 3975-3982 (2013).
- Miljkovic, M., Bird, B., Diem, M. Line shape distortion effects in infrared spectroscopy. Analyst. 137 (17), 3954-3964 (2012).
- Bird, B., Miljkovic, M., Diem, M. Two step resonant Mie scattering correction of infrared micro-spectral data: human lymph node tissue. J Biophotonics. 3 (8-9), 597-608 (2010).
- Mohlenhoff, B., Romeo, M., Diem, M., Wood, B. R. Mie-type scattering and non-Beer-Lambert absorption behavior of human cells in infrared microspectroscopy. Biophys J. 88 (5), 3635-3640 (2005).
- Bambery, K. R., Wood, B. R., McNaughton, D. Resonant Mie scattering (RMieS) correction applied to FTIR images of biological tissue samples. Analyst. 137 (1), 126-132 (2012).
- Kwak, J. T., Reddy, R., Sinha, S., Bhargava, R. Analysis of variance in spectroscopic imaging data from human tissues. Anal Chem. 84 (2), 1063-1069 (2012).
- Trevisan, J., Angelov, P. P., Carmichael, P. L., Scott, A. D., Martin, F. L. Extracting biological information with computational analysis of Fourier-transform infrared (FTIR) biospectroscopy datasets: current practices to future perspectives. Analyst. 137 (14), 3202-3215 (2012).
- Trevisan, J., et al. Measuring similarity and improving stability in biomarker identification methods applied to Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. J Biophotonics. 7 (3-4), 254-265 (2014).
- Bhargava, R., Fernandez, D. C., Hewitt, S. M., Levin, I. W. High throughput assessment of cells and tissues: Bayesian classification of spectral metrics from infrared vibrational spectroscopic imaging data. Biochim Biophys Acta. 1758 (7), 830-845 (2006).
- Menze, B. H., et al. A comparison of random forest and its Gini importance with standard chemometric methods for the feature selection and classification of spectral data. BMC bioinformatics. 10, 213 (2009).
- Kelly, J. G., et al. Biospectroscopy to metabolically profile biomolecular structure: a multistage approach linking computational analysis with biomarkers. J Proteome Res. 10 (4), 1437-1448 (2011).
- Bird, B., et al. Infrared micro-spectral imaging: distinction of tissue types in axillary lymph node histology. BMC Clin Pathol. 8, 8 (2008).
- Baker, M. J., et al. Investigating FTIR based histopathology for the diagnosis of prostate cancer. J Biophotonics. 2 (1-2), 104-113 (2009).
- Baker, M. J., et al. Using Fourier transform IR spectroscopy to analyze biological materials. Nat Protoc. 9 (8), 1771-1791 (2014).
- Katzenmeyer, A. M., Aksyuk, V., Centrone, A. Nanoscale Infrared Spectroscopy: Improving the Spectral Range of the Photothermal Induced Resonance Technique. Anal Chem. 85 (4), 1972-1979 (2013).
- Dazzi, A., et al. AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Appl Spectrosc. 66 (12), 1365-1384 (2012).
- Kole, M. R., Reddy, R. K., Schulmerich, M. V., Gelber, M. K., Bhargava, R. Discrete frequency infrared microspectroscopy and imaging with a tunable quantum cascade laser. Anal Chem. 84 (23), 10366-10372 (2012).
- Vrancic, C., et al. Continuous glucose monitoring by means of mid-infrared transmission laser spectroscopy in vitro. Analyst. 136 (6), 1192-1198 (2011).
- Mid-infrared microspectroscopic imaging with a quantum cascade laser. Yeh, K., Schulmerich, M., Bhargava, R. Next-Generation Spectroscopic Technologies VI, 8726, 87260E (2013).
- Brandstetter, M., Volgger, L., Genner, A., Jungbauer, C., Lendl, B. Direct determination of glucose, lactate and triglycerides in blood serum by a tunable quantum cascade laser-based mid-IR sensor. Appl. Phys. B. 110 (2), 233-239 (2013).
- Martin, M. C., et al. 3D spectral imaging with synchrotron Fourier transform infrared spectro-microtomography. Nat Meth. 10 (9), 861-864 (2013).
- Kwon, B., et al. Infrared microspectroscopy combined with conventional atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 116, 56-61 (2012).
- Marcott, C., et al. Nanoscale infrared (IR) spectroscopy and imaging of structural lipids in human stratum corneum using an atomic force microscope to directly detect absorbed light from a tunable IR laser source. Exp Dermatol. 22 (6), 419-421 (2013).
