We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.
Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.
Tykktarmskreft (CRC) er den 4. vanligste årsaken til kreft på verdensbasis en. Til tross for betydelig fremgang i vår forståelse av familiær bakgrunn av denne sykdommen, bidrar genetisk predisposisjon bare til ~ 20% av CRC tilfeller 2. Resten er knyttet til en rekke ytre og miljøfaktorer, inkludert kronisk betennelse. Hos mennesker, koblingen mellom kronisk betennelse og kreft i tykktarmen er tydelig i ulcerøs kolitt (UC) pasienter, som har en større risiko for å utvikle kolitt-assosiert kreft i tykktarmen (CAC), avhengig av varigheten, omfanget og alvorlighetsgraden av den inflammatoriske sykdommer 3 -5. Følgelig nye terapier er under utvikling for å styre immunresponsen og tilhørende produksjon av vekstaktiverende faktorer ved den inflammatoriske tumormikro 6-8. Det er et økende krav til egnede pre-kliniske dyremodeller for å karakterisere den terapeutiske effekt avDisse medikamenter mot utvikling og progresjon av sykdommen.
Musemodeller har entydig vist at den inflammatoriske mikro bidrar til CRC progresjon, selv ved fravær av åpenbar inflammasjon 9,10. Disse modellene omfatter bruk av polysakkaridet dekstran-sulfat-natrium (DSS), anordnet i drikkevannet til mus, for å modellere epitelial skade og akutt og kronisk inflammatorisk tarmsykdom (IBD) 11,12. Selv om mekanismen ved hvilken DSS induserer slimhinneskade og kolitt ikke er helt forstått, noen studier antyder at DSS hemmer cellulære revers transkriptase og ribonuklease-aktivitet i cellene, eller fremmer dannelsen av nano-lipid-komplekser som blandes med colonic membranen fører til epitelskade 13,14. Modifikasjoner på standard DSS modellen har også gitt betydelig innsikt i de mekanismer som colonic epitelceller opprettholde vev homeostase og bestemmelser ogsent slimhinneimmunresponser 15.
Intraperitoneal administrering av Azoxymethane (AOM) alene, eller i kombinasjon med DSS, gir en modell for å undersøke samspillet mellom somatiske mutasjoner i epithelial slimhinne og den inflammatoriske og stromal mikro 16,17. AOM er en metabolitt av kreftfremkallende 1,2-dimetylhydrazin (DMH) som ikke direkte føre til DNA mutasjoner. I stedet er AOM hydrolysert til methylazoxymethanol (MAM) av cytokrom-isoformen CYP2E1 i leveren, hvor MAM er konjugert med glukuronsyre og deretter transporteres til tarmen gjennom galle sekreter 18. Det er antatt at den bakterielle β-glukuronidase bidrar til nedbrytning av MAM som resulterer i DNA-alkylering og akkumulering av mutasjoner i epitelceller 19. De fleste AOM-indusert colonic svulster havn missense mutasjoner i genet som koder for β-catenin, rendering protein motstandsdyktig mot proteasomal degradatipå, noe som resulterer i unormal aktivering av den kanoniske Wnt-signalveien 20. Når aktiviteten av AOM er kombinert med slimhinneskade fremkalt ved DSS, skaper den påfølgende sårheling respons et mikromiljø som fremmer veksten og ekspansjonen av de mutageniserte epitel. I en variasjon av denne modellen, kan repeterende administrering av AOM alene over en periode på flere uker anvendes for å modellere sporadisk kolorektal cancer, i fravær av DSS-indusert kolitt 10,17. Disse to gratis modellene gir eksperimentelle innstillinger for å studere CAC og sporadisk CRC henholdsvis, som begge er knyttet til en pro-inflammatorisk svulstens mikro 10.
Bruken av serieendoskopi i mus ble utviklet av Becker og kolleger 21, og gjør det mulig for langsgående overvåking av kolitt og tumorprogresjon. Her gir vi tre pre-kliniske protokoller basert på DSS-indusert slimhinneskader og / eller AOM-mediert tumor induksjon til reproduserbart indusere spesifikke colonic patologi. Den første protokollen beskriver indusere akutt slimhinneskader i respons til DSS administrasjonen å lokke fram mange av de histopatologiske funksjoner tilknyttet IBD. Den andre protokollen er basert på tre på hverandre følgende sykluser med DSS administrasjon for å etterligne de fakler av inflammasjon som vanligvis observeres i IBD-pasienter, og kan utføres i forbindelse med AOM-induserte mutasjoner. Den endelige protokollen er basert på AOM-induserte epitel-sporadiske mutasjoner. For hver av disse protokollene, vi se nærmere på de relevante standard fremgangsmåter for å inkludere profylaktisk og terapeutisk intervensjon metoder som er utviklet for å overvåke effekten av nye legemidler.
De tre protokoller som er beskrevet skissere metoder for pålitelig og reproduserbar induksjon av colonic sykdom patologi hos mus. Når det kombineres med rutine endoskopisk overvåking og intervensjon strategier skissert her, vil disse protokollene gi kraftig pre-klinisk innsikt i effekten av legemiddelselskap. Våre laboratorier rutinemessig bruke alle disse protokollene for å overvåke suksess for romanen therapeutics 10,23,24.
Det finnes en rekke hensyn når du velger en pre-klinisk dyremodell for å teste ut nye behandlingsformer. Disse inkluderer relevansen av modellen til den humane sykdommen, og bidraget av svulsten mikromiljøet til den foreslåtte virkning av det terapeutiske mål. Her gir vi tre protokoller for terapeutisk intervensjon i etablerte tarmsykdomsmodeller. Disse modellene er reproduserbare og levering av reagenser for å indusere sykdom er enkel å administrere. Viktigere er modellene svært relevanttil flere fasetter og stadier av kolitt utbruddet, og av svulst initiering og progresjon. Forskere bør ta hensyn til genetisk bakgrunn av musestammer som brukes ved utforming av eksperimenter, som mottakelighet for sykdom forårsaket av DSS og / eller AOM kan variere betydelig 25. I tillegg kan ulike mikrobielle samfunn har forskjellige metabolske kapasiteter i forbindelse med AOM, som blir metabolisert av bakterier. Vi advarer mot å bruke ulike årskull av mus som ble født inn i forskjellige dyre fasiliteter (inkludert kommersielle leverandører) i et enkelt eksperiment. Tilsvarende kan de forskjellige mikrofloraen hos mus som brukes mellom ulike fasiliteter lokke fram ulike vertsresponser til DSS-indusert epitelial barriere skade 11. Videre bør den aktuelle analyse av vev (for eksempel RNA-rensing) også tas i betraktning, siden evnen til DSS til å inhibere revers transkriptase vil påvirke etterfølgende molekylære analyser 26,27.
<p class = "jove_content"> Mus endoskopi er en cutting edge teknikk for å gjentatte ganger overvåke sykdomsutbruddet og progresjon i en individuell mus. Muligheten til å spille inn videoer og ta ut bilder tillater enkel overvåking av flere sykdomsparametre og svulster. I tillegg til å bedre dyrevelferden, endoskopisk overvåking reduserer også behovet for flere årskull av eksperimentelle mus, som tradisjonelt ble hentet på forskjellige tidspunkter for å spore sykdom utfallet. Den MEICS scoring system er ikke en erstatning for histopatologiske analyse, men gir en alternativ måte å overvåke dyrehelse og slimhinneskader i levende mus. Mus endoskopi er et spesialisert laboratorium teknikk, og alle prosedyrer skal utføres av kvalifisert personell for å sikre hensiktsmessig manipulasjon og håndtering av mus, samt å gi konsistent kvalitet i bildene som brukes for sykdom scoring. I hendene på kvalifisert personlig, har vi funnet ut at endoskopi induserer liten eller ingen skade på Tumors som ville føre til intra-tumor blødning. For de terapeutiske protokoller skissert, vi vurdere endoskopi svært fordelaktig, siden det gir en måte å bestemme starttumorbyrde, og gir oss mulighet til å gruppere årskull av dyr med lignende tumorbelastninger før administrasjon av en terapeutisk legemiddel. Sekvensiell overvåking av musene gjør forskerne å fastslå effekten av nye behandlingsformer tidlig, med mulighet for å avslutte mislykkede forsøk på en riktig måte.Som vår forståelse av inflammatorisk tarmsykdom og kolorektal kreft forhånd, vil nye mål for terapi bli identifisert. Egnede dyremodeller vil være integrert til å sikre at de mest lovende nye behandlingsformer blir flyttet mot kliniske studier.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
Vanilla Protein Shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
Isoflourane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
70% Ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
Coloview miniendoscopic system | |||
Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
Fubre Optic Light Cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
Computer and media player software | MAC, imovies | ||
Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |