Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.
質量分析に続くアミド水素/重水素交換(ssHDX-MS)及び側鎖光分解標識(SSPL-MS)は、タンパク質治療薬の凍結乾燥製剤を特徴付ける貴重であることができる。適切なタンパク質分解消化に続いてラベリングは、タンパク質の構造との相互作用は、ペプチドレベルの分解能でマッピングされることを可能にする。タンパク質ので、構造要素は、主鎖、およびアミノ酸、アミノ酸残基の原子の特異的標識タンパク質の構造とコンフォメーションへの洞察を提供するの側鎖の化学結合のネットワークにより安定化される。凍結乾燥された固体( 例えば 、FTIR)でタンパク質を研究するために使用される日常的な方法とは対照的に、ssHDX-MSとのSspI-MSで定量し、サイト固有の情報を提供する。重水素取り込み動態パラメータの程度は急速にゆっくりと(N 速い 、 遅い N)アミドプールを交換することに関連して直接度を反映することができる凍結乾燥製剤中のタンパク質の折りたたみ及び構造のREE。安定した光分解ラベリングは、バック交換、ssHDX-MSを上回る利点を受けない。ここでは、トレハロースまたはソルビトールのいずれかを含有する凍結乾燥製剤中のモデルタンパク質としてミオグロビン(Mbの)を使用して、ssHDX-MSとのSspI-MSの両方についての詳細なプロトコルを提供する。
タンパク質薬剤は、バイオ医薬品業界の最も急速に成長している分野であり、ホルモン障害、癌および自己免疫疾患1を含む以前に難治性疾患のための有望な新しい治療法を提供しています。 2012年には、世界的なバイオ治療薬市場は1380億ドルに達し、2018年2によって1790億ドルに達すると予想されている。タンパク質は、従来の低分子薬より大きく、より壊れやすく、そのように劣化3、多くの種類の影響を受けやすくなります。十分な貯蔵寿命および安定性を確保するために、タンパク質薬剤は、多くの場合( すなわち 、凍結乾燥)凍結乾燥のような固体粉末製剤化される。しかし、タンパク質は、まだその本来の構造は凍結乾燥プロセスの4,5中に保存されていない場合は特に、固体状態で分解を受けることがあります。構造が保持されていることを保証するsufficienで固体でタンパク質コンフォメーションを調べることができる分析方法がある場合にのみ可能であるTの解像度。
NMR分光法6およびX線結晶7は、溶液と結晶性固体8のタンパク質構造を評価するために一般的に使用される高解像度の方法である。なぜなら賦形剤及び使用する処理方法の性質のため、凍結乾燥タンパク質製剤は、通常は非晶質ではなく、9結晶質である。均質性と微視的秩序の欠如は、非晶質固体中のタンパク質のための上記の技術は非現実的になります。フーリエ変換赤外分光法(FTIR)10に変換ラマン分光法11と近赤外分光法(NIR)12は、定期的に天然の液状態の構造のものに凍結乾燥粉末中のタンパク質の二次構造を比較するためにバイオ医薬品業界で使用されてきた。しかしながら、これらの方法は、低解像度であり、唯一の二次構造の全体的な変化に関する情報を提供することができる。 FTIRを用いた固体構造解析長期保存安定性に弱い13,14または貧しい15相関のいずれかを示している。これらの制限は、固体中のタンパク質の構造的摂動を同定するのに適した高解像度の方法の必要性を強調している。
タンパク質分解および質量分析と連結化学的標識は、水溶液中のタンパク質の構造および分子間相互作用をモニタリングするための強力なアプローチとして登場した。医薬品開発においては、HDX-MSは、タンパク質薬剤19のコンホメーションの翻訳後修飾の効果をモニターするために、受容体-薬物相互作用18をマッピングし、及び比較するために、抗原-抗体相互作用16,17におけるエピトープマッピングのために使用されているバイオシミラー20の開発にバッチ間の変動。同様に、光活性化可能なリガンドは、薬物標的を同定するために、薬剤-受容体相互作用21,22の結合親和性および特異性を決定するために使用されている。 EにXTEND凍結乾燥製剤に、これらの方法の応用、我々のグループが開発した固体水素重水素交換質量分析(ssHDX-MS)及び固体光分解標識化質量分析法(SSPL-MS)は、凍結乾燥されたサンプル中のタンパク質のコンフォメーションおよび賦形剤との相互作用を研究する高解像度。
ssHDX-MSとのSspI-MSの両方において、タンパク質は、凍結乾燥された固体中の理想的な反応条件下で、標識され、次いで、サンプルを再構成し、またはタンパク質分解性消化せずに質量分析法によって分析される。 SSPL-MSは、側鎖( 図1)の環境に関する情報を提供しながらssHDX-MSは、重水素蒸気に主鎖曝露に関する情報を提供する。二つの方法は、このように固体タンパク質コンフォメーションについての補足情報を提供することができる。ここでは、Mbのように使用して、ssHDX-MSとのSspI-MS( 図2)を用いて凍結乾燥した固形物中のタンパク質を研究するための一般的なプロトコルを提供モデルタンパク質。我々は2つの異なる賦形剤との配合物の違いを区別するための二つの方法の能力を示す。
図1:異なる標識メカニズムを通して凍結乾燥固体中ssHDXとSSPLメジャータンパク質構造(A)HDX、タンパク質構造およびDの関数2 Oアクセシビリティとして重水素骨格アミド水素交換で。固体では、重水素交換の速度および程度は、D 2 O吸着、タンパク質の移動度(イベントを展開し、リフォールディング)および固体マトリックス中に存在する賦形剤の性質のレベルに依存。 (B)PLでは、365nmのUV照射はpLeuのジアジリン官能基の反応性中間体カルベンの生成を開始し、任意のXH結合(Xは任意の原子を=)、または広告に非特異的に挿入されているそのすぐ近くにC = C結合を越えDED。固体では、標識化の速度および程度は、ローカルの標識剤の濃度、照射時間、タンパク質の構造および固体マトリックス中に存在する賦形剤の性質に依存する。パネルAおよびBは、タンパク質中のそれぞれ骨格および側鎖に発生することが理論上の最大の標識を示す。
図2:凍結乾燥製剤中のタンパク質の回路図を示す固体HDX-MS(A)及びPL-MS(B)。
いくつかの研究は、凍結乾燥試料中のローカル環境は、タンパク質分解5,29,30に影響を及ぼすことを示唆している。しかし、固体状態のタンパク質の構造と安定性との間の直接的な関係を確立することにより、高分解能の分析方法がないために可能ではなかった。凍結乾燥粉末のようなHDXとPLのような既存の高解像度の方法の適用は、ソリューション·プロトコルと慎重なデータ解釈の変更を必要とする。 HDX-MS及びPL-MSは、連続固体状態のタンパク質コンフォメーションを監視するために採用されている。ここで、他の場所27,28,31-33示す結果は、固体環境で高解像度のタンパク質コンフォメーションをモニタするこれらの方法の能力を実証した。データ解析における重要なステップは、溶液中で34-36標識から変化しないものの、実験およびデータ解釈の間に重要な考慮事項は、固体ケミに必要とされるCALラベリング。
標識試薬の選択は、ラベルのサイズとメカニズムに基づいている必要があります。 pLeuの比較的大きなサイズは、側鎖に標識化を制限するのに対して、重水素の小さなサイズは、ペプチド骨格を容易に調べることができます。標識は、マトリックス主鎖と側鎖の暴露にのみ依存するようにssHDXとSSPL両方は、任意のアミノ酸のための好みを示さない。効果的に固体中のタンパク質立体構造をプローブに、ラベリング処理に影響を与える外部要因を慎重に制御しなければならない。凍結乾燥された固体中の合計量と標識剤の空間分布は、水性溶液とは異なる。
ssHDXでは、固体マトリックス中のD 2 Oの量は、タンパク質のアンフォールディングの割合(または部分的なアンフォールディング)リフォールディング、および重水素交換に影響を及ぼし得る。これは、タンパク質試料は、通常、D 2 Oの十分な容積に希釈した溶液HDX、の場合ではありませんssHDX速度に対する水和の影響を注意深くスクリーニング理想RH条件の選択を通知することができる。吸湿速度を制御し、吸湿性の賦形剤( 例えば 、スクロースおよびトレハロース)を含有する製剤中に粉末の崩壊を避けるために、ssHDXは冷蔵条件下(2~8℃)で行うことができる。予想通りの水和効果に関する我々の以前の研究では、水分含有量の増加との交換の速度および程度の増加を示した。我々の研究の多くでは、5℃で43%の中間RHは、妥当な時間内に24の製剤を区別するのが理想的であることが証明された。プラトーに達するまで、反応は通常行われる。これは固体への水分の吸着と拡散がHDX速度を制御しないことを保証します。 ≤2ミリリットルの凍結乾燥前体積の小さな固体試料サイズの使用はまた、D 2 O蒸気収着早期交換期間中に本質的に完全であることを保証するのに役立つ。しかしssHDX-MSが提供する固体中のタンパク質の立体構造に関する定量的情報、データの解釈は完全に一人でssHDXの研究に基づいてすることができない一定の条件があります。これは、(対照と比較した場合)サンプルで観察された減少した重水素の取り込みは、タンパク質の構造または試料中に存在するタンパク質凝集物のかなりの量のより高い保持力に起因する可能性がある。このような場合には、ssHDXデータの解釈は、他の補完的な方法からの結果を必要とする。重水素化質量スペクトルのピークの広がりは数Mb製剤27,28のために観察された。これは、D 2 Oの濃度で試料中に部分的に折り畳まれたタンパク質の集団、空間的不均一性の存在、または空間的変化など様々な要因に起因する可能性がある。しかし、これらの要因はssHDX-MSで区別していなかったと、さらなる調査が必要である。
他の方法と比較した場合のSspI-MSは、比較的新しいもののように、継続的な学習ABそのアプリケーションと限界外に必要とされる。 SSPLでは、光架橋剤は、タンパク質を凍結乾燥する。水分の不足は、固体マトリックス内のコンポーネントの移動を制限し、ssHDXで水分収着で発生する可能性のある部分構造緩和がSSPLで現象ではない。これは、光架橋剤のすぐ近くにSSPL中の標識を制限します。しかし、HDX-MSとは異なり、共有結合的に標識されたタンパク質のMS / MS分析は残留レベルの構造的情報を提供することができる。 SSPL標識は、共有結合的および不可逆的であるため、バック交換が発生せず、試料を調製し、ラベルの喪失を心配することなく分析することができる。標識剤の拡散を促進し、固体マトリックス中の標識効率を向上させるために、SSPLが増加%RHで行うことができる。 pLeu取り込みはまた、光反応剤の濃度を増加させることによって改善することができる。必要に応じてpLeuに対するタンパク質のモル比を変化させることができる。一般的には、プロにpLeuの100倍モル過剰テインは、適切なラベル付けを保証します。しかし、高pLeu濃度は、固体マトリックス中のタンパク質の三次構造の喪失をもたらし得る。従って、標識化動態および処方物に加えて、pLeu濃度の選択は、タンパク質の構造的完全性を維持することに基づいていなければならない。 pLeu非選択的にラベルXH(X = C、N、O)基としては、類似の標識部位を有する賦形剤が大いにタンパク質標識のレベルに影響を与えることが可能である。タンパク質標識用pLeuの可用性における賦形剤の干渉はまだ特徴付けされるべきである。これは、ジアジリン活性化から生成されたカルベンは残基特異的ではないことが知られている、しかし、ある研究では、AspおよびGlu 36の方にバイアスを報告します。その残留物を、特異的相互作用について学ぶのが良いが、ペプチドレベルの情報も有用であり、固体状態での高いマトリックス曝露領域をブロックするための賦形剤を設計することができる。 SSPL-MSは、しかし、詳細な定性的な情報を提供します定量的データを取得する必要があり、強固なメトリックは、凍結乾燥された種々のシステム全体での製剤の違いを分析するために開発される必要がある。
MS / MS分析と組み合わせた残基特異的標識の使用は、アミノ酸レベルの解像度を向上させることができる。 2,3-ブタンジオンなどの標識試薬は、ArgがCysからLysおよびN -alkylmaleimide誘導体用のNヒドロキシスクシンイミド誘導体を正確に凍結乾燥粉末中の分子の相互作用をマッピングするために使用することができる標識する。しかし、これらの試薬は、pH依存性であり、反応は、固体で光分解標識として十分に制御できない場合があります。別のアプローチは、栄養要求性細胞株、部位特異的変異誘発または側鎖誘導体を用いてタンパク質配列に光架橋剤を組み込むことである。
我々の以前のssHDX-MSとのSspI-MS研究は、タンパク質の標識は、賦形剤の性質および量に依存することが示されている24,27,28,31-33,37,38を使用していました。メガビットのssHDX-MSは、塩酸グアニジン(Gdn.HCl)で凍結乾燥共同Mbは低分子量の糖32と共凍結乾燥よりも重水素取り込みを示した。個別のSSPL-MSの研究では、MbのGdn.HClとの共凍結乾燥し、ショ糖33 MBより光分解ラベリングからより大きな保護を示した。さらに、ssHDX-MSからの定量的な測定は、非常に長期の記憶装置28中のタンパク質の安定性と相関している。これらの研究は、タンパク質のssHDXまたはSSPL凍結乾燥粉末中のタンパク質の構造保持の程度を反映することを示唆している。私たちは、凍結乾燥粉末中の二次構造の保持が側鎖pLeuによる標識と重水素交換からアミド水素の保護のための良好な環境を得たと判断している。しかしながら、これらの方法の有益なコンテンツの詳細な比較は、将来的に行う必要がある。 ssHDX-MSとSSPL-MSの有用性を確立するものの製剤のスクリーニングツールとしてそれは多くのタンパク質に適用されることを最終的に必要になります、私たちの最近の研究の結果は、その広い採用をサポートしています。さらなる発展に伴い、これらの方法は、バイオ医薬品業界に固体タンパク質製剤を特徴付けるために広く有用であると期待される。
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equine myoglobin | Sigma-Aldrich | M0630-5G | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma Aldrich | #T9531 | |
D-Sorbitol | Sigma Aldrich | #240850 | |
L-Photo-leucine | Thermo Scientific | #22610 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | #P0662 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | #P3786 | |
Deuterium Oxide | Cambridge Isotope Laboratories | #DLM-4-PK | Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich) |
Immobilized pepsin | Applied Biosystems | #2-3132-00 | |
Trypsin | Promega | #V511A | Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used |
Water, Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | #7732-18-5 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | #34998 | |
Formic acid | Thermo Scientific | #28905 | |
ESI-TOF Calibrant | Agilent Technologies | #G1969-85000 | Highly flammable liquid |
Protein microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25108/03 | |
Peptide microtrap | Michrom Bioresources | TR1/25109/02 | |
Analytical column | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | |
Freeze dryer | VirTis AdVantage Plus | ||
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps | Stratagene Corp. | Stratalinker 2400 | |
HPLC | Agilent Technologies | 1200 series LC | Refrigerated LC system for HDX-MS |
ESI-qTOF MS | Agilent Technologies | 6520 qTOF | |
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) | Sierra Analytics | http://www.massspec.com/HDExaminer.html |