Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.
Amid brint / deuterium udveksling (ssHDX-MS) og side-kæde fotolytisk mærkning (SSPL-MS) efterfulgt af massespektrometrisk analyse kan være værdifulde til at karakterisere frysetørrede formuleringer af terapeutiske proteiner. Mærkning efterfulgt af passende proteolytisk fordøjelse giver proteinstruktur og interaktioner skal kortlægges med peptid-niveau opløsning. Da proteinet strukturelle elementer er stabiliseret af et netværk af kemiske bindinger fra de vigtigste-kæder og sidekæder af aminosyrer, specifik mærkning af atomer i aminosyreresterne giver indsigt i struktur og konformation af proteinet. I modsætning til rutinemæssige metoder, der anvendes til at studere proteiner i frysetørrede faste stoffer (f.eks FTIR), ssHDX-MS og SSPL-MS give kvantitative og site-specifikke oplysninger. Omfanget af deuterium inkorporering og kinetiske parametre kan relateres til hurtigt og langsomt udveksle amid pools (N hurtigt, N langsom) og direkte afspejler de degree proteinfoldning og struktur i lyofiliserede formuleringer. Stabil fotolytisk mærkning ikke undergår back-udveksling, en fordel over ssHDX-MS. Her giver vi detaljerede protokoller for både ssHDX-MS og SSPL-MS, ved hjælp af myoglobin (Mb) som model protein i frysetørrede formuleringer, der indeholder enten trehalose eller sorbitol.
Protein narkotika er den hurtigst voksende sektor i den biofarmaceutiske industri og tilbyde lovende nye behandlinger for tidligere komplicerede sygdomme, herunder hormonelle forstyrrelser, kræft og autoimmune sygdomme 1. I 2012 det globale bioterapeutiske marked nåede 138 milliarder dollar, og forventes at nå 179 milliarder dollaren i år 2018 2. Proteiner er større og mere skrøbelig end konventionelle småmolekylelægemidler og så er mere modtagelige for mange typer af nedbrydning 3. For at sikre tilstrækkelig holdbarhed og stabilitet, er proteinlægemidler ofte formuleret som frysetørret (dvs. frysetørret) faste pulvere. Dog kan en protein stadig undergå nedbrydning i fast form, især hvis dens native struktur ikke bevares under lyofiliseringsprocessen 4,5. Sikre, at strukturen er blevet bibeholdt kun er muligt, hvis der er analysemetoder, kan sonde protein konformation i fast tilstand med sufficient opløsning.
NMR-spektroskopi 6 og røntgenkrystallografi 7 er de almindeligt anvendte højopløselige metoder til at vurdere proteinstruktur i opløsning, og krystallinske faste stoffer 8. På grund af karakteren af hjælpestoffer og de forarbejdningsmetoder, der anvendes, frysetørrede formuleringer protein er normalt amorfe snarere end krystallinsk 9. Den manglende homogenitet og mikroskopisk orden gør de ovennævnte teknikker upraktisk for proteiner i amorfe faste stoffer. Fourier transformation infrarød spektroskopi (FTIR) 10, Raman spektroskopi 11 og nær infrarød spektroskopi (NIR) 12 regelmæssigt er blevet anvendt af den biofarmaceutiske industri at sammenligne sekundær proteinstruktur i lyofiliserede pulvere til det native opløsning-state struktur. Men disse metoder er lav opløsning og kan kun give oplysninger om de globale ændringer i sekundær struktur. Solid-state strukturel karakterisering ved hjælp af FTIRhar vist enten svag 13,14 eller dårlig 15 korrelation med langtidsopbevaring stabilitet. Disse begrænsninger fremhæver behovet for egnede metoder højopløselige at identificere protein strukturelle forstyrrelser i solid-state.
Kemisk mærkning kombineret med proteolyse og massespektrometrisk analyse har vist sig som en stærk tilgang til overvågning proteinstruktur og molekylære interaktioner i vandig opløsning. I farmaceutisk udvikling, har HDX-MS blevet anvendt til epitopkortlægning i antigen-antistof-interaktioner 16,17, til kort receptor-interaktioner 18, at overvåge virkningerne af post-translationelle modifikationer på konformationen af proteinlægemidler 19 og sammenligne batch-til-batch variation i udviklingen af biosimilars 20. Tilsvarende har fotoaktiverbare ligander blevet anvendt til at identificere lægemiddelvirkninger og at bestemme bindingsaffinitet og specificitet af lægemiddel-receptor-vekselvirkninger 21,22. Til eXtend anvendelsen af disse metoder til frysetørrede formuleringer, har vores gruppe udviklet solid-state brint deuterium udveksling massespektrometri (ssHDX-MS) og solid-state fotolytisk mærkning massespektrometri (SSPL-MS) til at studere protein konformationer og hjælpestoffer interaktioner i frysetørrede prøver med høj opløsning.
I både ssHDX-MS og SSPL-MS proteinet mærkes under ideelle reaktionsbetingelser i lyofiliserede faststoffer og prøverne blev derefter rekonstitueret og analyseres ved massespektrometri med eller uden proteolytisk fordøjelse. ssHDX-MS giver oplysninger om primære kæde udsættelse for deuterium dampe, mens SSPL-MS giver oplysninger om miljøet i sidekæder (figur 1). De to metoder kan derfor giver supplerende oplysninger om protein konformation i fast tilstand. Her giver vi en generel protokol for at studere proteiner i frysetørrede faste stoffer ved hjælp ssHDX-MS og SSPL-MS (figur 2), ved hjælp af Mb somen model protein. Vi viser evnen af de to metoder til at skelne forskelle i formuleringer med to forskellige excipienser.
Figur 1:. SsHDX og SSPL foranstaltning proteinstruktur i lyofiliserede faststoffer gennem forskellige mærkning mekanismer (A) i HDX, rygraden amide hydrogener udveksling med deuterium som en funktion af protein struktur og D2O tilgængelighed. I solid-state, hastigheden og omfanget af deuterium udveksling afhænge af niveauet af D 2 O sorption, protein mobilitet (udfoldning og genfoldning hændelser), og arten af hjælpestofferne til stede i den faste matrix. (B) I PL, UV-bestråling ved 365 nm initierer dannelsen af et reaktivt carben mellemprodukt fra diazirine funktionelle gruppe pLeu og indsættes ikke-specifikt i nogen XH obligation (X = enhver atom), eller added over en C = C binding i dens umiddelbare nærhed. I fast tilstand, hastigheden og omfanget af mærkning afhænge af den lokale koncentration af mærkningsmiddel, bestrålingstid, protein struktur og arten af excipienser til stede i den faste matrix. Paneler A og B viser den maksimale teoretiske mærkning, som kan opstå på rygraden og sidekæder henholdsvis protein.
Figur 2: Skematisk viser solid-state HDX-MS (A) og PL-MS (B) for protein i lyofiliseret formulering.
Flere undersøgelser har antydet, at det lokale miljø i frysetørrede prøver påvirker proteinnedbrydning 5,29,30. Men om et direkte forhold mellem proteinstruktur og stabilitet i fast tilstand har ikke været muligt på grund af mangel på høj opløsning analysemetoder. Anvendelsen af de eksisterende høje metoder opløsning såsom HDX og PL til frysetørrede pulvere kræver en ændring af opløsning protokoller og omhyggelig data fortolkning. HDX-MS og PL-MS er blevet successivt vedtaget at overvåge protein konformationer i solid-state. Resultaterne præsenteret her og andre steder 27,28,31-33 har demonstreret evnen af disse metoder til at overvåge protein konformation med høj opløsning i fast miljø. Selvom de kritiske trin i dataanalyse ikke varierer fra mærkning i opløsning 34-36, er vigtige overvejelser i løbet forsøgsopstilling og data fortolkning nødvendig for solid-state kemical mærkning.
Udvælgelse af mærkningsreagenset skal være baseret på størrelse og mekanisme for mærkning. Den lille størrelse af deuterium tillader peptidskelettet at probes let, mens den relativt større størrelse af pLeu begrænser mærkning sidekæderne. Både ssHDX og SSPL viser ingen præference for en aminosyre, således at mærkningen kun afhænger rygrad og sidekæde-eksponering til matrixen. For effektivt at undersøge protein konformationer i solid-state, skal de eksterne faktorer, der påvirker mærkningsprocessen styres omhyggeligt. Det samlede beløb og den rumlige fordeling af mærkning middel i lyofiliserede faststoffer er forskellig fra vandige opløsninger.
I ssHDX, kan mængden af D2O i den faste matrix påvirke hastigheden af protein udfoldning (eller delvis udfoldning), genfoldning og deuterium udveksling. Dette er ikke tilfældet med opløsning HDX, hvor proteinet prøven normalt fortyndes med en rigelig mængde af D 2 O.Omhyggelig screening af virkningerne af hydrering på ssHDX sats kan informere udvælgelsen af ideelle RH. For at styre hastigheden af fugtsorption og undgå kollaps af pulveret i formuleringer, der indeholder hygroskopiske hjælpestoffer (f.eks saccharose og trehalose), kan ssHDX udføres under nedkølede forhold (2-8 ° C). Vores tidligere undersøgelse om hydrering effekter viste øget hastigheden og omfanget af udvekslingen med øget fugtindhold, som forventet. I store dele af vores arbejde, en mellemliggende RH på 43% ved 5 ° C har vist sig at være ideel til at skelne mellem formuleringer i en rimelig frist 24. Reaktionen udføres sædvanligvis indtil et plateau er nået. Dette sikrer, at fugtsorption og diffusion i det faste stof ikke kontrollerer HDX sats. Brugen af små faste stikprøvestørrelser med præ-frysetørring volumen på ≤2 ml også med til at sikre, at D2O damp sorption er væsentlige fuldstændig tidligt i udvekslingen periode. Selvom ssHDX-MS giverkvantitative oplysninger om konformation af protein i solid-state, er der visse forhold, hvor fortolkning af data kan ikke udelukkende baseret på ssHDX undersøgelsen alene. Det er muligt, at den mindskede deuterium optagelse observeret i en prøve (sammenlignet med kontrol) kan skyldes den større tilbageholdelse af proteinstruktur eller betydelig mængde af proteinaggregater til stede i prøven. I så fald fortolkning af ssHDX data kræver resultater fra andre supplerende metoder. Topforbredning i deutereret massespektre blev observeret for flere Mb formuleringer 27,28. Dette kan skyldes forskellige faktorer, som tilstedeværelsen af delvist udfoldet protein befolkning, rumlig uensartethed i prøven, eller de rumlige gradienter i D2O koncentration. Imidlertid blev disse faktorer ikke skelnes i ssHDX-MS og kræver yderligere undersøgelse.
Som SSPL-MS er relativt nyt i forhold til andre metoder, løbende læring absine applikationer og begrænsninger er påkrævet. I SSPL er foto-cross-linker frysetørret med proteinet. Den mangel på fugt begrænser mobiliteten af komponenter inden den faste matrix, og den delvise strukturelle afslapning, der kan forekomme med fugtsorption i ssHDX er ikke et fænomen i SSPL. Dette begrænser mærkning SSPL til umiddelbar nærhed af foto-cross-linker. Men i modsætning HDX-MS, MS / MS-analyse af det kovalent mærkede protein kan give rester niveau strukturel information. Da SSPL mærkning er kovalent og irreversibel, ryg udveksling ikke forekommer, og prøver kan fremstilles og analyseres uden bekymring for tab af etiket. For at lette diffusion af mærkning middel og forbedre mærkningen effektivitet i fast matrix, kan SSPL udføres med stigende% RH. pLeu optagelse kan også forbedres ved at øge koncentrationen af fotoreaktive middel. Det molære forhold af protein til pLeu kan varieres som ønsket. I almindelighed er en 100x molært overskud af pLeu til proTEIN vil sikre tilstrækkelig mærkning. Imidlertid kan høje pLeu koncentration resultere i tab af protein tertiær struktur i den faste matrix. Derfor Udover mærkning kinetik og formulering sammensætning, udvælgelse af pLeu koncentration skal også være baseret på at bevare protein strukturelle integritet. Som pLeu ikke-selektivt etiketter XH (hvor X = C, N, O) gruppe, er det muligt, at hjælpestoffer med lignende mærkning sites kan i høj grad påvirke niveauet af protein mærkning. Indgrebet over hjælpestoffer i tilgængeligheden af pLeu for protein mærkning er endnu ikke karakteriseret. Det er kendt, at carben genereret fra diazirine aktivering ikke er rest-specifikke, men en undersøgelse rapporterer bias mod Asp og Glu 36. Selv om det er godt at lære ca. rest-specifikke interaktioner, peptid-niveau information er også nyttige og kan anvendes til at designe excipienser til at blokere områder med høj matrix eksponering i fast tilstand. SSPL-MS indeholder detaljerede kvalitative oplysninger, menkvantitative data skal indhentes og robuste målinger skal udvikles til at analysere formulering forskelle på tværs af en bred vifte af frysetørrede systemer.
Anvendelsen af en rest-specifik etiket kombineret med MS / MS-analyse kan yderligere øge beslutning til aminosyre plan. Mærkningsreagenser såsom 2,3-butandion at mærke Arg, kan N-hydroxysuccinimid derivater for Lys og N -alkylmaleimide derivater for Cys bruges til præcist at kortlægge molekylære interaktioner i lyofiliseret pulver. Men disse reagenser er pH-afhængig, og reaktionerne kan ikke være så velkontrolleret som fotolytisk mærkning i solid-state. En alternativ fremgangsmåde er at inkorporere foto-tværbinder i proteinsekvensen med brugen af auxotrofe cellelinjer, steddirigeret mutagenese eller sidekæde derivatisering.
Vores tidligere ssHDX-MS og SSPL-MS undersøgelser har vist, at mærkning af protein afhænger af arten og mængden af hjælpestofferbrugt 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS af Mb co-frysetørret med guanidinhydrochlorid (Gdn.HCl) viste større deuterium optagelse end Mb co-frysetørret med lav molekylær vægt sukkerarter 32. I en separat SSPL-MS undersøgelse Mb co-frysetørret med Gdn.HCl viste større beskyttelse fra fotolytisk mærkning end Mb med saccharose 33. Endvidere er kvantitative målinger fra ssHDX-MS er højt korreleret med stabiliteten af protein under langvarig lagring 28. Disse undersøgelser tyder på, at ssHDX eller SSPL protein afspejler omfanget af strukturelle tilbageholdelse af proteinet i lyofiliseret pulver. Vi mener, at tilbageholdelsen af sekundær struktur i frysetørrede pulvere giver gunstigt miljø for sidekæde mærkning med pLeu og beskyttelse af amid brint fra deuterium udveksling. Brug detaljeret sammenligning af de informative indhold fra disse metoder dog skal udføres i fremtiden. Selv om oprettelse af anvendeligheden af ssHDX-MS og SSPL-MSsom en formulering screeningsværktøj i sidste ende vil kræve, at den anvendes på mange proteiner, resultater fra vores seneste undersøgelser understøtter den bredere anvendelse. Med yderligere udvikling, er disse metoder forventes at være almindeligt anvendelige til karakterisering solid-state proteinformuleringer i den biofarmaceutiske industri.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equine myoglobin | Sigma-Aldrich | M0630-5G | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma Aldrich | #T9531 | |
D-Sorbitol | Sigma Aldrich | #240850 | |
L-Photo-leucine | Thermo Scientific | #22610 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | #P0662 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | #P3786 | |
Deuterium Oxide | Cambridge Isotope Laboratories | #DLM-4-PK | Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich) |
Immobilized pepsin | Applied Biosystems | #2-3132-00 | |
Trypsin | Promega | #V511A | Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used |
Water, Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | #7732-18-5 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | #34998 | |
Formic acid | Thermo Scientific | #28905 | |
ESI-TOF Calibrant | Agilent Technologies | #G1969-85000 | Highly flammable liquid |
Protein microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25108/03 | |
Peptide microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25109/02 | |
Analytical column | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | |
Freeze dryer | VirTis AdVantage Plus | ||
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps | Stratagene Corp. | Stratalinker 2400 | |
HPLC | Agilent Technologies | 1200 series LC | Refrigerated LC system for HDX-MS |
ESI-qTOF MS | Agilent Technologies | 6520 qTOF | |
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) | Sierra Analytics | http://www.massspec.com/HDExaminer.html |