Analyse av de kontraktile egenskapene til kjemisk flådd, eller permeabiliserte, skjelettmuskelfibrene tilbyr en kraftig metode til å vurdere muskelfunksjon på nivå med singelen muskelcellen. I denne artikkelen skissere vi en gyldig og pålitelig teknikk for å forberede og test permeabilized skjelettmuskelfibre in vitro.
Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.
Den primære funksjon av skjelettmuskulatur er å generere kraft. Muskelkraften utløses in vivo via en kompleks sekvens av hendelser som omfatter motoriske nerveaksjonspotensialer, neuromuskulær transmisjon, muskelfiberaksjonspotensialer, frigivelse av intracellulært kalsium og aktivering av systemet med regulerende og kontraktile proteiner. Fordi kraftgenerering er det endelige resultat av denne sekvens, kan et underskudd i kraft skyldes svikt i ett eller flere av de individuelle trinnene. En viktig egenskap av permeabilized fiber forberedelse er at det eliminerer de fleste av trinnene som er nødvendig for styrkegenerering in vivo, med bare de regulatoriske og kontraktile funksjoner knyttet til den myofibrillære apparat som gjenstår. Undersøkeren antar kontroll over levering av aktiverende kalsium og energi (ATP), og belønnes med et forenklet system som tillater vurdering av de isolerte regulerings- og kontraktile strukturer i sitt opprinnelige configuration. Målinger av kraft ved hjelp permeabiliserte skjelettmuskelfibre er dermed verdifull når man vurderer endringer i muskelfunksjon observert in vivo. For eksempel har vi brukt denne teknikken for å karakterisere kraft kapasitet på fiber fra myostatin mangelfull mus 1 og å vurdere årsaken til vedvarende muskelsvakhet utstilt etter kronisk rotator cuff tårer 2,3.
Moderne permeabilized fiber metodikk kan spores tilbake til tidlig innflytelsesrike studier 4,5 og er i bruk av en rekke forskningsgrupper. Selv om teknikker er blitt beskrevet i litteraturen, har de ennå ikke blitt presentert i videoformat. Målet med denne artikkelen er å illustrere et oppdatert, gyldig og pålitelig teknikk for å måle maksimal kraft kapasitet på enkeltfibre fra kjemisk permeabiliserte skjelettmuskelprøver. For å oppnå dette, en individuell fibersegmentet (referert til heri som en ̶0, av hvilke fiberen ") ekstrahert fra en forhånds permeabilisert bunt av fibre og plassert i en eksperimentell kammer som inneholder en avslappende løsning, er den definerende trekk en kalsiumkonsentrasjon som er <10 nM. Fiberen blir deretter festet ved en ende til en kraft-transduser, og i den andre enden til en lengde-regulator. Med fiber holdes på et optimalt sarcomere lengde, blir det overført til en aktiverende oppløsning som har en kalsiumkonsentrasjon er tilstrekkelig til å fremkalle maksimal aktivering og derved maksimal isometrisk kontraksjon kraft. Force data er kjøpt, lagret og analysert ved hjelp av en personlig datamaskin.
Vurdering av kontraktile egenskaper av permeabiliserte enkeltskjelettmuskelfibre er brukt til å undersøke muskelfunksjonen i en rekke sammenhenger. Eksempler på dette er studier som har evaluert effekten av aldring 12, mosjon 10,13,14, romfart 15, skader 2,3,16, medikamentelle behandlinger 17,18, sykdoms 19 og genetisk manipulasjon 20,21 på fiber struktur og funksjon. På grunn av evnen til å vurdere den direkte kontraktile utførelsen av myofibriller i sin opprinnelige konfigurasjon, gir denne teknikken en attraktiv plattform for å danne en forståelse av myofibrillære funksjon fraværende av potensielt samvirkende effekter som er til stede når neuromuskulær signaloverføring og eksitasjon-indusert kalsium-frigjøring inngår i systemet som studeres. Dessuten kan funksjonstesting av enkle fibre benyttes til å komplettere kontraktile protein identifikasjon resultater som de som erinnhentet gjennom immunhistokjemi eller gel elektroforese + western blot 22.
En av de primære funksjonene til skjelettmuskulatur er å generere kraft. Følgelig SF O, er et mål på den iboende kraft frembringes av et et kontraktile system, er av stor interesse for muskel fysiologer. Pålitelige estimater av SF o krever nøyaktige målinger av både fiber CSA og F o. Siden fibrene er, generelt, verken sirkulær i tverrsnitt, og heller ikke ensartet i CSA langs sin lengde, stor forsiktighet bør utvises ved estimering CSA. For dette formål blir det foretatt målinger på flere steder langs lengden av fiberen, og på hvert sted, fra to perspektiver adskilt med 90 °. Pålitelige målinger av F o krever oppmerksomhet til flere detaljer, inkludert regnskap for passiv kraft, justere sarcomere lengde for å maksimere overlapping av tykke og tynne filamenter, ansette en aktiverende løsning med en kalsiumkonsentrasjon tlue resulterer i maksimal aktivering, å opprettholde den ønskede forsøkstemperatur, og å opprettholde optimale lagringsbetingelser (temperatur og varighet) av fibrene før dagen for forsøket.
Mens du fremgangsmåten her beskriver framgangsmåten for å vurdere maksimal isometrisk kraft, er det ofte ønskelig å vurdere andre viktige funksjonelle kvaliteter av skjelettmuskelfibre. Dette kan oppnås ved å forlenge forsøksprotokollen for å inkludere flere mekaniske manipulasjoner av fiberen. For eksempel, tillater måling av hastigheten ved hvilken fiber forkorter mot en rekke forskjellige belastninger bestemmelse av styrken-hastighetsforhold, fra hvilken kraft-kraft og hastighet-effektforhold kan beregnes 10,23,24. I tillegg kan hastigheten til ubelastet forkortning bli bestemt ved å anvende "slakk test" 25, som består av å bruke en serie av slakk-induserende forkorting trinn og measuring av tiden som kreves av fiberen for å fjerne slakk. En annen kinetic parameter som ofte rapporteres er k st, hastighetskonstanten for kraft utbygging etter en mekanisk forstyrrelse som midlertidig løsner all crossbridges 26. Endelig er forholdet mellom kalsiumkonsentrasjon og virksomme kraft generasjonen (den "force-PCA-forholdet") ofte av interesse 18, og kan bestemmes ved å utsette fiberen for en serie løsninger med kalsiumkonsentrasjoner som strekker seg fra under terskelen for aktivering av kontraktile system til de som er tilstrekkelig til å fremkalle maksimal aktivering og derfor maksimal kraft (F o).
Selv om mye av det nevnte utstyr er nødvendig for å vurdere enkelt fiber kontraktilitet, er annet utstyr som ikke er absolutt nødvendig. Lengden-kontrolleren, for eksempel, er viktig for enhver forsøksprotokoll som krever rask og nøyaktig forlengelse eller forkortning av fiberen,men er ikke absolutt nødvendig for å vurdere maksimal isometrisk kraft (selv om en null-kraft nivå i kraft plate må likevel bli identifisert ved noen midler). De prismer som tillater observasjon av fiberen fra siden, mens nyttig for å vurdere tverrsnittsareal, er ikke absolutt nødvendig ved plassering av fiberen inne i forsøkskammeret. Videre betyr alternativ for å utsette fiberen for de forskjellige eksperimentelle løsningene kan bli benyttet, inkludert utarbeide et manuelt operert system av kamre eller et enkelt kammer som gir mulighet for rask fylling og tømming av løsninger. Til slutt, mens under eksperimentelle fysiologiske temperaturer slik som 15 ° C er vanligvis brukt til å forbedre reproduserbarheten av målingene mekaniske 1,2,3,5,8,12,17,27, er det mulig å generere gyldige data ved andre temperaturer 23 , 28 så lenge effekten av temperaturen på løsningsegenskaper (kalsiumkonsentrasjon, pH, etc.) blir tatt hensyn til. </p>
Sammensetningen av testing løsninger er blant de mest kritiske aspekter av permeabiliserte fiber teknikker beskrevet her. Betraktninger vedrørende løsningssammensetning er komplekse og utenfor omfanget av denne artikkelen. Løsningene som er beskrevet i trinn 5 i protokollen seksjonen er utformet med en vekt på hurtig aktivering av permeabilisert fiber på dens overføring fra pre-aktivering for å aktivere løsninger og samtidig opprettholde en konstant ionisk styrke, kationiske sammensetning, og osmolaritet 6,29. Andre tilnærminger til løsning sammensetning har vært ansatt med betydelig suksess med andre forskningsmiljøer og vanligvis gjøre bruk av publiserte bindende konstanter og dataverktøy 27,30,31. Konsentrasjonen av kalsiumioner i de forskjellige aktiverings løsningene er spesielt viktig i studier som involverer submaksimal aktivering slik som kraft-PCA evalueringer. For eksperimenter hvor fibrene er fullstendig aktivert, slik som de beskrived her, kalsiumkonsentrasjonen i den aktiverende oppløsning vanligvis overstiger med god margin som kreves for å oppnå maksimal styrke, noe som gjør dens presis kunnskap mindre kritisk. Tilsetning av kreatinfosfat er viktig for bufring av intramyofibrillar ATP og ADP svingninger som ellers ville være forbundet med kontraktile aktivitet. Kreatin kinase er nødvendig for å katalysere overføringen fosfat fra kreatinfosfat til ADP. Under eksperimentelle betingelser som medfører høy ATP omløpshastighet, inkludert arbeider ved høye temperaturer eller ved å måle med høy hastighet matfett i raske fibre 32, må kreatinkinase tilsettes til oppløsningen for å supplere endogen kreatin kinase som forblir bundet til fibrene. For mindre krevende eksperimentelle betingelser, er ATP-regenerering systemet 27 mindre kritisk.
Begrensninger av permeabilized enkelt fiber teknikken inkluderer følgende. De data som genereres av disse testene definererkontraktile egenskaper av den spesifikke myofibrillære enhet som var festet til den eksperimentelle apparater. Følgelig tar denne bare en liten brøkdel av hele multinucleated fiber fra hvilket segment ble oppnådd som i sin tur utgjør en liten brøkdel av det totale antall fibre i muskelen. Etterforskerne bør derfor vurdere nøye prøvetaking er nødvendig for å støtte noen konklusjoner trukket fra forsøkene. I tillegg evaluere virkningen av en trening intervensjon på fiber funksjon forutsetter at de evaluerte Fibrene ble faktisk rekruttert i løpet av treningen. Selv protokollen forsøker å etterligne den naturlige intracellulære miljøet av fiberen, er det sarcolemma permeabilization prosessen ikke-spesifikk og gir nødvendigvis oppløselige intracellulære bestanddeler til fritt diffundere inn i bade løsninger. En ytterligere konsekvens av membranens permeabilitet er en endring i den osmotiske balanse bevises ved en svelling i fibervolum 33. Denfiber svellingen øker avstanden mellom actin og myosin filamenter som resulterer i nedsatt følsomhet av kalsium myofilament systemet 34,35, men kan reverseres ved innføring av store, osmotisk aktive forbindelser 34. En endelig begrensning å vurdere er konsekvens av den teknikk som brukes til å feste fibrene til den eksperimentelle apparater. Dette krever alltid å forvrenge romlige forhold i det filament system ved og i nærheten av festepunkter, med stede funksjonsproblemer. Nærmere bestemt blir de områder av fiberen på og tilstøtende til festepunktene funksjonelt kompromittert, og derved bidra artifactual serie elastisitet til målesystemet.
Oppsummert har vi beskrevet et middel for å vurdere kraft-kapasitet på kjemisk permeabiliserte skjelettmuskelfibre in vitro. Selv om fokuset i denne artikkelen har vært på vurdering av maksimal isometrisk kraft frembringelseg kapasitet på menneskeskjelettmuskelfibre, kan den eksperimentelle metode modifiseres og utvides for å bestemme en rekke kinetiske parametre og forhold over et område av pattedyrarter, eller på annen måte.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.
Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
0.5 mL screw cap micocentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
LabVIEW software | National Instruments | – | |
Computer | Varied | – | |
Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
Reagents | |||
K-proprionate | TCI America | P0510 | |
Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
KOH (1N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
HCL (1N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 |