Summary
화학적으로 피부 또는 투과성이 골격근 섬유의 수축 특성의 분석은 하나의 근육 세포의 수준에서 근육 기능을 평가함으로써 강력한 수단을 제공한다. 이 문서에서 우리는 준비하는 유효하고 신뢰할 수있는 기술 개요 및 테스트는 시험 관내에서 골격 근육 섬유를 투과성이.
Introduction
골격근의 주요 기능은 힘을 발생하는 것이다. 근력은 운동 신경 활동 전위, 신경근 전달, 근육 섬유 활동 전위, 세포 내 칼슘의 방출, 및 규정 및 수축성 단백질의 시스템의 활성화를 포함 이벤트 복잡한 시퀀스를 통해 생체 내에서 유도된다. 구동력 발생이 시퀀스의 최종 결과이기 때문에, 힘의 결핍은 개별 단계 중 하나 이상의 오류로 인해 발생할 수있다. 투과성이 섬유 제조의 중요한 속성은 근원 섬유 장치는 나머지와 관련된 유일한 규제 및 수축 기능을, 생체 내에서 구동력 발생에 필요한 단계의 대부분을 제거한다는 것이다. 조사는 칼슘과 에너지 (ATP)를 활성화의 전달에 대한 제어를 가정하고 그 나라의 공동의 고립 된 규제 및 수축 구조의 평가를 할 수있는 단순화 된 시스템과 보상nfiguration. 생체 내에서 관찰 근육 기능의 변화를 평가할 때 투과성이 골격근 섬유를 사용하여 힘 측정 따라서 가치가있다. 예를 들어, 우리는 미오 스타틴 결핍 마우스 (1)로부터 섬유의 힘 발생 능력을 특성화하는 만성 회전근 2,3- 다음 나타내 영구 근육 약화의 원인을 평가하기 위해이 기술을 사용했다.
현대 광 투과성이 방법론은 초기 연구 영향력 4,5- 추적 연구 그룹 번호로 현재 사용된다. 기술은 문헌에 기재되어있다하더라도, 그들은 아직 비디오 포맷으로 제시되어 있지 않다. 이 문서의 목적은 화학적으로 투과성이 골격근 샘플들로부터 단일 섬유의 최대 힘 발생 능력을 측정하기 위해 업데이트, 유효하고 신뢰성있는 방법을 설명하는 것이다. 이, 본 명세서에서 개별 섬유 세그먼트 (달성하기 ̶0; 섬유 ")은 섬유의 사전 - 투과성이 번들로부터 추출하고 편안한 함유 용액 실험 챔버 내에 배치되어, 정의 기능 그중 10 <㎚이다 칼슘 농도이다. 섬유이어서 강제 변환기에 일단과 길이 컨트롤러 타단에 부착되어있다. 최적 근절 길이로 유지 섬유, 그것은 최대 활성화하여 최대 메트릭 수축력을 유도하기에 충분한 칼슘 농도를 갖는 활성 용액에 전송된다. 포스 데이터 획득 및 저장 퍼스널 컴퓨터를 사용하여 분석한다.
Protocol
동물이나 인체를 이용한 모든 절차는 관련 지침, 규정 및 규제 기관에 따라 수행되어야한다. 동물의 사용 및 관리에 미시간위원회의 대학 (UCUCA) 미시간 의료 센터 임상 시험 심사위원회의 대학은 모든 동물이 문서에서 설명하는 인간의 절차를 승인했다.
1. 확인 해부 및 저장 원액
참고 : 다음 지침에 지정된 최종 볼륨은 최대 크기를 조절하거나 필요에 따라 아래로 될 수있다.
- 1000 비이커에서 탈 이온수 (ASTM 유형 1) 800 mL를 추가합니다. 부드러운 교반을 유지하면서, 탈 이온수에 표 1에 열거 된 모든 화합물을 추가하고 용해 할 수있다.
화합물 이 용액에 농축을 원하는. (M) 화학 식량 (g / mol)의 1 L (G)에 추가 </ TR>K-프로 피오 네이트 0.250 112.17 28.040 이미 다졸 0.040 68.08 2.720 EGTA 0.010 380.40 3.800 의 MgCl 2 • 6H 2 O 0.004 203.31 0.813
표 1 : 해부 및 스토리지 원액 구성 요소.
- 탈 이온수 1000 ml의 최종 부피로 준비한다. 그것은이 때 용액의 pH를 할 필요가 있습니다. 4 ° C에서 원액을 저장합니다.
2. 확인 스토리지 솔루션
- 저장 용액 200 mL로 해부 및 250 ml의 비이커에 저장 스톡 용액 100 ㎖로 시작한다. 최종 아데노신을 가지고 충분한 나 2 H 2 ATP 추가2 mM의 인산 (ATP) 농도. 글리세롤 200 ㎖의 최종 부피로 준비한다. 수산화 칼륨 (KOH)을 사용하여 pH 7.00로 조정한다. -20 ° C에서 스토리지 솔루션을 저장합니다.
참고 : 글리세롤의 점성 특성으로 인해 정확하게 볼륨으로 분배하기가 어려울 수 있습니다. 이 때문에, 우리는 일반적으로 중량을 추가 글리세롤 (글리세린 100ml를 약 126g 무게).
3. 확인 해부 솔루션
- 솔루션을 해부 200 mL로, 250 mL의 비커에 해부 및 저장 원액 100 ㎖로 시작합니다.
- 2 mm로 최종 ATP 농도를 가지고 충분한 나 2 H 2 ATP를 추가합니다. 코와 7.00로 산도를 조정합니다. 탈 이온수 200 ml의에 최종 볼륨을 가져와. -80 ° C에서 2.5 ml의의 볼륨과 가게에서 나누어지는.
브리지 (Brij) 58 솔루션을 해부 4. 만들기
주 : 브리지 (Brij) 58 (permeabilizes) 지질 이중층을 방해 비이 온성 세제이다.
<OL>5. 시험 솔루션을 확인
주 : 다음은 Moisescu 및 Thieleczek 1978에서 적응 (6). 테스트 솔루션 준비에 대한 추가 의견에 대한 설명을 참조하십시오.
- "휴식"이라는 세 개의 분리 된 1,000 mL의 비커, "사전 활성화"와 "활성화"를 준비합니다. 각 비커에 400 mL의 3 차 증류수를 추가합니다.
- 해당 비커에 표 2에 표시된 화합물을 추가 한 다음 ° ~ 70 ° C 사이의 80 ℃에 솔루션을 가열한다. 연속적으로 교반하면서 30 분 동안 70 ~ 80 ℃의 용액 온도를 유지한다.
참고 : elimi에서 70 ~ 80 ° C의 도움의 온도탄산의 국가는 활성화 EGTA 용액에 탄산 칼슘과의 반응에 의해 형성했다. 편안한 용액 및 사전 활성화 용액 일관성을 유지하기 위해 활성화 용액과 동일하게 취급된다.
| 편안한 솔루션 | 사전 활성화 솔루션 | 활성화하기 솔루션 | |||||
| 화합물 | 화학 식량 (g / mol)의 | 원하는 농도 (㎜) | 필수 질량 (g) | 원하는 농도 (㎜) | 필수 질량 (g) | 원하는 농도 (㎜) | 필수 질량 (g) |
| HEPES (산) | 238.30 | 90.0 | 10.724 | 90.0 | 10.724 | 90.00 | 10.724 |
| 산화 마그네슘 | 40.31 | 10.3 | 0.208 | 8.5 | 0.171 | 8.12 | 0.164 |
| EGTA (산) | 380.40 | 52.0 | 9.890 | 52.00 | 9.890 | ||
| HDTA (산) | 348.36 | 50.0 | 8.709 | ||||
| CaCO3를 | 100.10 | 50.00 | 2.503 | ||||
표 2 : 다시laxing, 사전 활성화 및 활성화 솔루션 구성 요소.
- 실온으로 냉각시키고, 용액을 1 mM의 최종 농도를 NaN3가 가지고 충분한 NaN이 3 / KOH를 추가한다.
주의 : NaN3가 (아 지드 화 나트륨)의 독성이다. 이 화학 물질을 취급하기 전에 화학 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오.- 100 mM의 아 지드 화 나트륨 용액 100 ㎖을 1 N KOH 10 ㎖에 NaN의 3의 0.65 g의 추가합니다. 탈 이온수 100 ㎖의 최종 부피로 조정한다.
- 약 7.10 KOH를 사용하여 pH를 조절합니다.
- 다음 단계 5.4 10 mm로 최종 크레아틴 phosophate (CRP) 농도를 가지고 8 mM의 최종 ATP 농도와 충분한 나 2 CRP를 가져올 수있는 충분한 나 2 H 2 ATP를 추가합니다.
- 탈 이온수를 사용하여 500 mL의 최종 부피의 각 용액을 준비한다. 침착 또는 실험이 수행 될 때의 온도로 용액을 가열 한 후 가지고 KOH를 사용7.10 pH는 그 온도를 유지하면서.
- 최종 예비 활성화 액 500 미리 활성화 용액에 용액을 완화 한 부분은 사전 활성화 용액을 함유하는 용액을 비이커에 편안한 추가되도록. -80 ° C에서 2.5 ml의의 볼륨과 가게에서 나누어지는.
6. 봉합 루프를 확인
- 비 멸균 USP 10-0 모노 필라멘트 나일론 봉합사의 가닥로 시작합니다.
- 두 번 돌린 매듭 기법을 이용하여 가닥 루프를 만들기 위해 집게를 사용합니다. 약 750 μm의 직경 크기의 매듭을 줄일 수 있습니다. 루프 직경은 접안 렌즈의 눈금 표시를 사용하여 현미경으로 평가 될 수있다.
- 어느 한쪽 만 루프 작은 (500 μm의) 꼬리를 떠나 초과 봉합사를 제거하기 위해 가위를 microdissecting 사용합니다. 완성 된 루프의 예는도 1에 도시된다.
- 반복 6.2-6.3 4까지 가능한 루프가되었습니다 단계를 반복합니다. 쇼핑몰 실리콘 엘라스토머 도금 페트르에서 루프나는 향후 사용을 위해 요리.
참고 : 4 봉합 루프 테스트 모든 섬유 필요합니다.
7. 번들 샘플
참고 : 다음 단계는 단일 섬유가 결국 추출하여 테스트 할있는 작은 실험 '번들'로 원래의 샘플을 해부하는 절차를 설명합니다. 이 시점의 샘플을 조심스럽게 취급되어야한다. 이 설명의 목적을 위해, 명령들은 조사자 오른 손잡이 인 경우로 설명한다.
- 관심의 샘플을 확보하고 절개가 일어날 시설로 전송.
참고 : 조직 생검의 방법은 실험 모델과 연구 설계에 따라 달라집니다. 가능한 경우, 근육 관류는 조직 검사시까지 유지되어야한다. - 샘플이 수확 사이트와 해부 부위 사이에 전달 될 경우, 얼음에 유지하면서 냉각 해부 용액을 함유하는 바이알에 전송.
- 냉장 해부 솔루션과 2-3 곤충 장착 핀 (100 μm의 직경, 스테인레스 스틸)와 5cm 실리콘 엘라스토머 도금 배양 접시를 준비합니다.
- 접시에 샘플을 전송합니다. 샘플이 필요한 경우 더 해부 솔루션을 추가하여 침수 상태를 유지하는지 확인하십시오.
- 현미경으로 샘플을 검사하고 조사 (그림 2)의 오른쪽 어깨쪽으로 섬유의 길이 축 정렬을 조작 할 수 있습니다. 그런 코너 피닝하여 접시에 시료를 고정.
주 :이 표본 사용을 최대화 및 섬유의 무결성을 보존하기 때문에이 때 고정 점으로 남아있는 결합 조직을 사용한다. 다발 섬유 간 여백을 정의하는데 도움이되는 약간의 장력으로 고정 될 수있다. - 왼쪽 손에 집게 오른쪽에서 microdissecting 가위, 부드럽게 섬유 사이의 세로 가장자리를 따라 번들을 해부 시작
참고 :에 따라 그전체 길이는, 상기 다수의 작은 다발로 번들 해부. - 그 번들 치수는 폭 약 0.5 mm, 길이 ≥3 mm를 측정해야합니다. 또는 접시에서 통치자를 배치하여 접안 렌즈에 눈금 표시와 현미경을 사용하여 크기를 평가합니다.
- 제거하고 해부 프로세스의 결과로서 또는 집게 핀에 의해 손상되는 모든 조직을 버린다.
- 번들 충분한 수의 해부 또는 샘플이 소진 될 때까지 때까지 과정을 반복한다.
참고 : 크기와 초기 샘플의 상태, 근육의 형태, 그리고 연구자의 기술 등 다양한 요인에 따라 달라집니다 얻을 수 번들의 수.
8. Permeabilize 하시려면 섬유
- 비이 온성 세제 '브리지 (Brij) 58'신선한, 냉장, 해부 솔루션의 2.5 ml에 들어있는 유리 병에 해부 솔루션의 번들로 이동시켜 추가(0.5 %, W / V). 가끔, 부드러운 교반과 함께 30 분 동안 얼음에 품어. 번들 배양을 통해 침수 남아 있는지 확인합니다.
- 30 분 인큐베이션의 끝에, 신선한 해부 용액 (NO 브리지 (Brij) 58)를 함유 바이알에 번들을 전송하고 남은 세제를 제거하기 위해 부드럽게 간단히 교반.
9. 저장을위한 번들을 준비
- 냉장 스토리지 솔루션을 포함하는 유리 병에 번들을 전송하고 4 ℃에서 밤새 품어.
10. 스토어 번들
- 다음 날, 견딜 수있는 저장 상자를 준비 -80 ° C ~, 충분한 개인 0.5 ml의 해부 과정 (튜브 당 하나의 번들) 동안 얻은 모든 번들을 수용하기 위해 캡 원뿔 튜브 나사와 함께. 각 원뿔 튜브 신선한 스토리지 솔루션의 200 ~ 400 μL로 가득해야합니다.
- 개별적으로 표시 원뿔 튜브에 번들을 전송합니다. 번들이 붙어 있지 않은지 확인원추형 튜브 또는 용액의 표면에 부유 쪽. 원뿔 튜브 캡과 시험 날까지 -80 ° C에서 샘플을 저장합니다.
(11) 실험 장치를 준비합니다
참고 : 사용자 정의 장치는 길이 컨트롤러와 힘 변환기, 이동 챔버 시스템과 10 배 해부 현미경을 수용하는 단계로 구성되어있다. 마이크로 미터 드라이브 설치는 섬유 부착 표면을 정밀하게 조작 할 수 있습니다. 레이저 회절 패턴을 근절 길이를 추정하기 위해 사용된다. 실험을하는 동안 생성 된 데이터는 개인용 컴퓨터 상에 기록된다. 실험 장치의 주석 이미지 3을 참조하십시오.
- 한 유리 병 휴식, 사전 활성화 및 활성화 솔루션을 각각 해동 얼음에 유지한다. ATP와 CRP가 낮은 온도로 유지되어야한다 불안정한 화합물이 있습니다.
- 사용을위한 현미경, 시험 장치 및 관련 시스템을 준비합니다. 솔루션을 편안 하 게 첫 번째 실험 챔버를 입력합니다. 우리의 장치에있어서, 상기 제 1 챔버는 연구자가 측면에서 섬유를 촬영할 수 있도록 프리즘이 포함되어 있습니다. 사전 활성화 솔루션 및 솔루션 활성화와 세 번째와 두 번째 실험 챔버를 입력합니다.
- 에 실 온도계 표시가 15 ° C를 읽고 있도록 온도를 조정합니다. 스레드 힘 변환기 및 길이 제어기 (도 5a)로부터 연장 모두 스테인리스 부착면 상에 두 개의 준비된 봉합 루프.
12. 추출 투과성이 단일 섬유
- 관심의 섬유 다발을 해동, 신선한, 냉장 휴식 솔루션 실리콘 엘라스토머 도금 배양 접시에 전송합니다. 양쪽 끝에 핀 번들을 안전하고가 침수되어 있는지 확인합니다.
- 집게 사용 일단 섬유를 잡고 그 종축을 따라 원활하게 추출하기.
참고 :에 압축 손상을집게에 의한 섬유의 끝이 지역의 수축 특성을 테스트 할 수 없습니다 때문에이 시간에 문제가되지 않습니다. 섬유와 세포 외 기질 간의 유착이 과도한 긴장을 초래할 수 있기 때문에 궁극적으로 스트레칭에 의한 손상을 선도하고, 번들에서 섬유를 추출 할 때주의를, 그러나주의해야한다. 상당한 변화가 섬유가 주변 세포 외 기질에 부착하는 정도의 근육 사이에 존재합니다. 이러한 스트레칭에 의해 손상된 것으로 의심되는 섬유는 폐기해야합니다. - (도 4)에 나타낸 바와 같이 피펫 팁을 수정 면도날이나 외과 용 메스를 사용한다. 용액을 완화 소량과 함께 선단에 섬유를 소개. 편안한 솔루션을 포함하는 실험 챔버에 실리콘 엘라스토머 도금 배양 접시에서 단일 섬유를 전송합니다.
13. 마운트 단일 섬유
참고 : 단계별 depicti을에 그림 5에서 볼 수 있습니다.
- 집게로 부드럽게 안내, 피펫 팁으로부터 섬유를 제거하고 제 봉합 루프를 사용하여 길이 제어기 (왼쪽)에 고정.
- 집게로 루프를 조일 때 하나의 부드러운 모션을 사용합니다. 같고 방향이 반대 장력이 봉합의 양쪽 끝에 적용되어 있는지 확인합니다.
- 제 1 루프는 길이 제어기 부착면의 단부로부터 2mm로 약 1mm를 연결한다.
- (오른쪽)을 향해 강제 변환기 섬유의 타 단부를 조작하고 동일한 방법을 사용하여 섬유를 고정. microdissecting 가위 (그림 5C)를 사용하여 초과 봉합사를 제거합니다.
- x 좌표 마이크로 드라이브 (도 3a)을 사용하여 길이 제어기 및 힘 변환기 아암 사이의 거리를 증가시킴으로써 긴장 하에서 소량의 섬유를 배치.
- 첫 번째를 통해 두 번째 루프를 스레드 및 섬유 앵커강제 변환기 부착면 (도 5d)의 단부 0.2 mm 이내 시점.
- microdissecting 가위를 사용하여 초과 봉합사를 제거합니다.
- 섬유 부착 과정은 챔버로부터 용액의 손실을 초래할 수있다. 필요한 경우, 용액의 표면을 보장하기 위해 더 많은 여유로운 용액을 추가하여 평탄 (도 오목이나 볼록)이다. 레이저 회절을 사용하여 근절 길이를 평가할 때 평탄면이 중요하다.
- Y 축 방향의 길이 제어기의 위치를 조정함으로써, 실험 챔버의 측벽에 평행 한 섬유를 정렬.
- 프리즘 측면도를 사용하여 섬유를 조사 및 섬유가 챔버의 바닥과 평행이 될 때까지의 Z 축 방향의 길이 제어기의 위치를 조정한다.
주 : 상기 챔버의 바닥과 평행 한 섬유의 위치는 섬유 및 t의 일단에 제 포커스함으로써 프리즘 챔버없이 수행 될 수있다암탉, 현미경의 초점 조절의 Z 축 마이크로 드라이브를 사용하여 초점 파이버의 다른 쪽 끝을시키지 않고. - 섬유가 일그러 트위스트 또는 실장 공정의 결과로서 손상된 어떠한 방식 인 경우, 섬유는 폐기하고 새로운 섬유에 부착되어야한다.
14. 최적의 근절 길이
- 섬유가 올바르게 챔버 내에 배열되면, 현미경의 전방 측면 상에 보정 대상 화면을 삽입하고 제 실험을 통해 챔버에 정렬.
주 : 대상 화면 표준 격자 방정식을 사용하여 보정되어, λ = SL의 sinθ, SL이 근절 길이이고, θ는 0 °, 1 °의 회절 광선 및 λ 사이의 회절 각은 레이저의 파장이다. - 레이저의 전원을 켜고 레이저가 섬유의 중심을 통과하도록 스테이지의 위치를 조정합니다.
주의 : 농축 레이저 광은 T가 손상 될 수 있습니다시력 오. 레이저가 켜져있을 때 현미경을 통해 섬유를 시각화하지 마십시오. - (도 6) 레이저 광을 회절 및 교정 대상 화면에 간섭 두둑을 관찰하는 레이저 빔에 대하여 광섬유를 위치. 더 명확하게이 패턴을 시각화하기 위해 불을 끕니다.
주 : 레이저 빔의 정확한 위치와, 간섭 무늬가 보이지 않는다,하면이 섬유의 근원 섬유 성분이 손상 / 비정상임을 시사하고 섬유가 새로운 것으로 교체되어야한다. - 근절 길이 증가를 설정하거나 회절 광의 간격이 원하는 대상 화면에서 관찰 될 때까지 길이 제어기 X 축 마이크로 드라이브를 사용하여 섬유에 장력을 감소.
주 : 섬유의 최적 근절 길이 샘플을 얻었다되는 동물의 종에 따라 달라진다. 2.7 ㎛의 근절 길이는 보통 때 엉덩이가 최적 인 것으로 가정인간의 조직 7,8에서 섬유를 노래. - 최적 근절 길이가 설정되고 나면, 두 최 봉합 사이의 거리를 측정한다. 이것은 가장 쉽게 챔버의 X 축 움직임을 제어하는 마이크로 드라이브 디지털 판독을 사용하여 달성된다. 접안 렌즈의 수직 십자선이 안쪽 봉합의 안쪽 경계에 정렬되도록 챔버를 놓고 마이크로 미터 드라이브의 디지털 판독을 제로.
- 다른 최 봉합사에 도달 할 때까지 현미경, X 축 스테이지를 따라 상기 번역. 디지털 디스플레이가 섬유의 길이를 나타내는 것이다. 이 값은 섬유 길이, L의 F로 기록되어야한다.
주 :이 두 최 봉합 사이의 거리가 수축 조직의 기능이 평가되는 길이를 결정할 것을 이해해야한다. 수사관 내에서이 차원의 일관성 (즉 패 F)을 위해 노력한다실험의 시리즈.
(15) 추정 단면적 (CSA)
- L의 F에서 섬유를 유지하고 상부 및 측면도 둘 다에서 섬유의 중앙부의 고배율 이미지를 캡처 현미경에 장착 된 카메라를 사용한다. 사이드 뷰 이미지는 상기 챔버의 측면에 매립 프리즘을 사용하여 캡처 될 수있다.
주 : 상부 및 측면도 사이 시프트 때 두 이미지가 "레지스터"이고, 따라서 섬유의 동일한 부분의 두 개의 서로 다른 뷰를 표시하도록 단지 y- 방향으로 현미경을 이동하는 것이 중요하다. - 연구에 나중에 절대 힘을 정상화하기 위해이 시간에 측정을 얻습니다. 이러한 측정을 얻기위한 기술이 후술과도 7a 및도 7b에 도시되어있다.
(16) 유도 아이소 메트릭 수축
주 : 데이터는 이러한 실험시 발생하는 동안S 수거하고 힘 응답의 수집, 디스플레이, 저장 및 분석을 위해 유리하다 있도록 컴퓨터 소프트웨어의 사용없이 해석 될 수있다. 우리의 실험실에 의해 생성 된 사용자 정의 LabVIEW 소프트웨어는 이러한 기능뿐만 아니라 성능은 실험 기간 동안 길이 컨트롤러의 동작을 제어하는 '모션 열차'를 설계 할 수 있습니다.
- 휴식, 사전 활성화의 온도 것을 확인하고 활성화 솔루션은 15 ° C에서 안정적이다.
- 사전 활성화 함유 용액 챔버에 섬유를 놓고 3 분 동안 거기 배양 챔버 제어 소프트웨어를 사용한다.
참고 : 사전 활성화 솔루션은 약하게 활성화 용액에 섬유의 도입에 따라 매우 빠른 활성화와 힘 개발의 결과로, 칼슘에 대한 버퍼링된다. - 10 초 예비 활성제 용액 및 L f를 유지 섬유 길이에 잔존하여, 제로를 설정 FO실험 기록에 경찰과 수준.
주 : 컨트롤러의 길이 '찾기 포스 제로 운동은 제로 힘에 대응 힘 변환기 레벨 (즉, 섬유가 짧게 운동의 결과로서 느슨해 지는데) 드러낸다. 수동 힘은 제로 및 변환기 - 제로 움직임 직전 힘 레벨 간의 차이이다. - 3 분의 끝에서, 활성 용액을 포함하는 챔버에 섬유를 이동 급상승 앞에는 힘 고원 의해 입증되는 바와 같이, 최대 등축 힘 개발할 수.
- 아이소 최대 힘에 도달 한 후, 활성 용액을 함유 챔버에서 제로 힘에 대응 힘 변환기 출력을 식별하는 길이 제어기를 사용한다.
주 : 제로 힘에 대응 힘 변환기 출력은, 일반적으로, 각각의 용액 충전식 챔버 용 다르기 때문에 이것은 필요하다. - 두 번째 힘의 달성에 따라 PLateau, 휴식 함유 용액 챔버에 섬유를 반환한다. 테스트가 완료되었습니다. 어떤 하나의 세션 흡인 동안 모든 솔루션을 다수의 섬유를 테스트하고 새로운 냉각 솔루션을 추가합니다.
주의 : 연장 된 시간에 걸쳐 최대 수축을 유도하는 경우 브레너의 사이클링 프로토콜이 고려되어야한다. 이 프로토콜은 최대로 활성화 된 섬유 9 구조적 및 기계적 특성을 보존하기 위해 도시되었다.
Representative Results
건강, 화학적으로 투과성이 단일 섬유 모양의 유니폼을 표시하고 높은 배율에서 볼 때 일관성있는 줄무늬의 간격이 있어야합니다. 집게를 조작 할 때 유연 또는 명백한 구조적 손상이 섬유는 폐기해야합니다.
단계 15 동안 촬영 고배율 디지털 이미지는 섬유의 중간 부분을 따라 5 쌍의 직경 측정을 위해 분석된다. 섬유 CSA는 타원형 단면을 가정하고도 7a에 도시 된 바와 같이 5 개인 CSA 측정 값을 평균 추정된다. 그림 7b는 또한 하나의보기에 섬유 치수가 다른 뷰 (즉, 교차에 쌍으로 크기에 비해 상당히 다를 수 있습니다 방법을 설명하는 역할을한다 절) 일반적으로, 라운드, 아니다.
인간 느리고 빠른 섬유 대표 힘 트레이스는 각각도 8a 및도 8b에 나타낸다. Voltag강제 변환기의 E 출력 테스트 동안 획득 및 데이터 획득 및 분석 소프트웨어 (LabVIEW를) 이용 (MN)를 강제로 변환된다. (9) 도면은 감산함으로써 계산된다 최대 활성 힘 (F에서 O)을 평가하기 위해 사용되는 방식을 도시 최적의 근절 길이의 섬유를 유지하기 위해 필요한 힘 편안한 상태에있는 동안 (수동 힘, F, P), 최대 섬유 활성화 중에 개발 된 큰 아이소 메트릭 힘 (총 힘, F T)에서. 제로의 힘에 대응 힘 변환기의 출력 이후이며, 일반적으로 상이한 입욕 챔버들 각각에 대해 서로 다른, 우리는 잠시에 제로 - 힘 레벨을 캡처 미리 활성화 및 솔루션을 활성화 모두 섬유를 늦추지 실험 기록. 섬유 CSA에 의해 최대 활동력 정상화 특정 포스 (SF 오)의 더 많은 정보 값을 생성하는 데 사용됩니다. 이 고려 섬유의 CSA 걸리기 때문에, SF 오
일반적인 건강의 특성, 마우스 및 Gumucio 등을위한 Claflin 등. 2011 인간 10, Mendias 등. 2011 1 성인 섬유. 쥐 2012 년 2 표 3에 자세히 설명되어 있습니다. 사용하여 생성 된 표 3에 제시되는 모든 데이터 이 문서에서 설명하는 기술.
| 사람의 (광근 lateralis) | 쥐 (EDL) | 쥐 (하근) | ||||
| 남성 | 여자 | 남성 | 남성 | |||
| 유형 1 | 유형 2A | 유형 1 | 유형 2A | (입력하지 않음) | (입력하지 않음) | |
| CSA (μm의 2) | 4880-6900 | 5270-8380 | 3870-5470 | 4010-5610 | 1850-3080 | 5290-8010 |
| F 오 (MN) | 0.79-1.17 | 1.02-1.54 | 0.64-0.97 | 0.71-1.07 | 0.14-0.25 | 0.55-0.97 |
| SF 오 (kPa의) | 142-182 | 165-210 | 156-193 | 172-214 | 67-94 | 102-131 |
| N | 129 | (160) | 149 | (207) | (37) | (94) |
인간의 광근에서 건강한 성인 섬유의 표 3. 일반적인 특성 10 lateralis, 마우스 신근 심지 longus 1 쥐 하근은 2 근육. 최적의 근절 길이는 모두 마우스에 대한 인간의 섬유 7,8 2.7 μm의 2.5 μm의 (36에서 설정 한 37)와 쥐의 섬유 (38). 실험 패 F 범위 (25 일, 75 번째 분위)는 1.39-1.73 mm, 1.17-1.53 MM 각각 인간, 마우스 및 쥐에 대한 1.32-1.59 mm이다. 도시 된 범위는 25 번째와 75 번째 분위수를 나타내며 N 테스트 섬유의 수이다.
테스트 기간 동안 경험 한 가장 일반적인 문제는 힘 응 답 결과 봉합 루프 슬립을 포함도 10a에 도시 된 것과 같은 "캐치", 그리고 갑자기 방향 또는 (휴식)에 반환하는 힘으로 응답하는 섬유의 일부 또는 전체 두께 눈물 E 제로 섬유는 여전히 해결책을 활성화에 몰입하는 동안 (그림 10B). 슬립, 눈물 또는 브레이크가 실험 기간 동안 발생하는 경우, 섬유는 폐기되어야하고, 섬유 실패 레코드를 유지하는 것이 또한 유익 할 수있다 (11) 비록 데이터는 제외. 발생할 수있는 또 다른 부정적 결과는 동안 미리 활성화 액 (도 10C)에서 섬유의 조기 활성화이다. 사전 활성화 용액에 활성화 부분 (즉, 칼슘 농도의 증가에 잘 의도 미리 활성화) 상당한 교차 오염을 잘 보여준다. 이때, 모든 화장실 흡입되어야하고, 탈 이온수로 잘 헹구고. 챔버 사이에 분할 표면을 건조도 recommen입니다이 분야에서 습기 나 결로 등 DED는 화장실 사이의 솔루션의 심지가 발생할 수 있습니다. 결정은 포함하거나 데이터가 궁극적으로 실험 초점에 따라 달라집니다 및 연구를 설계 할 때 따라서 고려되어야한다 제외합니다.
그림 1 : 봉합 루프 (10-0 모노 필라멘트 나일론 봉합사).
그림 2 :. 번들 해부 집게가 왼쪽 손에은 미세 절제 가위는 오른쪽에 있습니다. 레드 라인은 섬유의 길이 방향 축이 손목과 가위의 유리한 방향을 나타냅니다.
그림 3 : (A) 검사 장치. () 투명 바닥과 실험 챔버. (b) 길이 제어기. (C) 포스 트랜스 듀서. (d) 광원. (E) 디지털 디스플레이와 길이 컨트롤러 XYZ 마이크로 미터 거리에 있습니다. 디지털 디스플레이 (F) 스테이지 마이크로 미터 거리에 있습니다. (G) 포스 트랜스 듀서 XYZ 마이크로 미터 거리에 있습니다. 교정 레이저 회절 대상 스크린 (H) 플랫폼. (I) 제진 테이블. (나) 실험 챔버의 근접 촬영보기. 길이 제어기로부터 연장 (j) 스테인리스 부착면. 강제 변환기로부터 연장 (K) 스테인리스 부착면. (L) 사이드 뷰 프리즘. 열전 냉각 모듈 (M) 주택. 보고 챔버 테에 대한 (N) 열전대mperature.
그림 4 : 실험 챔버로 해부 접시에서 섬유를 전송하는 데 사용 100 μL 피펫 팁을 수정.
도 5 :. 실험 장치에 단 섬유를 실장 (A)를 제조 봉합 루프는 스테인레스 스틸의 표면에 부착 나사. (B) 섬유는 실험 챔버로 옮겼다. (C) 섬유가 제거 과량 봉합 봉합 루프들의 제 한쌍 스테인리스 부착 표면에 고정. (D) 제 봉합 루프의 맨 위에 나사 제자리에 묶어 봉합 루프의 두 번째 쌍.
도 6 : 근절 길이 보정 대상 화면에 레이저 간섭 패턴의 돌출부에 의해 평가된다 (a) 레이저 광원.. (b)의 거울. (c) 목표 화면. (D) 레이저 간섭 패턴.
그림 7 : 최적의 근절 길이의 섬유 단면적 (A) 결정 (2.7 μm의 = 인간). 타원형 단면 가정, CSA 다섯 섬유의 중앙부를 따라 위치와 다섯 개의 개별 측정의 평균의 각 섬유 CSA로보고 계산됩니다. 도 2a는 평면도 직경을 나타내고있다 타원의 한 축은,도 2b는 측면도 입자경을 나타내는 타원의 다른 축이다. (B) 모두 상단 및 측면도에서 찍은 다섯 대응하는 직경 측정의 각 섬유를 나타내는 대표적인 이미지.
그림 8 : 건강한 인간 광근의 대표 힘의 흔적은 근육 섬유를 lateralis (1) 섬유 (CSA : 5710 μm의 2, F 오 : 0.89 Mn 및 SF 오 : 156 kPa의)를 입력합니다.. (: 9510 μm의 2, F 오 : 1.66 Mn 및 SF 오 : 174 kPa의 CSA) (B) (2A) 섬유를 입력합니다. 섬유 미오신 중쇄 타입 전기 영동 분리 및은 - 염색 기술 (22)의 사용을 통해 결정되었다.
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그림 9 : 최대 활성 힘 (F 오)의 계산 사전 활성화 용액에 시작 길이 컨트롤러의 여유 유도 운동하는 동안 섬유 힘 응답 () 확장보기.. F P는 휴지 섬유와 2.7 ㎛의 근절 길이를 유지하는 데 필요한 힘이다. (b)는 길이 컨트롤러 여유 유도 운동의 확장 된보기. F P - 그 F 오 = F (T)를 참고.
그림 10 : 힘의 상승하는 동안 힘 추적에 "캐치"에 의해 입증 (A) 봉합 루프 슬립. 확인 루프 섬유를 활성화하기 전에 안전으로 확인합니다. 활성화시 (B) 섬유 휴식. 봉합 루프 장소 중에 가난한 섬유 무결성 또는 공격적인 섬유 몸싸움으로 할 수 있음, 표준. 때문에 칼슘과 사전 활성화 챔버의 오염 (C) 조기 부분 섬유 활성화 2+.
Discussion
투과성이 하나의 골격근 섬유의 수축 특성의 평가는 광범위한 맥락에서 근육 기능을 조사하기 위해 사용된다. 예를 들면 노화 (12)의 효과를 평가 한 연구, 10,13,14 운동, 우주 비행 15, 부상 2,3,16, 약물 치료 17, 18, 질병 (19)과 섬유의 구조와 기능에 유전자 조작 (20, 21)를 포함한다. 때문에 직접 자신의 고유 구성에 근원 섬유의 수축 성능을 평가하는 능력,이 기술은 존재하는 잠재적 교란 효과의 근원 섬유 기능의 부재에 대한 이해를 형성하기에서 매력적인 플랫폼을 제공 할 때 신경 근육 신호 전송 및 여기에 의한 칼슘 방출 연구 대상 시스템에 포함되어 있습니다. 또한, 단 섬유의 기능 시험은 이러한 것과 수축성 단백질 식별 결과를 보완하기 위해 사용될 수있다면역 조직 화학 또는 겔 전기 + 웨스턴 블롯 (22)를 통해 얻을.
골격근의 주요 기능 중 하나는 힘을 발생하는 것이다. 따라서 SF 오, 수축 시스템의 본질적인 힘 생성 능력의 측정, 근육 생리학에 중대한 관심사이다. SF 오의 신뢰성 평가는 섬유 CSA와 F 오 양의 정확한 측정이 필요합니다. 섬유이기 때문에 CSA를 추정 할 때, 일반적으로, 그 길이를 따라 단면적도 단면 원형 없으며, 유니폼, 큰주의를 기울여야합니다. 이를 위하여, 측정은 90 °로 분리 된 두 가지 관점에서, 각 위치에서, 섬유의 길이를 따라 여러 위치에서 실시하고있다. F 오 신뢰성 대책 칼슘 농도 t와 활성 용액을 이용하는, 두껍고 얇은 필라멘트의 오버랩을 최대화하기 근절 길이를 조정하는, 수동적 인 힘 차지 등 여러 세부 사항에주의를 필요최대 활성화 모자 결과, 원하는 실험 온도를 유지하고, 실험 하루 전에 섬유의 최적 보관 조건 (온도 및 시간)을 유지.
여기에 설명 된 단계는 최대 메트릭 힘을 평가하기위한 절차를 설명하는 반면, 골격근 섬유의 다른 중요한 기능적인 특성을 평가하기 위해 종종 바람직하다. 이것은 섬유의 기계적 조작을 추가로 포함하는 실험 프로토콜을 확장함으로써 달성 될 수있다. 예를 들어, 섬유는 상이한 부하에 대해 일련의 단축되는 속도의 측정 력 파워와 속도 파워 10,23,24 관계를 산출 할 수있는 힘의 속도 관계의 판정을 허용한다. 또한, 언로드 된 쇼트닝의 속도는 슬랙 유도 단축 단계 및 measuri 일련인가 이루어져 "슬랙 테스트"(25)을 이용하여 결정될 수있다섬유에 의해 요구되는 시간은 ng를 슬랙을 제거한다. 자주보고 또 다른 운동 매개 변수는 K TR, 일시적으로 모두 분리 기계 섭동 다음 힘 재개발에 대한 속도 상수 (26) crossbridges입니다. 마지막으로, 칼슘 농도 및 활성 구동력 발생 ( "힘 PCA 관계") 사이의 관계는 관심 18 종종이고 임계치 아래에서 수축을 활성화하기위한 레인 징 칼슘 농도 용액의 일련의 광 노출에 의해 결정될 수있다 그 충분한에 시스템은 최대 활성화 따라서 최대 힘 (F O를) 유도합니다.
언급 된 장비의 대부분이 단일 섬유 수축력을 평가하기위한 필요하지만, 다른 장비가 절대적으로 필요하지 않습니다. 길이 제어부는, 예를 들어, 섬유의 신속한 또는 정확한 연장 또는 단축이 필요한 실험 프로토콜에 필수적인하지만 (힘 레코드의 제로 힘 수준이 여전히 몇 가지 방법으로 확인해야하지만) 최대 아이소 메트릭 힘을 평가하는 절대적으로 필요하지 않습니다. 실험 챔버 내에 섬유를 배치 할 때, 단면 영역을 평가하는 동안 유용한 측으로부터 섬유의 관찰을 허용 프리즘은, 반드시 필요하지 않다. 또한, 다른 대안은 챔버 또는 급속 충전을 가능하게 단일 챔버의 수동식 시스템 고안 및 솔루션 비우는 포함한 사용될 수있는 다양한 실험 용액에 섬유를 노출하기위한 수단을 포함한다. 예컨대 15 ° C로서 서브 생리 실험 온도는 일반적으로 기계적 1,2,3,5,8,12,17,27 측정의 재현성을 향상시키기 위해 사용하는 동안 마지막으로, 다른 온도 23 유효 데이터를 생성 할 수있다 솔루션의 특성에 대한 온도 (칼슘 농도, 산도 등)의 영향으로 28 한 고려된다. 시험 용액의 조성물은 여기에 기재된 광 투과성이 기술의 가장 중요한 측면들이다. 용액 조성물에 관한 고려가 복잡하고이 문서의 범위를 벗어납니다. 프로토콜 섹션의 5 단계에서 설명하는 솔루션은 일정한 이온 강도, 양이온 성분 및 삼투압 6,29을 유지하면서 솔루션을 활성화로 미리 활성화로부터 전송시 투과성이 섬유의 빠른 활성화에 중점을두고 설계되었습니다. 용액 조성물에 다른 방법은 다른 연구 그룹에서 주목할만한 성공을 사용하고 일반적으로 공개 바인딩 상수 및 계산 도구 27,30,31 활용되어왔다. 다양한 활성화 용액에 칼슘 이온의 농도는 힘 - PCA 평가로서 준 최대 활성화와 관련된 연구에 중요하다. 이러한 것과 같은 섬유가 완전히 활성화되는 실험 들어 설명D 여기서, 활성 용액 중의 칼슘 농도는 통상적으로 그것의 정확한 지식은 덜 중요하게, 최대 힘을 달성하기 위해 필요한 마진에 의해 편안하게 초과한다. 크레아틴 인산의 첨가는 달리 수축 활성과 연관 될 것이다 intramyofibrillar ATP와 ADP의 변동을 버퍼링 중요하다. 크레아틴 키나제가 ADP에 크레아틴 인산으로부터 포스페이트 전달을 촉진 할 필요가있다. 고온에서 작동 또는 빨리 섬유 (32)에 고속 단축 측정 포함한 높은 ATP 회전율, 결과 실험 조건 하에서, 크레아틴 키나제는 섬유에 결합 된 유지 내인성 크레아틴 키나아제를 보충 용액에 첨가되어야한다. 덜 까다로운 실험 조건 들어, ATP 재생 시스템 (27)은 덜 중요하다.
투과성이 단일 섬유 기술의 한계는 다음과 같습니다. 이러한 테스트에 의해 생성 된 데이터를 정의실험 장치에 부착 된 특정 근원 섬유 단위의 수축 특성. 따라서,이 세그먼트는 차례로, 근육 내의 섬유의 총 수의 작은 부분을 나타내는, 수득되는 다핵 섬유 전체의 단지 작은 부분을 캡처한다. 수사관들은 이렇게 조심스럽게 실험에서 도출 결론을 지원하는 데 필요한 샘플링을 고려해야한다. 또한, 섬유의 기능에 대한 운동 교육 개입의 영향을 평가하는 것은 평가 섬유가 실제로 훈련 기간 동안 모집 있다고 가정합니다. 프로토콜은 섬유의 천연 세포 내 환경을 모방하려고하지만, sarcolemma의 투과성으로 공정은 비특이적이고, 반드시 수용성 세포 성분 자유롭게 입욕 용액 내로 확산 할 수있다. 막 투과성의 또 다른 결과는 섬유 볼륨 (33)의 팽창에 의해 입증 삼투압 균형의 변화이다.섬유 팽윤 myofilament 시스템 34,35 감소 된 칼슘 민감성 결과 액틴과 미오신 필라멘트 사이의 거리를 증가 시키지만, 큰, 삼투 적으로 활성 인 화합물 (34)의 도입에 의해 역전 될 수있다. 고려하는 최종 제한 실험 장치에 섬유를 부착하는 데 사용되는 기술의 결과이다. 이것은 불변 기능적 결손 참석과, 부착 지점에서와 근처 필라멘트 시스템 내의 공간적 관계 왜곡 요구한다. 구체적으로는, 상기 광섬유와 연결 지점에 인접하는 영역의 기능적 손상되고 이에 의해 측정 시스템에 인공적 시리즈 탄성 기여한다.
요약하면, 우리는 시험관 내에서 화학적으로 투과성이 골격근 섬유의 힘 발생 능력을 평가하는 방법을 설명 하였다. 이 기사의 초점은 최대 아이소 메트릭 힘 generatin의 평가되었지만인간 골격근 섬유의 g 용량은, 실험 방법은 변성 및 종, 또는 다른 포유 동물의 범위에 걸쳐 운동 파라미터와의 관계를 결정하는 데 다양한 확장 될 수있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
| 0.5 ml screw cap microcentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
| 0.5 ml microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
| Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
| Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
| Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
| LabVIEW software | National Instruments | - | |
| Computer | Varied | - | |
| Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
| Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
| Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
| Reagents | |||
| K-proprionate | TCI America | P0510 | |
| Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
| MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
| EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
| HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| KOH (1 N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
| HCL (1 N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
| Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
| pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 | |
References
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