Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.
Amide hydrogène / échange de deutérium (ssHDX-MS) et la chaîne latérale d'étiquetage photolytique (Sspl-MS) suivie d'une analyse par spectrométrie de masse peuvent être utiles pour la caractérisation des formulations lyophilisées de protéines thérapeutiques. Marquage suivie d'une digestion protéolytique convenable permet à la structure de la protéine et des interactions à être mis en correspondance avec une résolution au niveau du peptide. Étant donné que la protéine éléments structurels sont stabilisées par un réseau de liaisons chimiques à partir des chaînes principales et des chaînes latérales d'acides aminés, un étiquetage spécifique d'atomes dans les résidus d'acides aminés donne un aperçu de la structure et la conformation de la protéine. Contrairement aux méthodes de routine utilisées pour étudier les protéines dans les solides lyophilisés (par exemple, FTIR), ssHDX-MS-MS et SSPL fournissent des informations quantitatives et spécifiques au site. L'étendue de incorporation du deutérium et les paramètres cinétiques peut être liée à l'échange rapide et lentement piscines amide (N rapide, N lent) et reflète directement les degree de repliement des protéines et de la structure dans des formulations lyophilisées. Étiquetage photolytique Stable ne subit pas de back-échange, un avantage sur ssHDX-MS. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour les deux ssHDX-MS-MS et Sspl, en utilisant de la myoglobine (Mb) en tant que protéine modèle dans des formulations lyophilisées contenant soit le trehalose ou le sorbitol.
médicaments de protéines sont le secteur le plus dynamique de l'industrie biopharmaceutique et offrent de nouveaux traitements prometteurs pour des maladies jusque-là insolubles, y compris les troubles hormonaux, cancers et maladies auto-immunes 1. En 2012, le marché mondial de produits biothérapeutiques atteint $ 138 000 000 000 et devrait atteindre $ 179 000 000 000 d'ici l'an 2018 2. Les protéines sont plus grandes et plus fragile que les médicaments à petites molécules classiques et sont donc plus sensibles à de nombreux types de dégradation 3. Pour assurer la durée de vie et la stabilité adéquate, médicaments protéiques sont souvent formulées comme lyophilisé (ie, lyophilisé) poudres solides. Toutefois, une protéine peut encore subir une dégradation à l'état solide, en particulier si sa structure native ne est pas préservée lors de la 4,5- processus de lyophilisation. Assurer que la structure a été retenue ne est possible que se il ya des méthodes d'analyse qui peut sonder la conformation des protéines dans l'état solide avec suffisant résolution.
6 spectroscopie RMN et cristallographie aux rayons X 7 sont les méthodes à haute résolution communément utilisés pour évaluer la structure des protéines en solution et des solides cristallins 8. En raison de la nature des excipients et des méthodes de traitement utilisées, les formulations de protéines lyophilisées sont habituellement amorphe plutôt que cristalline 9. Le manque d'homogénéité et de l'ordre microscopique rend les techniques mentionnées ci-dessus impraticable pour les protéines dans les solides amorphes. Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) 10, 11 spectroscopie Raman et la spectroscopie proche infrarouge (NIR) 12 ont été régulièrement utilisée par l'industrie biopharmaceutique de comparer structure secondaire des protéines en poudres lyophilisées à celle de la structure de l'État-solution native. Cependant, ces méthodes sont en basse résolution et ne peuvent fournir des informations sur les changements globaux de la structure secondaire. Caractérisation structurale à l'état solide par FTIRa montré soit faible ou pauvre 13,14 15 corrélation avec la stabilité de stockage à long terme. Ces limites soulignent la nécessité de méthodes appropriées à haute résolution pour identifier protéines perturbations structurelles à l'état solide.
Marquage chimique associée à la protéolyse et l'analyse par spectrométrie de masse a émergé comme une approche puissante à la surveillance de la structure des protéines et des interactions moléculaires en solution aqueuse. Dans le développement pharmaceutique, HDX-MS a été utilisé pour la cartographie de l'épitope dans les interactions antigène-anticorps 16,17, pour cartographier les interactions récepteur-drogue 18, pour surveiller les effets des modifications post-traductionnelles sur la conformation des médicaments protéiques 19, et de comparer variation dans le développement de biosimilaires 20 lot à lot. De même, les ligands photoactivables ont été utilisés pour identifier des cibles de médicaments et de déterminer l'affinité de liaison et la spécificité des interactions médicament-récepteur 21,22. Pour envoyerxtend l'application de ces méthodes à des formulations lyophilisées, notre groupe a développé à l'état solide échange de deutérium d'hydrogène spectrométrie de masse (ssHDX-MS) et à l'état solide spectrométrie de masse d'étiquetage photolytique (SSPL-MS) pour étudier conformations de protéines et les interactions de l'excipient dans les échantillons lyophilisés avec une grande résolution.
Dans les deux ssHDX-MS-MS et Sspl, la protéine est marquée dans des conditions réactionnelles optimales dans les solides lyophilisées, et les échantillons sont ensuite reconstitué et analysé par spectrométrie de masse avec ou sans digestion protéolytique. ssHDX-MS fournit des informations sur l'exposition principale de la chaîne à la vapeur de deutérium, tout en SSPL-MS fournit des informations sur l'environnement des chaînes latérales (Figure 1). Les deux méthodes peuvent ainsi fournir des informations complémentaires sur la conformation des protéines dans l'état solide. Ici, nous fournissons un protocole général pour étudier les protéines dans les solides lyophilisés utilisant ssHDX-MS et SSPL-MS (Figure 2), en utilisant comme Mbune protéine modèle. Nous montrons la capacité des deux méthodes pour distinguer des différences dans des formulations avec des excipients deux différents.
Figure 1:. La structure des protéines de mesure ssHDX et Sspl dans les solides lyophilisées au moyen de mécanismes d'étiquetage différents (A) Dans HDX, l'amide du squelette hydrogènes avec échange de deutérium en fonction de la structure des protéines et D 2 O accessibilité. Dans l'état solide, le taux et l'étendue de l'échange de deutérium dépendent du niveau de sorption D 2 O, la mobilité de la protéine (repliage et dépliage événements) et la nature des excipients présents dans la matrice solide. (B) En PL, irradiation UV à 365 nm initie la formation d'un intermédiaire réactif carbène à partir du groupe fonctionnel diazirine de pleu et est inséré de manière non spécifique dans ne importe quelle liaison de XH (X = ne importe quel atome) ou added à travers une liaison C = C dans son voisinage immédiat. Dans l'état solide, le taux et l'étendue du marquage dépendent de la concentration locale de l'agent de marquage, le temps d'irradiation, la structure des protéines et de la nature des excipients présents dans la matrice solide. Les panneaux A et B montrent l'étiquetage théorique maximale qui peut se produire sur squelette et des chaînes latérales respectivement en protéine.
Figure 2: l'état solide de représentation schématique HDX-MS (A) et PL-MS (B) pour la protéine dans la formulation lyophilisée.
Plusieurs études ont suggéré que l'environnement local dans les échantillons lyophilisés affecte la dégradation des protéines 5,29,30. Cependant, établir une relation directe entre la structure des protéines et de la stabilité à l'état solide n'a pas été possible en raison de l'absence de méthodes analytiques à haute résolution. L'application des méthodes de haute résolution existants tels que HDX et PL à poudres lyophilisées nécessite une modification des protocoles de solutions et une interprétation prudente de données. HDX-MS et MS-PL ont été successivement adoptées pour surveiller conformations de protéines dans l'état solide. Les résultats présentés ici et d'ailleurs 27,28,31-33 ont démontré la capacité de ces méthodes pour surveiller la conformation des protéines à haute résolution dans l'environnement solide. Bien que les étapes critiques dans l'analyse des données ne varient pas d'étiquetage en solution 34-36, des considérations importantes lors de l'installation expérimentale et l'interprétation des données sont nécessaires pour chimico-état solideétiquetage cal.
La sélection du réactif de marquage doit être basée sur la taille et le mécanisme de marquage. La petite taille du deutérium permet au squelette peptidique à palper facilement, alors que la taille relativement plus grande des pleu limite étiquetage des chaînes latérales. Les deux ssHDX Sspl et ne montrent pas de préférence pour un acide aminé quelconque, de sorte que l'étiquetage ne dépend que de squelette et des chaînes latérales exposition à la matrice. Pour sonder efficacement conformations de protéines dans l'état solide, les facteurs externes qui influent sur le processus d'étiquetage doivent être soigneusement contrôlées. La quantité totale et la distribution spatiale de l'agent de marquage dans les solides lyophilisées est différent de solutions aqueuses.
Dans ssHDX, la quantité de D 2 O dans la matrice solide peut affecter le taux de dépliement des protéines (ou dépliement partiel), le repliement, et l'échange de deutérium. Ce ne est pas le cas avec une solution HDX, dans lequel l'échantillon de protéine est normalement dilué avec un grand volume de D 2 O.Examen minutieux des effets de l'hydratation sur le taux ssHDX peut informer le choix des conditions idéales RH. Pour contrôler la vitesse de sorption de l'humidité et éviter l'effondrement de la poudre dans des formulations contenant des excipients hygroscopiques (par exemple de saccharose et le trehalose), ssHDX peut être effectuée dans des conditions réfrigérées (2-8 ° C). Notre étude précédente sur les effets d'hydratation a montré taux et l'étendue de change a augmenté avec l'augmentation de la teneur en humidité, comme prévu. Dans une grande partie de notre travail, une humidité intermédiaire de 43% à 5 ° C se est avérée idéale pour distinguer formulations dans un délai raisonnable 24. La réaction est habituellement mise en oeuvre jusqu'à ce qu'un plateau soit atteint. Cela garantit que sorption d'humidité et la diffusion dans le solide ne contrôlent pas le taux de HDX. L'utilisation de petites tailles d'échantillons solides avec le volume de pré-lyophilisation du ≤2 ml contribue également à assurer que D 2 O sorption de la vapeur est essentiellement terminée au début de la période d'échange. Bien ssHDX-MS offredes informations quantitatives sur la conformation de la protéine dans l'état solide, il ya certaines conditions où l'interprétation des données ne peut pas être entièrement basé sur l'étude ssHDX seul. Il est possible que la diminution de l'absorption de deutérium observée dans un échantillon (par rapport au contrôle) peut être due à la rétention ultérieure de la structure de la protéine ou de la quantité importante d'agrégats de protéines présentes dans l'échantillon. Dans ce cas, l'interprétation des données ssHDX nécessite résultats d'autres méthodes complémentaires. Élargissement pic de spectres de masse deutéré a été observée pour plusieurs formulations Mb 27,28. Cela pourrait être dû à divers facteurs tels que la présence de population partiellement déplié de la protéine, l'hétérogénéité spatiale dans l'échantillon, ou les gradients spatiaux de la concentration en D 2 O. Cependant, ces facteurs ne ont pas été distingués dans ssHDX-MS et doit être approfondie.
Comme SSPL-MS est relativement nouveau par rapport à d'autres méthodes, l'apprentissage continu abses applications et ses limites est nécessaire. Dans Sspl, le photo-agent de réticulation est lyophilisée avec la protéine. Le manque d'humidité limite la mobilité des composants à l'intérieur de la matrice solide, et la relaxation structurale partielle qui peut se produire avec l'humidité dans ssHDX sorption ne est pas un phénomène dans Sspl. Ceci limite l'étiquetage dans Sspl à proximité immédiate de la photo-agent de réticulation. Cependant, contrairement HDX-MS, l'analyse de la protéine marquée de manière covalente peuvent fournir des informations de structure au niveau du résidu MS / MS. Depuis étiquetage SSPL est covalente et irréversible, de retour échange ne se produit pas et les échantillons peuvent être préparé et analysé sans se préoccuper de la perte de l'étiquette. Pour faciliter la diffusion de l'agent de l'étiquetage et améliorer l'efficacité de l'étiquetage à l'état solide à matrice, SSPL peut être effectuée avec l'augmentation% HR. pleu absorption peut également être améliorée en augmentant la concentration de l'agent photoréactif. Le rapport molaire de la protéine à pleu On peut faire varier comme on le souhaite. En général, un excès 100 fois molaire de pleu à proTEIN assurer un étiquetage adéquat. Toutefois, la concentration élevée pleu peut entraîner la perte de structure tertiaire des protéines dans la matrice solide. Ainsi, en plus de la cinétique de l'étiquetage et de la composition de la formulation, la sélection de la concentration pleu doit également être fondée sur le maintien de l'intégrité structurale de protéines. Comme pleu étiquettes non sélective XH (où X = C, N, O), il est possible que des excipients avec des sites d'étiquetage similaires peut grandement influer sur le niveau de l'étiquetage des protéines. L'ingérence des excipients dans la disponibilité des peuls pour l'étiquetage de la protéine est encore à caractériser. Il est connu que le carbène généré à partir de l'activation du diazirine ne est pas à base de résidus spécifiques, cependant une étude rapporte préférence pour Asp et Glu 36. Se il est bon d'apprendre sur les interactions spécifiques de résidus, des informations de peptide-niveau est aussi utile et peut être utilisé pour concevoir des excipients pour bloquer les régions à forte exposition de la matrice à l'état solide. SSPL-MS fournit des informations qualitatives détaillées, cependantdes données quantitatives doit être obtenu et les mesures robustes doivent être développés pour analyser les différences de formulation à travers une variété de systèmes lyophilisés.
L'utilisation d'un marqueur spécifique d'résidu combinée à une analyse MS / MS peut en outre améliorer la résolution au niveau des acides aminés. des réactifs de marquage, tels que la 2,3-butanedione à étiqueter Arg, N-hydroxysuccinimide pour les dérivés de Lys et les dérivés de N -alkylmaleimide pour Cys peut être utilisé pour une cartographie précise des interactions moléculaires sous forme de poudre lyophilisée. Toutefois, ces réactifs sont tributaires du pH et les réactions peuvent ne pas être aussi bien contrôlés que l'étiquetage photolytique dans l'état solide. Une autre approche consiste à incorporer le photo-agent de réticulation dans la séquence de la protéine avec l'utilisation de lignées de cellules auxotrophes, la mutagenèse dirigée ou la chaîne latérale dérivatisation.
Nos études ssHDX-MS-MS et Sspl antérieures ont montré que le marquage de la protéine dépend de la nature et de la quantité des excipients24,27,28,31-33,37,38 utilisé. ssHDX-MS de Mb co-lyophilisé avec le chlorhydrate de guanidine (Gdn.HCl) ont montré une plus grande absorption de deutérium que Mb co-lyophilisé avec un faible poids moléculaire 32 sucres. Dans une étude séparée SSPL-MS, Mb co-lyophilisé avec Gdn.HCl a montré une plus grande protection de l'étiquetage photolytique de 33 Mb avec du saccharose. De plus, des mesures quantitatives de ssHDX-MS ont été fortement corrélée à la stabilité de la protéine au cours du stockage à long terme 28. Ces études suggèrent que ssHDX ou SSPL de protéines reflète l'étendue de rétention de la structure de la protéine en poudre lyophilisée. Nous croyons que le maintien de la structure secondaire des poudres lyophilisées fournit un environnement favorable à l'étiquetage de la chaîne latérale avec les peuls et la protection de l'amide hydrogène à partir de l'échange de deutérium. Toutefois, la comparaison détaillée du contenu informatif de ces méthodes doit être effectuée à l'avenir. Bien que l'établissement de l'utilité de ssHDX-MS-MS et SSPLcomme un outil de dépistage de la formulation sera finalement exiger qu'elle soit appliquée à de nombreuses protéines, les résultats de nos études récentes soutient son adoption plus large. Avec la poursuite du développement, ces méthodes devraient être largement utile pour caractériser formulations de protéines à l'état solide dans l'industrie biopharmaceutique.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equine myoglobin | Sigma-Aldrich | M0630-5G | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma Aldrich | #T9531 | |
D-Sorbitol | Sigma Aldrich | #240850 | |
L-Photo-leucine | Thermo Scientific | #22610 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | #P0662 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | #P3786 | |
Deuterium Oxide | Cambridge Isotope Laboratories | #DLM-4-PK | Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich) |
Immobilized pepsin | Applied Biosystems | #2-3132-00 | |
Trypsin | Promega | #V511A | Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used |
Water, Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | #7732-18-5 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | #34998 | |
Formic acid | Thermo Scientific | #28905 | |
ESI-TOF Calibrant | Agilent Technologies | #G1969-85000 | Highly flammable liquid |
Protein microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25108/03 | |
Peptide microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25109/02 | |
Analytical column | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | |
Freeze dryer | VirTis AdVantage Plus | ||
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps | Stratagene Corp. | Stratalinker 2400 | |
HPLC | Agilent Technologies | 1200 series LC | Refrigerated LC system for HDX-MS |
ESI-qTOF MS | Agilent Technologies | 6520 qTOF | |
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) | Sierra Analytics | http://www.massspec.com/HDExaminer.html |