Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.
Амид водород / дейтерий обмен (ssHDX-MS) и боковой цепью фотолитический маркировка (SSPL-MS), а затем с помощью масс-спектрометрического анализа могут быть полезны для характеристики лиофилизированные составы белков терапии. Маркировка с последующим подходящего протеолитического расщепления позволяет структура белка и взаимодействия должен быть отображен с разрешением пептида уровня. Поскольку белка структурные элементы стабилизируются сети химических связей из главных цепей и боковых цепей аминокислот, определенной маркировки атомов в аминокислотных остатков дает представление о структуре и конформации белка. В отличие от обычных методов, используемых для изучения белков в лиофилизированных твердых веществ (например, ИК-Фурье), ssHDX-MS и SSPL-MS предоставления количественной и сайт-специфической информации. Степень дейтерия включения и кинетических параметров может быть связано с быстро и медленно обмена амидных бассейна (N быстро, медленно Н) и непосредственно отражает градРЗЭ складывания белка и структуры в лиофилизированных композиций. Стабильный фотолитический маркировка не пройти бэк-обмен, преимущество над ssHDX-МС. Здесь мы предоставляем подробные протоколы как для ssHDX-МС и SSPL-МС, с использованием миоглобина (Мб) в качестве модели белка в лиофилизированных препаратов, содержащих либо трегалозу или сорбит.
Белковые препараты быстро растущим сектором биофармацевтической промышленности и предлагают новые перспективные методы лечения ранее неразрешимых заболеваний, в том числе гормональных расстройств, рака и аутоиммунных заболеваний 1. В 2012 году мировой рынок биотерапевтических достиг $ 138 млрд, а как ожидается, достигнет $ 179 млрд к году 2018 2. Белки являются крупные и более хрупкими, чем обычные низкомолекулярные лекарственные и поэтому они более восприимчивы ко многим видам деградации 3. Для обеспечения надлежащего срока годности и стабильности, белковые препараты часто изготавливают в виде лиофилизированных (то есть, лиофилизированная) твердых порошков. Тем не менее, белок может все еще испытывают деградации в твердом состоянии, в частности, если его нативная структура не сохраняется в процессе лиофилизации 4,5. Заверив, что структура была сохранена возможна только при наличии аналитические методы, которые можно исследовать конформацию белка в твердом состоянии с sufficienРазрешение т.
ЯМР-спектроскопия 6 и рентгеновской кристаллографии 7 являются широко используемые методы высокого разрешения для оценки структуры белка в растворе и кристаллических твердых тел 8. Из-за природы наполнителей и методов обработки, используемых, лиофилизированные композиции, как правило, белковые аморфного, а не кристаллического 9. Отсутствие однородности и микроскопической того делает вышеуказанные методы непрактичными для белков в аморфных твердых телах. Инфракрасной Фурье-спектроскопии (FTIR) 10, спектроскопия комбинационного рассеяния 11 и ближней инфракрасной спектроскопии (NIR) 12 регулярно используется биофармацевтической промышленности для сравнения вторичной структуры белка в лиофилизированных порошков, которые нативного раствора состояния структуры. Тем не менее, эти методы низкое разрешение и может только предоставить информацию о глобальных изменениях в вторичной структуры. Твердотельный структурная характеристика с помощью фурьепоказал, либо слабый 13,14 или плохое 15 корреляцию с долгосрочной стабильности хранения. Эти ограничения подчеркивают необходимость для подходящих методов высокого разрешения для определения структуры белка возмущения в твердом состоянии.
Химическая маркировка в сочетании с протеолиза и массового спектрометрического анализа стала мощным подход к мониторингу структуру белка и молекулярных взаимодействий в водном растворе. В фармацевтической разработки, HDX-MS был использован для картирования эпитопов в антиген-антитело взаимодействий 16,17, на карту рецепторных взаимодействий с наркотиками 18, чтобы контролировать эффекты пост-трансляционных модификаций на конформацию белковых препаратов 19, и сравнить от партии к партии вариации в разработке биоподобий 20. Аналогичным образом, Фотоактивируемые лиганды были использованы для выявления лекарственных целей и для определения аффинности связывания и специфичности препарат-рецептор взаимодействий 21,22. Для электроннойXtend применение этих методов к лиофилизированных композиций, наша группа разработала твердотельный дейтерия обмена водорода масс-спектрометрии (ssHDX-MS) и твердотельных фотолитический маркировка масс-спектрометрии (SSPL-MS) для изучения конформации белков и наполнителя взаимодействия в лиофилизированных образцов с высоким разрешением.
В обоих ssHDX-МС и SSPL-MS, белок помечен при идеальных условиях реакции в лиофилизированных твердых веществ, и образцы затем восстановлен и анализировали с помощью масс-спектрометрии с использованием или без протеолитического расщепления. ssHDX-MS предоставляет информацию на главной экспозиции цепи на дейтерия пара, в то время как SSPL-MS обеспечивает информацию об окружающей среде боковых цепей (рис 1). Эти два метода, таким образом, может обеспечить дополнительную информацию о конформации белка в твердом состоянии. Здесь мы предоставляем общую протокол для изучения белков в лиофилизированных веществ с помощью ssHDX-МС и SSPL-МС (рис 2), используя Мбайт,модель белка. Мы покажем, способность этих двух методов выявить различия в составах с двумя различными наполнителями.
Рисунок 1:. Структура мера белок ssHDX и SSPL в лиофилизированных твердых посредством различных механизмов маркировки () В HDX, основой амид водороды обмен с дейтерием в зависимости от структуры белка и D 2 O доступности. В твердом состоянии, скорость и степень дейтерообмена зависит от уровня сорбции D 2 O, мобильность белка (разворачивающейся и рефолдинга события) и природы наполнителей, присутствующих в твердой матрице. (Б) В PL, УФ-облучение при 365 нм инициирует образование реакционноспособного промежуточного карбена с diazirine функциональной группой pLeu и вставляется неспецифически в любой XH связи (Х = любой атом), или объявлениемДед через связи С = С в непосредственной близости. В твердом состоянии, скорость и степень маркировки зависит от локальной концентрации маркировки агента, время облучения, структуры белка и природы наполнителей, присутствующих в твердой матрице. Панели А и В показывают максимальную теоретическую маркировки, которые могут возникнуть на позвоночнике и боковых цепей, соответственно, в белка.
Рисунок 2: Схематическое изображение твердотельной HDX-МС (А) и PL-МС (В) для белка в лиофилизированной композиции.
Несколько исследований показали, что локальное окружение в лиофилизированных образцов влияет деградацию белков 5,29,30. Однако установление прямой связи между структурой белка и стабильности в твердом состоянии не представляется возможным из-за отсутствия аналитических методов высокого разрешения. Применение существующих высоких методов разрешения, например, HDX и ФЛ лиофилизированных порошков требует модификации протоколов решений и осторожной интерпретации данных. HDX-MS и PL-MS были последовательно приняты для мониторинга конформации белков в твердом состоянии. Результаты, представленные здесь и в других местах 27,28,31-33 продемонстрировали способность этих методов для контроля конформацию белка с высоким разрешением в твердом окружающей среды. Хотя важные шаги в анализе данных не меняются от маркировки в растворе 34-36, важные соображения во время экспериментальной установки и интерпретации данных, необходимых для твердотельных химикокал маркировка.
Выбор маркировки реагента должно быть основано на размере и механизма маркировки. Небольшой размер позволяет дейтерия пептидный скелет, чтобы быть проверены легко, в то время как относительно больший размер pLeu ограничивает маркировку на боковых цепей. Как ssHDX и SSPL не показывают предпочтение какой-либо аминокислоте, так, чтобы маркировки зависит только от позвоночника и боковой цепи воздействия матрицы. Для эффективного исследовать конформации белков в твердом состоянии, внешние факторы, влияющие на процесс маркировки должны быть тщательно контролируется. Общее количество и пространственное распределение маркировки агентом в лиофилизированных твердых отличается от водных растворов.
В ssHDX, количество D 2 O в твердой матрице может повлиять на скорость разворачивания белка (или частичный разворачивается), повторной укладки и дейтерообмена. Это не так с раствором HDX, в котором образец белка, как правило, разбавленного с обильным объемом D 2 O.Тщательное обследование эффектов гидратации на скорость ssHDX можете сообщить выбора идеальных условиях РЗ. Для контроля скорости сорбции влаги и избежать коллапса порошка в композициях, содержащих гигроскопические наполнители (например, сахарозу и трегалозу), ssHDX можно проводить в условиях охлаждения (2-8 ° С). Наш предыдущий исследование эффектов гидратации показали увеличение скорости и степени обмена с увеличением содержания влаги, как и ожидалось. В большей части нашей работы, промежуточный относительная влажность 43% при 5 ° С оказалась идеальным различать формулировки в разумные сроки 24. Реакцию обычно проводят до тех пор, не будет достигнуто плато. Это гарантирует, что сорбция влаги и диффузия в твердой не контролировать скорость HDX. Использование малых твердых размеров выборки с объемом до лиофилизации ≤2 мл также помогает гарантировать, что сорбция паров D 2 O является практически полное начале периода обмена. Хотя ssHDX-MS обеспечиваетколичественная информация о конформации белка в твердом состоянии, есть определенные условия, в которых интерпретация данных не может быть полностью основанные на изучении ssHDX в одиночку. Вполне возможно, что уменьшилось поглощения дейтерия наблюдалось в образце (по сравнению с контролем) может быть связано с более высокой удержания структуры белка или значительного количества белковых агрегатов, присутствующих в образце. В таком случае интерпретация данных ssHDX требуется результаты других дополнительных методов. Уширение пика в дейтерированном масс-спектров наблюдается в течение нескольких Мбит формулировок 27,28. Это может быть из-за различных факторов, таких как наличие частично развернутом населения белка, пространственной неоднородности в образце или пространственных градиентов концентрации D 2 O. Тем не менее, эти факторы не были выделены в ssHDX-МС и нуждается в дальнейшем исследовании.
Как SSPL-MS является относительно новым по сравнению с другими методами, непрерывного обучения абиз ее приложений и ограничений не требуется. В SSPL, фото-сшивающий агент подвергают лиофилизации с белком. Отсутствие влаги ограничивает подвижность компонентов в матрице твердого вещества, а парциальное структурной релаксации, что может произойти с сорбции влаги в ssHDX не явление в SSPL. Это ограничивает маркировки в SSPL в непосредственной близости от фото-сшивающий агент. Тем не менее, в отличие от HDX-MS, MS / MS анализа ковалентно меченого белка может обеспечить структурную информацию Остаток уровне. С SSPL маркировка ковалентной и необратимым, обратно обмен не происходит и образцы могут быть подготовлены и проанализированы, не заботясь о потере этикетке. Для облегчения распространения маркировки агента и повысить эффективность маркировки в твердой матрицы, SSPL могут быть выполнены с увеличением% относительной влажности. Поглощение pLeu также может быть улучшена за счет повышени концентрации фотореакционноспособного агента. Молярное отношение белка к pLeu можно варьировать по желанию. В общем, 100x мол рный избыток pLeu чтобы пробелок позволит обеспечить адекватное маркировки. Тем не менее, высокая концентрация pLeu может привести к потере белка третичной структуры в твердой матрице. Таким образом, в дополнение к маркировке кинетики и разработки состава, выбор концентрации pLeu также должны быть основаны на поддержание белка структурной целостности. Как pLeu неизбирательно этикетки XH (где X = C, N, O) группа, возможно, что наполнители с аналогичных сайтов маркировки может значительно влиять на уровень маркировки белка. Вмешательство наполнителей в наличии pLeu для маркировки белка еще можно охарактеризовать. Известно, что карбеновый полученные от активации diazirine не остатка конкретных Однако одно исследование сообщает уклон в сторону Asp и Glu 36. В то время как это хорошо, чтобы узнать о взаимодействии конкретных остатков, пептида уровня информация также полезны и могут быть использованы для создания наполнители блокировать участки с высокой экспозицией матрицы в твердом состоянии. SSPL-MS предоставляет подробную качественную информацию, однаконуждается количественные данные, которые будут получены и надежные показатели должны быть разработаны для анализа рецептур различия между различными лиофилизированных систем.
Использование метки конкретных остатков в сочетании с анализом МС / МС может еще больше повысить разрешение на уровне аминокислотной. Маркировка реагенты, такие как 2,3-бутандион маркировать Arg, N производные -hydroxysuccinimide для Lys и N производных -alkylmaleimide для Cys может быть использован для точного отображения молекулярные взаимодействия в лиофилизированного порошка. Однако эти реагенты являются рН-зависимые и реакции могут быть не столь хорошо контролироваться фотолитического маркировки в твердом состоянии. Альтернативный подход состоит во введении фотографию-сшивающий агент в последовательности белка с использованием ауксотрофных клеточных линий, сайт-направленный мутагенез или боковой цепи производных.
Наши предыдущие исследования ssHDX-МС и SSPL-МС показали, что маркировка белка зависит от природы и количества вспомогательных веществиспользовать 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-МС Мб совместно лиофилизованы гуанидингидрохлорида (Gdn.HCl) показали более широкого внедрения дейтерия, чем Мб совместно лиофилизованы с низким молекулярным весом сахара 32. В отдельном исследовании SSPL-MS, Мб совместно лиофилизованы Gdn.HCl показали большую защиту от фотолитического маркировки, чем Мб с сахарозой 33. Кроме того, количественные измерения от ssHDX-MS были тесно связаны со стабильностью протеина при длительном хранении 28. Эти исследования показали, что ssHDX или SSPL белка отражает степень структурной удержания белка в лиофилизированного порошка. Мы считаем, что сохранение вторичной структуры в лиофилизированных порошков обеспечивает благоприятную среду для боковой цепи маркировки с pLeu и защиты амидного водорода из дейтерообмена. Тем не менее, детальное сравнение информационного контента из этих методов должна быть выполнена в будущем. Хотя создание полезность ssHDX-МС и SSPL-МСв виде препарата скрининга в конечном итоге потребует, чтобы он был применен ко многим белков, результаты наших недавних исследований поддерживает ее широкому внедрению. При дальнейшем развитии эти методы как ожидается, будет широко полезным для характеристики белковыми составами твердотельные в биофармацевтической промышленности.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equine myoglobin | Sigma-Aldrich | M0630-5G | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma Aldrich | #T9531 | |
D-Sorbitol | Sigma Aldrich | #240850 | |
L-Photo-leucine | Thermo Scientific | #22610 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | #P0662 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | #P3786 | |
Deuterium Oxide | Cambridge Isotope Laboratories | #DLM-4-PK | Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich) |
Immobilized pepsin | Applied Biosystems | #2-3132-00 | |
Trypsin | Promega | #V511A | Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used |
Water, Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | #7732-18-5 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | #34998 | |
Formic acid | Thermo Scientific | #28905 | |
ESI-TOF Calibrant | Agilent Technologies | #G1969-85000 | Highly flammable liquid |
Protein microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25108/03 | |
Peptide microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25109/02 | |
Analytical column | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | |
Freeze dryer | VirTis AdVantage Plus | ||
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps | Stratagene Corp. | Stratalinker 2400 | |
HPLC | Agilent Technologies | 1200 series LC | Refrigerated LC system for HDX-MS |
ESI-qTOF MS | Agilent Technologies | 6520 qTOF | |
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) | Sierra Analytics | http://www.massspec.com/HDExaminer.html |