रासायनिक चमड़ी, या permeabilized, कंकाल की मांसपेशी फाइबर के सिकुड़ा गुणों का विश्लेषण एक मांसपेशी कोशिका के स्तर पर मांसपेशी समारोह का आकलन करने के लिए है जिसके द्वारा एक शक्तिशाली साधन प्रदान करता है। इस लेख में हम तैयार करने के लिए एक वैध और विश्वसनीय तकनीक की रूपरेखा और परीक्षण के लिए इन विट्रो में कंकाल की मांसपेशी फाइबर permeabilized।
Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.
कंकाल की मांसपेशी का प्राथमिक कार्य बल उत्पन्न करने के लिए है। स्नायु बल मोटर तंत्रिका कार्रवाई क्षमता, neuromuscular संचरण, मांसपेशी फाइबर कार्रवाई क्षमता, intracellular कैल्शियम की रिहाई, और विनियामक और सिकुड़ा प्रोटीन की प्रणाली की सक्रियता भी शामिल है कि घटनाओं की एक जटिल दृश्य के माध्यम से विवो में हासिल की है। बल पीढ़ी इस क्रम का अंतिम परिणाम है, क्योंकि सेना में एक घाटे अलग अलग चरणों में से एक या अधिक की विफलता की वजह से हो सकता है। Permeabilized फाइबर तैयार करने की एक प्रमुख विशेषता यह myofibrillar तंत्र शेष के साथ जुड़े केवल विनियामक और सिकुड़ा कार्यों के साथ, विवो में बल पीढ़ी के लिए आवश्यक कदम का सबसे समाप्त करता है। अन्वेषक कैल्शियम और ऊर्जा (एटीपी) को सक्रिय करने के वितरण पर नियंत्रण मान लिया गया है, और उनके देशी सह में पृथक विनियामक और सिकुड़ा संरचनाओं के मूल्यांकन की अनुमति देता है कि एक सरल प्रणाली के साथ पुरस्कृत किया हैnfiguration। Vivo में मनाया मांसपेशी समारोह में परिवर्तन का आकलन करते समय permeabilized कंकाल की मांसपेशी फाइबर का उपयोग बल की माप इस प्रकार मूल्यवान हैं। उदाहरण के लिए, हम Myostatin चूहों की कमी 1 से तंतुओं के बल पैदा करने की क्षमता चिह्नित करने के लिए और पुरानी रोटेटर कफ आँसू 2,3 निम्नलिखित का प्रदर्शन लगातार मांसपेशियों में कमजोरी के कारण आकलन करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है।
आधुनिक permeabilized फाइबर कार्यप्रणाली जल्दी प्रभावशाली पढ़ाई 4,5 का पता लगाया और अनुसंधान समूहों की एक संख्या से वर्तमान में उपयोग में किया जा सकता है। तकनीक साहित्य में वर्णित किया गया है, वे अभी तक वीडियो प्रारूप में प्रस्तुत नहीं किया गया है। इस अनुच्छेद के लक्ष्य रासायनिक permeabilized कंकाल की मांसपेशी के नमूनों से एकल फाइबर की अधिकतम शक्ति पैदा करने की क्षमता को मापने के लिए एक अद्यतन, वैध और विश्वसनीय तकनीक को वर्णन करने के लिए है। यह एक के रूप में संदर्भित एक व्यक्ति फाइबर खंड (पूरा करने के लिए ̶0; फाइबर ") तंतुओं के एक पूर्व permeabilized बंडल से निकाला जाता है और एक आराम समाधान युक्त एक प्रायोगिक कक्ष में रखा गया है, परिभाषित विशेषता जिसमें से 10 <एनएम है कि एक कैल्शियम एकाग्रता है। फाइबर फिर एक बल ट्रांसड्यूसर करने के लिए एक अंत में और एक की लंबाई-नियंत्रक करने के लिए दूसरे छोर पर जुड़ा हुआ है। एक इष्टतम sarcomere लंबाई में आयोजित फाइबर के साथ, यह अधिकतम सक्रियण और इस तरह अधिकतम isometric संकुचन बल को प्रकाश में लाना करने के लिए पर्याप्त कैल्शियम की एकाग्रता है कि एक सक्रिय समाधान के लिए स्थानांतरित किया है। सेना के डेटा का अधिग्रहण कर लिया संग्रहीत और एक पर्सनल कंप्यूटर का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं।
Permeabilized एक कंकाल की मांसपेशी फाइबर की सिकुड़ा गुणों का आकलन संदर्भों की एक विस्तृत विविधता में पेशी समारोह की जांच के लिए किया जाता है। उदाहरण उम्र बढ़ने 12 के प्रभाव का मूल्यांकन किया है कि अध्ययन, 10,13,14 व्यायाम, अन्तरिक्ष उड़ान 15, चोट 2,3,16, दवा उपचार 17,18, रोग 19 और फाइबर संरचना और समारोह पर आनुवंशिक हेरफेर 20,21 शामिल हैं। कारण सीधे उनके मूल विन्यास में myofibrils की सिकुड़ा के प्रदर्शन का आकलन करने की क्षमता के लिए, इस तकनीक मौजूद हैं जो संभावित confounding प्रभाव के myofibrillar समारोह अनुपस्थित की समझ के फार्म जहाँ से एक आकर्षक मंच प्रदान करता है, जब न्यूरोमस्कुलर संकेत संचरण और उत्तेजना प्रेरित कैल्शियम रिलीज अध्ययन के तहत प्रणाली में शामिल कर रहे हैं। इसके अलावा, एकल फाइबर के कार्यात्मक परीक्षण ऐसे लोगों के रूप में सिकुड़ा प्रोटीन की पहचान के परिणामों के पूरक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैimmunohistochemistry या जेल वैद्युतकणसंचलन + पश्चिमी धब्बा 22 के माध्यम से प्राप्त की।
कंकाल की मांसपेशी के प्राथमिक कार्यों में से एक बल उत्पन्न करने के लिए है। नतीजतन एस एफ ओ, एक सिकुड़ा प्रणाली के आंतरिक बल पैदा करने की क्षमता का एक उपाय है, मांसपेशियों physiologists के लिए महान ब्याज की है। एस एफ ओ की विश्वसनीय अनुमान फाइबर सीएसए और एफ ओ दोनों का सटीक उपाय की आवश्यकता है। तंतुओं के बाद से सीएसए का आकलन करते हैं, सामान्य रूप में, अपनी लंबाई के साथ सीएसए में न तो पार अनुभाग में परिपत्र, और न ही वर्दी, महान ध्यान रखा जाना चाहिए। यह अंत करने के लिए, माप 90 डिग्री से अलग किए गए दो दृष्टिकोण से, प्रत्येक स्थान पर, फाइबर की लंबाई के साथ कई स्थानों पर किया जाता है और कर रहे हैं। एफ ओ के विश्वसनीय उपायों एक कैल्शियम एकाग्रता टी के साथ एक सक्रिय समाधान को रोजगार, मोटी और पतली तंतुओं की ओवरलैप को अधिकतम करने के sarcomere लंबाई का समायोजन, निष्क्रिय बल के लिए लेखांकन सहित कई विवरण के लिए ध्यान देने की जरूरतअधिक से अधिक सक्रियण में टोपी परिणाम, वांछित प्रयोगात्मक तापमान बनाए रखने, और प्रयोग के दिन से पहले तंतुओं का इष्टतम भंडारण की स्थिति (तापमान और अवधि) को बनाए रखने।
यहां बताए गए चरणों अधिकतम सममितीय बल के मूल्यांकन के लिए प्रक्रिया का वर्णन है, यह कंकाल की मांसपेशी फाइबर के अन्य महत्वपूर्ण कार्यात्मक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए अक्सर वांछनीय है। इस फाइबर की अतिरिक्त यांत्रिक जोड़तोड़ शामिल करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का विस्तार करके प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फाइबर अलग भार की एक श्रृंखला के खिलाफ shortens जिस गति की माप के बल-शक्ति और वेग बिजली रिश्तों 10,23,24 गणना की जा सकती है जहाँ से बल-वेग रिश्ता है, का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, उतार छोटा करने की गति सुस्त उत्प्रेरण छोटा कदम है और measuri की एक श्रृंखला को लागू करने से मिलकर बनता है जो "सुस्त परीक्षण" 25, रोजगार से निर्धारित किया जा सकताफाइबर द्वारा अपेक्षित समय एनजी सुस्त दूर करने के लिए। अक्सर सूचना दी है कि एक और गतिज पैरामीटर कश्मीर टी.आर., अस्थायी रूप से सभी detaches कि एक यांत्रिक गड़बड़ी निम्नलिखित बल पुनर्विकास के लिए दर लगातार 26 crossbridges है। अंत में, कैल्शियम एकाग्रता और सक्रिय बल पीढ़ी ("बल-पीसीए रिश्ता") के बीच के रिश्ते ब्याज 18 से अक्सर है और सीमा से नीचे से सिकुड़ा को सक्रिय करने के लिए लेकर कैल्शियम सांद्रता के साथ समाधान की एक श्रृंखला के लिए फाइबर उजागर द्वारा निर्धारित किया जा सकता उन पर्याप्त करने के लिए सिस्टम अधिकतम सक्रियण और इसलिए अधिक से अधिक बल (एफ ओ) को प्रकाश में लाना।
उल्लेख किया उपकरणों की ज्यादा एकल फाइबर सिकुड़ना का आकलन करने के लिए आवश्यक है हालांकि, अन्य उपकरण बिल्कुल जरूरी नहीं है। लंबाई-नियंत्रक, उदाहरण के लिए, फाइबर का तेजी से या सटीक लंबी या छोटा करने की आवश्यकता है कि किसी भी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक हैलेकिन (बल रिकॉर्ड में एक शून्य बल स्तर अभी भी कुछ भी तरह से पहचान की जानी चाहिए, हालांकि) अधिकतम सममितीय बल के मूल्यांकन के लिए बिल्कुल जरूरी नहीं है। प्रायोगिक कक्ष के भीतर फाइबर स्थिति है, जब पार के अनुभागीय क्षेत्र का आकलन करने के लिए, जबकि उपयोगी तरफ से फाइबर के अवलोकन की अनुमति है कि प्रिज्म, बिल्कुल आवश्यक नहीं कर रहे हैं। इसके अलावा, वैकल्पिक कक्षों या तेजी से भरने के लिए अनुमति देता है कि एक एकल कक्ष के एक मैन्युअल रूप से संचालित प्रणाली तैयार करने और समाधान के खाली करने सहित, नियोजित किया जा सकता है विभिन्न प्रयोगात्मक समाधान के लिए फाइबर को प्रकाश में लाने के लिए इसका मतलब है। इस तरह के 15 डिग्री सेल्सियस के रूप में उप-शारीरिक प्रयोगात्मक तापमान आमतौर पर यांत्रिक माप 1,2,3,5,8,12,17,27 के reproducibility में सुधार करने के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि अंत में, यह अन्य तापमान 23 पर मान्य डेटा उत्पन्न करने के लिए संभव है , समाधान गुणों पर तापमान (कैल्शियम एकाग्रता, पीएच, आदि) के प्रभाव के रूप में 28 के रूप में लंबे समय को ध्यान में रखा जाता है। </p>
परीक्षण समाधान की रचनाओं यहाँ वर्णित permeabilized फाइबर तकनीक का सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक हैं। समाधान संरचना के बारे में विचार जटिल और इस लेख के दायरे से बाहर हैं। प्रोटोकॉल खंड के चरण 5 में वर्णित समाधान की एक निरंतर आयनिक शक्ति, cationic संरचना, और परासारिता 6,29 बनाए रखते हुए समाधान को सक्रिय करने के लिए पहले से सक्रिय करने से अपने स्थानांतरण पर permeabilized फाइबर का तेजी से सक्रियण पर जोर देने के साथ डिजाइन किए हैं। समाधान रचना के लिए अन्य तरीकों अन्य अनुसंधान समूहों द्वारा उल्लेखनीय सफलता के साथ कार्यरत हैं और आम तौर पर प्रकाशित बंधन स्थिरांक और कम्प्यूटेशनल उपकरण 27,30,31 का उपयोग करने के लिए किया गया है। विभिन्न सक्रिय समाधान में कैल्शियम आयनों की सांद्रता में इस तरह के बल-पीसीए के मूल्यांकन के रूप में submaximal सक्रियण शामिल अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इस तरह के रूप में उन तंतुओं को पूरी तरह से सक्रिय कर रहे हैं, जिसमें प्रयोगों के लिए का वर्णनडी यहां सक्रिय समाधान में कैल्शियम एकाग्रता आम तौर पर इसकी सटीक ज्ञान कम महत्वपूर्ण है, जिससे अधिकतम शक्ति को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है कि एक आरामदायक अंतर से अधिक है। Creatine फॉस्फेट के अलावा अन्यथा सिकुड़ा गतिविधि के साथ संबद्ध किया जाएगा कि intramyofibrillar एटीपी और ADP उतार चढ़ाव buffering के लिए महत्वपूर्ण है। Creatine kinase ADP के लिए creatine फॉस्फेट से फॉस्फेट हस्तांतरण को उत्प्रेरित करने के लिए आवश्यक है। उच्च तापमान पर काम कर रहा है या तेजी से तंतुओं 32 में उच्च गति छोटा मापने सहित उच्च एटीपी कारोबार दरों में होने वाली प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, creatine के काइनेज फाइबर के लिए बाध्य बनी हुई है कि अंतर्जात creatine के काइनेज पूरक करने के लिए समाधान के लिए जोड़ा जाना चाहिए। कम मांग प्रयोगात्मक शर्तों के लिए, एटीपी उत्थान प्रणाली 27 कम महत्वपूर्ण है।
Permeabilized एकल फाइबर तकनीक की सीमाओं में निम्नलिखित शामिल हैं। इन परीक्षणों द्वारा उत्पन्न डेटा को परिभाषितप्रयोगात्मक तंत्र से जुड़ा था कि विशिष्ट myofibrillar इकाई के सिकुड़ा गुण। नतीजतन, इस सेगमेंट बारी में, मांसपेशियों के भीतर फाइबर की कुल संख्या का एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व करता है, जो प्राप्त किया गया था, जहां से पूरे multinucleated फाइबर का केवल एक छोटा सा अंश कब्जा। जांचकर्ता इस प्रकार ध्यान से प्रयोगों से तैयार की किसी भी निष्कर्ष का समर्थन करने के लिए आवश्यक नमूने पर विचार करना चाहिए। इसके अतिरिक्त, फाइबर समारोह पर एक व्यायाम प्रशिक्षण के हस्तक्षेप के प्रभाव के मूल्यांकन का मूल्यांकन तंतुओं वास्तव में प्रशिक्षण के दौरान भर्ती किया गया है कि मान लिया जाता है। प्रोटोकॉल फाइबर की प्राकृतिक इंट्रासेल्युलर परिवेश की नकल करने का प्रयास करता है, sarcolemma permeabilization प्रक्रिया गैर विशिष्ट है और जरूरी घुलनशील इंट्रासेल्युलर घटक स्वतंत्र रूप से स्नान समाधान में फैलाना करने देता है। झिल्ली पारगम्यता का एक और परिणाम फाइबर की मात्रा 33 में सूजन इसका सबूत आसमाटिक संतुलन में एक परिवर्तन है।फाइबर सूजन myofilament प्रणाली 34,35 के कम कैल्शियम संवेदनशीलता में जिसके परिणामस्वरूप actin और मायोसिन filaments के बीच की दूरी बढ़ जाती है, लेकिन बड़े, osmotically सक्रिय यौगिकों 34 के लागू होने से उलट हो सकता है। विचार करने के लिए एक अंतिम सीमा प्रयोगात्मक उपकरण को तंतुओं संलग्न करने के लिए प्रयोग किया जाता तकनीक का परिणाम है। यह हमेशा कार्यात्मक घाटे में भाग लेने के साथ, लगाव अंक पर और पास रेशा प्रणाली के भीतर स्थानिक संबंध विकृत आवश्यकता है। विशेष रूप से, पर फाइबर और लगाव अंक के निकट के क्षेत्रों कार्यात्मक समझौता कर रहे हैं और इस तरह की माप प्रणाली के लिए artifactual श्रृंखला लोच योगदान करते हैं।
सारांश में, हम इन विट्रो में रासायनिक permeabilized कंकाल की मांसपेशी फाइबर के बल पैदा करने की क्षमता का आकलन करने के लिए है जिसके द्वारा एक साधन का वर्णन किया है। इस लेख का ध्यान अधिकतम सममितीय बल generatin के मूल्यांकन पर किया गया हैमानव कंकाल की मांसपेशी फाइबर के छ क्षमता, प्रयोगात्मक दृष्टिकोण संशोधित और प्रजातियों, स्तनधारी या अन्यथा की एक सीमा के पार गतिज मापदंडों और रिश्तों की एक किस्म का निर्धारण करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.
Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
0.5 mL screw cap micocentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
LabVIEW software | National Instruments | – | |
Computer | Varied | – | |
Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
Reagents | |||
K-proprionate | TCI America | P0510 | |
Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
KOH (1N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
HCL (1N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 |