We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.
Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.
Kolorektal cancer (CRC) är den 4: e vanligaste orsaken till malignitet i världen 1. Trots de betydande framsteg i vår förståelse av den familjära grund av denna sjukdom, genetiska anlag bidrar endast till ~ 20% av CRC fallen 2. Resten tillskrivs många yttre och miljöfaktorer, däribland kronisk inflammation. Hos människa är uppenbar i ulcerös kolit (UC) patienter, som har en större risk att utveckla kolit associerade tjocktarmscancer (CAC) sambandet mellan kronisk inflammation och tjocktarmscancer, beroende på längd, omfattning och svårighetsgrad av inflammatorisk sjukdom 3 -5. Följaktligen nya terapier är under utveckling för att styra immunsvaret och den tillhörande produktion av tillväxtbefrämjande faktorer genom den inflammatoriska tumörens mikro 6-8. Det finns ett ökande krav för lämpliga prekliniska djurmodeller för att karaktärisera den terapeutiska effekten avdessa läkemedel mot utveckling och progression av sjukdomen.
Musmodeller har entydigt visat att den inflammatoriska mikromiljön bidrar till CRC progression, även i frånvaro av uppenbar inflammation 9,10. Dessa modeller inkluderar användning av polysackarid dextransulfat natrium (DSS), förutsatt i dricksvattnet hos möss, att modellera epitelial skada och akut och kronisk inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) 11,12. Även om den mekanism genom vilken DSS inducerar mucosal skador och kolit är inte helt klarlagda, vissa studier tyder på att DSS hämmar cellulära omvänt transkriptas och ribonukleas verksamhet inom celler, eller främjar bildningen av nano lipidkomplexen som smälter med kolon membranet leder till epitelskada 13,14. Ändringar av standard DSS modellen har också gett betydande insikt i de mekanismer genom vilka kolon epitelceller upprätthålla vävnads homeostas och förordsen mukosala immunsvar 15.
Intraperitoneal administrering av azoximetan (AOM) ensamt eller i kombination med DSS, ger en modell för att undersöka samspelet mellan somatiska mutationer i epitelial slemhinnan och den inflammatoriska och stromal mikromiljö 16,17. AOM är en metabolit av carcinogen 1,2-dimetylhydrazin (DMH) som inte direkt leder till DNA-mutationer. Istället är AOM hydrolyseras för methylazoxymethanol (MAM) av cytokrom isoformen CYP2E1 i levern, där MAM konjugeras med glukuronsyra och sedan transporteras till tarmen genom galla sekret 18. Man tror att den bakteriella β-glukuronidas bidrar till nedbrytningen av MAM vilket resulterar i DNA-alkylering och en ansamling av mutationer i epitelceller 19. De flesta AOM-inducerad colonic tumörer hysa missense mutationer i genen som kodar för β-katenin, vilket gör proteinet resistent mot proteasomal degradatipå, vilket resulterar i avvikande aktivering av den kanoniska Wnt-signalvägen 20. När aktiviteten av AOM kombineras med den mukosala skador som framkallats av DSS, den efterföljande sårläkande respons skapar en mikromiljö som är gynnsamma för tillväxten och expansionen av den mutageniserade epitelet. I en variation av denna modell kan repetitiv administrering av AOM ensam över en period av flera veckor användas för att modellera sporadisk kolorektal cancer, i frånvaro av DSS-inducerad kolit 10,17. Dessa två gratis modeller ger experimentella inställningar för att studera CAC och sporadisk CRC respektive, som båda är förknippade med en pro-inflammatoriska tumörmikromiljö 10.
Användningen av serie endoskopi i möss var uppfunnen av Becker och kollegor 21, och möjliggör longitudinell uppföljning av kolit och tumörprogression. Här ger vi tre pre-kliniska protokoll baserade på DSS-inducerad mucosal skador och / eller AOM-medierad tumor induktion att reproducerbart inducera specifika colonic patologier. Den första protokollet beskriver inducera akut slemhinneskada som svar på DSS administrationen att framkalla många av de histopatologiska egenskaper som förknippas med IBD. Den andra protokollet bygger på tre på varandra följande cykler av DSS administration för att efterlikna de facklor på inflammation som vanligen observerats i IBD-patienter, och kan utföras i samband med AOM-inducerade mutationer. Den slutliga Protokollet är baserat på AOM-inducerad sporadiska epiteliala mutationer. För vart och ett av dessa protokoll, vi expanderar på de relevanta standardprocedurer för att inkludera profylaktiska och terapeutiska interventionsmetoder som vi har utvecklat för att övervaka effektiviteten av nya läkemedel.
De tre protokoll som beskrivs konturmetoder tillförlitligt och reproducerbart induktion av kolon sjukdom patologi i möss. I kombination med rutin endoskopisk övervakning och interventionsstrategier som beskrivs här, kommer dessa protokoll ger kraftfull preklinisk insikt i effekten av läkemedel. Våra laboratorier använder rutinmässigt alla dessa protokoll för att övervaka framgången för nya behandlingar 10,23,24.
Det finns ett antal överväganden när man väljer en preklinisk djurmodell för att testa nya läkemedel. Dessa innefattar relevans av modellen till den humana sjukdomen, och bidraget från tumörens mikromiljö till den föreslagna åtgärden av det terapeutiska målet. Här ger vi tre protokoll för terapeutisk intervention i etablerade tarmsjukdomsmodeller. Dessa modeller är reproducerbara och leverans av reagens för att framkalla sjukdom är lätt att hantera. Viktigt modellerna är mycket relevantatill flera aspekter och stadier av kolit debut, och tumör initiering och progression. Forskare bör ta hänsyn till den genetiska bakgrunden till musstammar användas vid konstruktionen experiment som mottaglighet för sjukdomen induceras av DSS och / eller AOM kan variera avsevärt 25. Dessutom kan olika mikrobiella samhällen har olika kapacitet metaboliska i samband med AOM, som metaboliseras av bakterier. Vi varnar för att använda olika kohorter av möss som är födda i olika djuranläggningar (inklusive kommersiella försäljare) i ett enda experiment. På samma sätt kan de olika mikrofloran hos möss användas från olika anläggningar framkallar olika värd svar på DSS-inducerad epitelbarriär skador 11. Dessutom bör också övervägas lämplig analys av vävnad (t.ex. RNA rening), eftersom förmågan hos DSS att hämma omvänt transkriptas kommer att påverka efterföljande molekylär analys 26,27.
<p class = "jove_content"> Mus endoskopi är en banbrytande teknik för att upprepade gånger övervaka sjukdomsdebut och progression i en individuell mus. Möjligheten att spela in video och extrahera stillbilder tillåter enkel övervakning av parametrar och tumörer flera sjukdomar. Förutom att förbättra djurens välbefinnande, endoskopisk övervakning minskar också behovet av flera kohorter av experimentella möss, som traditionellt har gallrats vid olika tidpunkter för att spåra sjukdomen utfall. Det MEICS poängsystem är inte en ersättning för histopatologisk analys, men ger ett alternativt sätt att övervaka djurens hälsa och mucosal skador i levande möss. Musen endoskopi är ett specialiserat laboratorium teknik, och alla förfaranden bör utföras av utbildad personal för att säkerställa lämplig manipulering och hantering av mössen, samt att ge en jämn kvalitet i bilderna som används för sjukdoms scoring. I händerna på kvalificerad personal, har vi funnit att endoskopi inducerar liten eller ingen skada på Tumors som skulle orsaka intratumoral blödning. För de terapeutiska protokollen beskrivs, anser vi endoskopi mycket fördelaktig, eftersom det är ett sätt att bestämma den initiala tumörbörda, och ger oss möjlighet att gruppera kohorter av djur med liknande tumör bördor före administrering av ett terapeutiskt läkemedel. Sekventiell uppföljning av mössen ger forskarna möjlighet att bestämma effekten av nya terapier tidigt, med möjlighet att avsluta misslyckade försök i tid.Som vår förståelse av inflammatorisk tarmsjukdom och kolorektal cancer förskott, kommer nya mål för terapin identifieras. Lämpliga djurmodeller kommer att vara en integrerad del av att se till att de mest lovande nya terapier flyttas mot kliniska prövningar.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
Vanilla Protein Shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
Isoflourane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
70% Ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
Coloview miniendoscopic system | |||
Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
Fubre Optic Light Cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
Computer and media player software | MAC, imovies | ||
Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |