Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Engineering

Surface Enhanced Raman Spec detektion av biomolekyler Använda EBL Fabricated nanostrukturerade Substrat

doi: 10.3791/52712 Published: March 20, 2015

Abstract

Tillverkning och karakterisering av konjugerade nano biologiska system gränssnitt metalliska nanostrukturer på fasta underlag med immobiliserade biomolekyler rapporteras. Hela sekvensen för relevanta försökssteg beskrivs, som inbegriper tillverkning av nanostrukturerade substrat med användning av elektronstrålelitografi, immobilisering av biomolekyler på substraten, och deras karakterisering utnyttjar ytförstärkt Raman-spektroskopi (SERS). Tre olika utformningar av nano biologiska system används, inklusive protein A, glukos bindande protein, och en dopamin bindande DNA aptamer. I de två senare fallen, bindningen av respektive ligander, D-glukos och dopamin, ingår också. De tre typer av biomolekyler immobiliseras på nanostrukturerade substrat genom olika metoder, och resultaten av SERS avbildning rapporteras. Funktionerna i SERS att upptäcka vibrationslägen från ytan-immobiliserade proteiner, samt att fånga protein liganden ettd aptamer-ligand bindning demonstreras. Resultaten illustrerar också påverkan av ytan nanostrukturer geometri, biomolekyler immobilisering strategi, Raman aktiviteten hos molekylerna och närvaron eller frånvaron av den ligandbindande på SERS-spektra förvärvas.

Introduction

Möjligheter att utveckla och karakterisera konjugerade nano biologiska system gränssnitt fasta nanostrukturer och biologiska polymerer blir allt viktigare att ytterligare framsteg inom nästa generations bio analys och bio-manövreringsteknik 1,2. Detta innebär tvärvetenskapliga studier över ett antal forskningsområden, såsom tillverkning av relevanta solid state komponenter (mikro eller nanoelektroder, nanotekniska beläggningar, nanotrådar, eller nanopartiklar) 2,3,4; immobilisering av biomolekyler på ytorna för att skapa önskade biokonjugat 5,6,7; och övervakning nano biologiska gränssnitt 1. I de flesta fall är valet av optimal tillverkning, bio-funktion och karakteriseringsmetoder starkt interrelaterade. Tydligt, skulle valet av nanotillverkningstekniker drivas av kraven för de halvledarkomponenterna i systemet, att vara i hög grad beroende av den detektionsmetod som i turn bestäms av vilken typ av biopolymerer inblandade och i syfte att övervaka gränssnittet.

Av en bred variation av tekniker som används för att karakterisera Bioconjugate system 1,3, yta förbättrad Raman spektroskopi (SERS) har vuxit fram som en mycket lovande metod för att upptäcka kemiska och biologiska arter på ytor 8,9,10,11. SERS sysselsätter inelastisk spridning av monokromatiskt ljus med utanpå immobiliserade biomolekyler (Figur 1) tillåter fångst av unika signaturer som motsvarar molekylära vibrationer. Denna förmåga att skilja mellan olika molekyler utan att involvera etiketter, komplex kemi, eller tidskrävande steg, gör SERS en potentiellt mycket effektiv metod för biologisk upptäckt. En annan viktig fördel med SERS är dess höga känslighet. Den excitation av lokaliserade ytplasmoner av ljus interagerar med ädelmetallnanostrukturer (SERS substrat) ökar dramatiskt intensity av Ramanspridning av analyten, vilket tillåter detektering av mycket små mängder av molekyler, från monoskikt ner till den enda molekyl gräns 8,9,10,11. Slutligen flesta biomolekyler kräver vattenlösningar för att vara stabil. Eftersom vatten har ofta begränsad Raman aktivitet, är bakgrundssignalen från vatten prover minimeras 9. Tillämpningar av SERS har uppvisat en exponentiell ökning under det senaste decenniet 10. Dock är ett mycket omdiskuterat utmaning SERS att den elektromagnetiska förbättringen av Ramanspridning är kritiskt beroende av storlek, form, och avståndet mellan metallnanostrukturer där plasmoniska vågor induceras 11,12,13. För att åstadkomma effektiva och reproducerbara SERS mätningar, kontroll över substratgeometri krävs vid nanodimensioner.

Figur 1
Figur 1. Scheme av ytförstärkt Ramanspektroskopi.

Många metoder som används för att tillverka SERS substrat 11,12,13 kan grovt delas in i bottom-up och top-down metoder. Metoder för den första typen använder olika processer av självsammansättning eller riktad kemisk syntes för att producera nanostrukturer. Ofta behandlas exempel inkluderar immobilisering av monodispersa nanopartiklar på fasta underlag 11,12,13, termisk, spotta, eller elektrokemisk avsättning av uppruggade metallfilmer 11,12, och olika kemiska syntesmetoder 13. Även sådana tekniker tenderar att vara relativt enkelt och billigt, de flesta av dem utmanas av en brist på kontroll över placeringen av strukturerna, och begränsade urvalet till prov reproducerbarhet.

Däremot top-down litografitekniker anställa hanterbart instrument såsom partikelstrålar för att skapa önskade mönster på ytor. En av de mest oftananolitografi metoder, elektronstrålelitografi (EBL), erbjuder superb kontroll över funktioner ner till under 10 nm och även en flexibilitet för att möjliggöra olika substrat mönster på fasta underlag 11,12. I EBL, en stråle av elektroner fokuseras ner till en fläck av några nanometer i avsökningar diameter över en yta av en elektronkänsligt material (resist) som orsakar en kemisk förändring i exponerade områden. För positiv ton motstår såsom polymetylmetakrylat (PMMA), elektronstråle exponering resulterar i klyvning av polymerkedjorna som utgör resisten, vilket leder till en ökad löslighet i ett lämpligt lösningsmedel (framkallare). Processen med elektronstrålelitografi inkluderar spinnbeläggning av ett enhetligt skikt av resist på ett substrat; exponering av den målinriktade resistmaterialet i en vakuumkammare med en elektronstråle; och utveckling av provet för att avlägsna de lösliga regionerna.

Dielektriska stöd underifrån metalliska nanostrukturer, såsom kvartsglas, har been visat att avsevärt öka intensitet i SERS pga lokalisering av plasmoniska vågor jämfört med andra material såsom kisel 14,15. Men EBL mönstring på dielektriska substrat, särskilt på nanonivå, innebär stora utmaningar på grund ladda uppbyggnad under exponeringen. Tidigare har vi visat 16,17 att dessa svårigheter kan övervinnas genom att placera ledande polymerskikt ovanför resisten. Figur 2 visar en schematisk bild av den totala tillverkningsprocessen med användning EBL exponering och framkallning, följt av metallavsättning och löstagbart för att producera metalliska nanostrukturer på fuserade kiseldioxidbärare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Schema för eLectron strålelitografi, metalldeponering och liftoff processen steg som används för att tillverka metallnanostrukturer på dielektriska substrat 16-19. I detta dokument presenterar vi hela sekvensen av processteg som involverar SERS substrat tillverkning av EBL, bio-funktionalisering av substraten, och samling av Raman-spektra. Tre mönster utforskas i våra nya produktioner 18,19 adresseras (se figurerna 3 och 4, och tabell 1). I Design 1, är rekombinant protein A immobiliserat på bio-funktion Au nanostrukturer på en kvarts (FS) stöd 18, och SERS detektering av proteinet demonstreras. I Design 2, rekombinant glukos-bindande protein 21,26,27 med och utan liganden (D-glukos) immobiliseras medelst histidin taggar i utrymmen mellan Ag nanostrukturer på Ni-belagda FS, och bindningen av glukos till proteinet detekteras. I Design 3, tiolerad dopamin bindande DNEn aptamer 19,23 immobiliseras på Au nanostrukturer på FS, och bindningen av dopamin genom immobiliserade aptamer demonstreras. Inklusive alla relevanta försöks steg från substratberedning till Raman spektra förvärv, och representant för olika biomolekyler och strategier immobilisering, dessa exempel är användbara för ett brett utbud av applikationer, från prospektering forskning förhör nano biologiska gränssnitt SERS till utvecklingen av SERS biosensorer av små molekyler som anställer protein- eller aptamer-ligandbindning som en igenkänningsmetod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. System av tre representativa utföranden med olika biomolekyler, metoder immobilizations, och substratmaterial: (A) protein A immobiliserade på ädelmetallen nano prickar funktion av en egenmonterad monolager (SAM) i 11-mercaptodecanoic syra (MUA) i DI vatten; (B) histidin-taggade glukosbindande protein (SEK) i komplex med D-glukos immobiliserad på substratytan mellan ädelmetallnano prickar; (C) tiol-termine dopamin bindande aptamer kompletteras med dopamin (DBA) immobiliserade på ädla metallnano prickar. Se ytterligare detaljer i tabell 1. I Design 2 illustreras av panelen (B), var ett prov utan motsvarande liganden också förberett för jämförelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4.Biomolekyler anställda i tre utföranden: (A) protein A; (B) glukos-bindande protein och D-glukos; (C) dopamin bindande DNA aptamer och dopamin. De protein tertiära strukturer i (a) och (b) är tagna från Protein Data Bank, PDB ID 1BDD 20 och 2HPH 21, respektive, och dras med VMD för LINUXAMD64, version 1.9.1 22. Den aptamer sekundär struktur i (c) spås från sekvensen 23 med hjälp ValFold 24 programvara och dras med PseudoViewer 3,0 25. Bokstäverna G, A, T, och C motsvarar guanin, adenin, tymin och cytosin nukleotider, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Design 1 Design 2 Design 3
Biopolymer Protein A Glukos-bindande protein (SEK) Dopamin bindande aptamer (DBA)
Bindemedel 11-Mercaptoundecanoic syra (MUA) själv monterade monolager (SAM) Histidin taggar Tiol linkers
Ligand Inget D-glukos Dopamin
Lösning Avjoniserat (DI) vatten Kaliumfosfatbuffert Tris (hydroximetyl) aminometan (TRIS) och etylendiamintetraättiksyra (EDTA) buffert; Fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
Substrat Au strukturer på FS Ag strukturer på Ni-belagda FS Au strukturer på FS
Mönstrad area 4 ^ m x 10 ^ m 4 ^ m x 8 | im 4 ^ m x 10 ^ m
Mönster Au prickar, 50 nm tonhöjd Ag prickar, 40 nm tonhöjd Au hexagoner, 200 nm tonhöjd
Ag hexagoner, 200 nm tonhöjd Au ostrukturerade dynor
Ag ostrukturerade dynor
EBL exponeringsdoser Dots: Prickar: 105 iC / cm 2 Sexhörningar: 180 iC / cm 2
Array I 120 iC / cm2 Sexhörningar: 170 iC / cm 2
Array II 96 iC / cm2
Array III 72iC / cm 2
Laser excitationsvåglängd 532 nm 532 nm 780 nm

Tabell 1. Tre mönster av nano biologiska system.

Protocol

1. Substrat Förberedelse

  1. Använd en halvledare tärningssåg att skära en kvartsglas (FS) rånet i 1 cm × 1 cm eller mindre tärningar.
  2. Rena prover i en piraya lösning (H 2 SO 4: H 2 O 2, 3: 1; VARNING: starka oxidationsmedel) bad 28 för 15 minuter, skölj sedan tärningarna i avjoniserat vatten och torka i kväve.
  3. Placera proverna på en värmeplatta framsidan upp vid 180 ° C under 15 min. Kyl proverna efter avlägsnande från kokplattan till RT.
  4. För Designs 1 och 3, gå vidare till steg 2.
  5. För Design 2, placera provet i en elektronstråle avdunstning kammaren och päls med en 10 nm skikt av Ni.

2. Tillverkning av Nano-mönstrade PMMA Masker Använda Elektronstrålelitografi (EBL)

  1. Spin-coat PMMA motstå och ledande skikten på substraten.
    1. Använd en wafer spinner med en vakuumchuck och placera prover individuellt i mitten på chucken. PlatsEn droppe av polymetylmetakrylat (PMMA) motstå på mitten av proverna med hjälp av en glaspipett och centrifugera vid 3500 rpm under 60 sek med en 2 sek ramptid.
    2. Baka substraten vid 180 ° C under 3-5 min. Efter gräddningen substraten, kyla de prover till RT.
    3. Med substraten kyls och återförs till spinnaren chucken, sprida en droppe av ledande polymer på substratet. Snurra substratet under 40 sek vid 3000 rpm med en 2 sek ramptid. Baka proverna vid 80 ° C under 1 min.
  2. Utför EBL exponering enligt standardproceduren 16,17,18,29.
    1. Använda tillverkarens instruktioner, utarbeta ett exponerings designen använder funktionen doser från tabell 1 med minsta möjliga strålen stegstorlek.
    2. Ladda provet in i elektronstrålelitografi kammaren. Om EBL systemet inte har autofokus, använd en liten repa ifrån där mönstret ska exponeras och bort från pärlan kant för fokusIng.
    3. Använda tillverkarens instruktioner, utföra krävs fokusering och astigmatism korrigering samt skrivfält anpassning så är lämpligt, och exponera provet. För att möjliggöra korrekt exponering profil och bästa mönstret kvalitet, använd en 30 keV elektronstråleenergi och 7,5 um öppning för de exponeringar.
  3. Avlägsna den ledande polymeren och utveckla exponerade proverna.
    1. Förbered en bägare med avjoniserat (DI) vatten för avlägsnande av den ledande polymeren och en andra bägare med en framkallningsblandning (IPA: H2O, 7: 3), och rör om under 5 min vid RT. Förbered isopropanol (hög renhet) i ett tredje bägare som spolglans.
    2. Använda pincett, placera proverna i vattnet i 3 sek för att ta bort den ledande polymerfilm, sedan placera provet i utvecklare och flytta pincetten långsamt upp och ner i 20 sekunder. Överför omedelbart substraten till isopropanol och skölj i 10 sekunder, sedan torka provet med kväve.
    3. </ Ol>

    3. Noble Metal nanostrukturer Fabrication

    1. Ladda proverna upp och ned in i elektronstråle förångare för att möjliggöra indunstades metallen som skall avsättas på den främre ytan av proverna. Deponera en 10 nm tjockt Au skikt på proverna för designer 1 och 3, samt en 10 nm tjockt Ag lager för Design 2 med en hastighet av ca 0,1 nm / sek.
    2. Fyll en ultraljudsbehandling systemet till rekommenderad nivå med vatten och fyll en separat bägare med aceton. Placera en provsidan uppåt i botten av bägaren och låta provet i blöt under 10 min. Håll i bägaren, placera den i vattenbadet och låt höjden av aceton för att matcha höjden av vattnet och slå på sonikering systemet. Låt ultraljudsbehandling ske i upp till 60 sekunder.
    3. Med samma förfarande som beskrivs i steg 3.1, utarbeta enhetliga Au och Ag pad substrat genom avsättning av 10 nm tjocka metallfilmer på FS (Designs 1 och 3) och Ni-belagda FS (Design 2) substrates att hoppa över steg 2.

    4. Bio-funktionalisering av substrat

    1. Förbered design ett prov:
      1. Bered en 1 mM lösning av 11-mercaptodecanoic syra (MUA) i etanol vid RT. Sonikera under 10 min.
      2. Doppa ordentlig nanostrukturerade substratet i lösningen av MUA för 48 h. Skölj provet med etanol tre gånger och torka i 5 min vid RT.
      3. Bered en 75 mM lösning av N-etyl-N '- (3- (dimetylamino) propyl) karbodiimid (EDC) i avjoniserat vatten. Förbered en 15 mM lösning av N-hydroxisuccinimid (NHS) i avjoniserat vatten.
      4. Med hjälp av en mikropipett deposition 100 pl NHS på Au på substratet, och omedelbart lägga 100 pl EDC på samma område. Inkubera i 1 min för att aktivera egenmonterad monolager (SAM) i MUA.
      5. Placera en 100 | il droppe av protein A-lösning (47 pM) på samma område av substratet och lagra provet för 24 h vid 5 ° C i en flerfacks Petri dish med 1 ml av DI-vatten i en annan kammare, och med en förseglad lock.
      6. Skölj provet i DI vatten 3 gånger med kontinuerlig omrörning proverna i separata bägare för 20 sekunder i varje bägare. Låt inte proverna torka efter sköljning eller under sköljningen.
      7. Gå vidare till steg 5.
    2. Förbered Design 2 prover:
      1. Bered en 0,9 mM lösning av glukos-bindande protein (SEK) i kaliumfosfatbuffert (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). Bered en 100 mM lösning av D-glukos i bufferten.
      2. Blanda 30 pl 100 mM D-glukoslösning och 30 pl 0,9 mM GBP lösningen med en 1 ml plast mikrorör behållare och en mikropipett. Inkubera under 30 min.
      3. Deposition 20 pl av ligand fria GBP lösning och av liganden bundna GBP lösning vardera på de preparerade substrat med hjälp av en mikropipett. Lagra proverna vid 5 ° C under 24 h i en petriskål med ett förseglat lock.
      4. Skölj proverna tre gånger ikaliumfosfatbuffertlösning vid RT.
      5. Gå vidare till steg 5.
    3. Förbered Design 3 prover:
      1. Späd dopaminbindning aptamer (DBA) lösning till en koncentration av 1 | iM med användning av TRIS-EDTA-buffert med ett slutligt pH av 7,4.
      2. Bered en dopaminlösning till en 5 pM koncentration genom mätning av dopamin pulvret på en analytisk våg och mixning av den i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med en omröringsstav vulst under 5 min.
      3. Deponera en 20 pl droppe av DBA lösningen på ytan av varje substrat och låta proven stå i en timme vid RT med ett lock över Petri-skålen.
      4. Skölj proverna tre gånger i en kaliumfosfatbuffert (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5).
      5. Placera proverna upprätt ovanpå ett renrum klass torka torka baken medan en film bibehållande på framsidan av substratet. Ställ ett prov åt sidan som en kontroll.
      6. Placera en 5 pl droppe av dopamin lösningen on ytan av den befintliga droppe av PBS-buffertlösningen på de återstående proverna med de önskade dopaminkoncentrationer. Inkubera provet under 10 min.
      7. Placera en droppe av dopamin lösningen på Au pad yta utan aptamer. Inkubera under 10 min.
      8. Skölj samplen i kaliumfosfatbuffertlösning 3 gånger.

    5. Ramanspektroskopi

    1. Placera varje prov i en vattentät kammare för att undvika avdunstning av laserexponering.
      1. Fyll en plastspruta med kemiskt inert högvakuum fett, placera prover på objektglas och fördela några millimeter av fett som omger proven utan att röra proverna.
      2. Placera ett mikroskop täckglas ovanpå substraten och tryck ner för att bilda en tätning, vilket skapar en tunn vätskegränssnitt mellan substraten och täckglasen utan att tillåta bufferten att komma i kontakt med vakuum fett försiktigt.
    2. Med användning av ettoptiskt Raman mikroskopsystem, få en fokusering på ytan av metallnano mönstrad region som ska provtas utan att slå på lasern.
    3. Utför Raman provtagning 18,19 med en laser intensitet mellan 2,4-3,1 mW med en total längd på mindre än 20 sekunder för att förhindra skada på provet med ett mål 10X förstoring. Förvärva Raman spektra för prover från Designs 1, 2 och 3 med hjälp av excitationsvåglängder som anges i tabell 1. Också förvärva kontroll Raman spektra för lösningar av protein A, GBP, och D-glukos och för dopamin pulver använder glasskivor utan metall nanostrukturer som stöder för jämförelse.

Representative Results

Samla kontroll Raman spektra för de viktigaste komponenterna, inklusive gratis proteiner i lösning och fria ligander i lösning eller i pulverform utan att använda metallhaltiga substrat, är viktigt för att möjliggöra en korrekt jämförelse samt för tolkning ändamål. Figur 5A visar en typisk Raman spektrum för fritt protein A i DI-vatten på en glasplatta utan nanostrukturerade substrat. Två band med högsta Raman intensiteten, bandet vid 2931 cm -1 och 1091 cm -1, motsvarar vibrationer involverar CH och CS obligationer, respektive. Andra band med lägre Raman intensitet såsom 563 cm -1, 1450 cm -1, 1653 cm -1 och 2426 cm -1, kan hänföras till en överlagring av vibrationslägen 18,32,33,34. Kontroll Raman-spektra för liganden fri GPB i buffertlösning med tre olika koncentrationer, 0,3, 0,9 och 1,3 mM, visas i figur 5B. I t han räkna, det breda bandet runt 3.400 cm -1 motsvarar lösningsmedlet 35, medan bandet vid 2935 cm -1 representerar vibrationer involverar CH bindningar av proteinet Figur 5C 32,33. visar den höga våglängd Raman spektrum för D-glukos i buffertlösning för olika koncentrationer: 1, 6, 100, 200, och 400 mM. När koncentrationen av glukos ökar, CH bindningar vibrationsband uppkommer vid 2890 cm -1 och 2960 cm -1. Kontroll Raman spektra av dopamin i kristallform som erhållits med både 532 nm och 780 nm exciteringsvåglängder visas i figur 5D. Mycket av Ramanspektrum kommer från bensenringen böjning och CH obligations sträckor av molekylen 19,36. Några av banden på omkring 3.000 cm -1 endast observeras vid 532 nm men inte 780 nm excitationsvåglängd.

pload / 52712 / 52712fig5.jpg "/>
Figur 5. Kontroll Ramanspektrum av protein A i avjoniserat vatten som erhållits vid 532 nm excitationsvåglängd 18 (A); Raman-spektra av ligand-fri glukos bindande protein i buffertlösning som erhållits vid 532 nm excitationsvåglängd (B); Raman-spektra av D-glukos i buffertlösning som erhållits vid 532 nm excitationsvåglängd (C); och spektra för dopamin pulver erhållet vid 532 nm och 780 nm exciteringsvåglängder 19 (D). All spektra är regelbundna Raman spektra av lösningar (a, b, c) och pulver (d) på objektglas utan nanostrukturerade substrat. I (D), var tilldelningen av Raman skift regimer till olika molekylära vibrationer göras med General atom- och molekyl Electronic Structure System (GAMESS) 30 och MacMolPlt 31 programvara som beskrivs på annan plats 19. Omtryckt panel (a) med tillstånd från 18 Americen Vakuum Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att få SERS spektra för utanpå immobiliserade biomolekyler, är substrat bestående metalliska nanostrukturer på smält kiseldioxid stöden tillverkas enligt beskrivningen i steg 1-3. Kvaliteten på tillverkade substrat övervakas med användning av svepelektronmikroskopi (SEM). Standard SEM förfaranden beskrivs på annan plats 16,17,18, 19 och ingår inte i det nuvarande protokollet. Figur 6 visar representativa SEM bilder av Au och Ag nano prickar och nano hexagon liknande strukturer (paneler ad), samt icke -structured Au och Ag pads (paneler E och F, respektive). Nästa steg involverar immobilisering av biologiskt material på nanostrukturerade substrat som sysselsätter tre utföranden som anges i tabell 1, och förvärv av deras SERS spektra. I o rder för att upprätthålla en vattenbaserad miljö under Raman avbildning, är varje prov placeras i dess motsvarande lösning (se tabell 1), utjämnade med en tunn glaskupa, och beseglas som illustreras i figur 7.

Figur 6
Figur 6. svepelektronmikroskop (SEM) bilder av 10 nm tjocka Au och Ag ytan nanostrukturer som används som SERS substrat: (A, B) kedjor av nanodots; (C, D) arrayer av nano hexagoner; (E, F) ostrukturerade dynor. Substrat med Au strukturer (till vänster) använder FS stöd, medan substrat med Ag strukturer (till höger) använder en 10 nm tjockt Ni beläggning på FS. Bilderna erhölls såsom beskrivits annorstädes 16,17,18.pg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7. Schema vattentäta kammare för Raman avbildning av bio-funktion prover i lösning.

I Design 1, är rekombinant protein A immobiliserat på substraten funktionaliseras genom ett självmonterat monoskikt av 11-mercaptodecanoic syra (MUA) i avjoniserat vatten 18. Substraten i denna design innefattar tre uppsättningar av Au prickar med en 50 nm stigning och varierande inter dot sträckor på smält kiseldioxid (se figurerna 6A och 8). Processen för proteinimmobilisering börjar med bildandet av en SAM på substraten. För att erhålla kovalenta bindningen mellan SAM och proteinet är karboxylsyragrupperna för SAMS omvandlas till aminreaktiva NHS-ester genom behandling med en blandning av N etyl-N '- (3- (dimetylamino) propyl) karbodiimid (EDC) lösning och N-hydroxisuccinimid (NHS) lösning i avjoniserat vatten. Immobilisering av protein A sker genom förskjutning av NHS gruppen genom lysinrester i proteinet 37. Ett exempel på avbildning prover för design 1 med protein A immobiliserat på Au nanostrukturer visas i figur 9. Figur 9A visar ett optiskt mikroskop bild av proverna, som omfattar tre kedjor av bio-funktion Au nanodots med olika interpunkt luckor (se Figurerna också 3AA och 8), och figur 9B visar Raman spektral kartläggning över dessa matriser. Det kan ses att den högsta Raman intensitet påträffas för Array I, om de inter dot luckor är det smalaste, medan lägre intensiteter erhålls för Array III med de bredaste inter-dot luckor. Detta kan förklaras av en starkare plasmon kopplingseffekt producerad av högre elektrisk fieLDS i de trånga utrymmena mellan prickarna 18. Figur 9C visar den starkaste SERS-spektra erhölls för Arrays I och II. Spektra uppvisa flera band (1630 cm -1, 1964 cm -1, 2280 cm -1, 2577 cm -1, och 2916 cm -1) i närhet till de Raman sätten fritt protein A i lösning som ses i figur 5A. Hänförligt till vibrationer av olika bindningar som finns i proteiner, dessa band antingen visas på liknande platser i både immobiliserade protein och i lösning, eller är något skiftas till något högre vågtal vid immobilisering. Däremot SERS spektra av liknande nanostrukturerade substrat funktion av MUA SAM utan proteinet visar en helt annan mönster 18, bekräftar att figur 9 representerar SERS kartläggning av ytan immobiliserade protein A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8. SEM bilder av tre grupperingar av Au nanodots på FS substrat som används i design 1 18. De arrayer har samma 50 nm tonhöjd och något annorlunda prick radier resulterar i olika bredder inter dot luckor. Detta uppnås genom att använda olika EBL exponeringsdoser för att producera PMMA masker för de tre uppsättningarna (se tabell 1). Högre doser exponering leder till bredare hål i PMMA masker, vilket möjliggör större Au punktstorlekar efter metallisering och liftoff. Återges med tillstånd från 18 amerikanska Vacuum Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

les / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg "/>
Figur 9. SERS avbildning av substrat-immobiliserade protein A i design 1 18. (A) Optisk mikroskopbild av provet, bestående av tre grupperingar av Au nanodots med 50 nm pitch och olika interpunkt luckor på en kvarts substrat (se även Figur 6), bio-funktionaliserad såsom visas i fig 3A. (B) Raman kartläggning av provet. (C) SERS-spektra från prick Array I och II. I panelen (B), representerar den vertikala axeln avståndet över underlaget, representerar den horisontella axeln Raman skift, och legenden stapeln visar Raman intensiteter. Vertikala streckade linjer i paneler (B) och (C) representerar benchmark Raman-band av fritt protein A i lösning och (*) i panelen (C) indikerar SERS band från Array I. Raman-spektra erhölls 532 nm excitationvåglängd. Återges med tillstånd från 18 amerikanska Vacuum Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I Design 2, är rekombinant glukos bindande protein (SEK) 21 komplex med D-glukos (ligand) immobiliserade på lämpliga substrat i kaliumfosfatbuffertlösning. Prover med immobiliserad ligand fria GBP är också förberett för jämförelse. I denna utformning, är glukos-bindande protein fäst till ytan med hjälp av en histidinmärkning, som binder väl till Ni men inte till ädelmetaller 6. Eftersom substraten innefattar arrayer av Ag nano-dots, nano hexagoner och ostrukturerade Ag dynor på Ni-belagda FS (fig 6B, 6D, och 6F, respektive), en kan förvänta flesta av immobiliserade proteinmolekyler som skall lokaliseras i luckor mellan Ag nanostrukturer där Ni beläggning är AVAILABLE. Raman-spektra erhölls för immobiliserat glukosfritt och glukos bundna GBP anges i figurerna 10A och 10B, respektive. Alla dessa spektra uppvisar ett brett band vid ca 3300 cm -1, vilket motsvarar till buffertlösningen 35. Den spektra erhölls med en ostrukturerad Ag pad innehåller bara detta enda band och inte visar några proteinvibrationslägen, vilket bekräftar att immobiliserat protein inte hittas på Ag ytan som förväntat. Däremot spektra erhålls med arrayer av Ag nano prickar och nano sexhörningar uppvisar band runt 1550 cm -1 och 2900 cm -1, som representerar analyten 32,33. I synnerhet den breda bandet runt 1.550 cm -1, känd som amiden II-bandet, är hänförlig till peptidbindningar vibrationer i proteiner 33,34. I fallet ansåg, representerar detta band en överlagring av vibrationslägen från GBP immobiliserade på Ni ytan mellan Ag-funktionens, och är ett tecken på SERS förstärkning av dessa lägen i närheten av ädelmetallnanostrukturer när substraten innehåller nano punkter eller nano hexagoner används. Detta band är mycket svag för proteinet i lösning i frånvaro av SERS förbättring (Figur 5B) och frånvarande på Ag kuddar utan Ni yta tillgänglig för proteinbindningen, men det är väl uttalad för nanostrukturerade substrat med vissa Ni yta åtkomliga för proteinet att binda. Men ännu viktigare för den aktuella studien är de andra, smalare band runt omkring 2.900 cm -1 som kan hänföras till CH bond wibrations 32,33. Spektrumet av glukosfritt GBP visar en uttalad band vid 2933 cm -1 med nano prickar substrat, och en svag men urskiljbar band vid en liknande våglängd med nano hexagoner substrat (figur 10A). Skild från det gäller glukos fritt protein, den SERS spektra av glukos bundna GBP visas i Figu re 10B uppvisar två band motsvarande CH obligationer vibrationer regimer, vid 2850 cm -1 och 2,910 cm -1. Banden är väl uttalas i spektrumet av glukos bundna GBP på nano hexagoner substrat, och de kan också ses i det spektrum av GBP på nano prickar substrat. Bandet vid 2850 cm -1 är rimligt nära de 2890 cm -1 en i styr Raman-spektrum från D-glukos i lösning, och därför kan det hänföras till glukos bundet till proteinet, medan det andra bandet (vid 2910 cm -1) är hänförligt till CH obligations vibrationer både protein och glukos. Man kan dra slutsatsen att skillnaden i SERS underskrifter från glukos fria och glukos bundna substrat-immobiliserade GBP är observerbar i denna region, och CH obligations vibrationer proteinbundet glukos är detekterbara anställa designen beskrivs.

10.jpg "/>
Figur 10. SERS spektra av ligand fria (A) och ligand-bunden (B) glukos-bindande protein immobiliserade på tre olika substrat i design 2. Spektra erhölls med 780 nm excitationsvåglängd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I Design 3, är den anpassade dopaminbindning aptamer (DBA) med tiol termine 23 immobiliserade på substratet i tris (hydroximetyl) aminometan (TRIS) etylendiamintetraättiksyra (EDTA) buffertlösning, och dopamin är därefter bundet till den immobiliserade aptamer 19. De substrat för denna design innehåller arrayer av Au nano hexagoner på FS (figur 6C). Ostrukturerade Au pads (figur 6E) används också för kontrolländamål. Eftersom DNA är inneboende fluorescerande 38, 780 nm excitation waveleng th används i design 3 för att minska denna faktor. I denna design, är erkännandet elementet (aptamer) inte Raman aktiva i regionen Raman skift anses i figur 11, medan dopamin visar en signifikant Raman aktivitet i denna region. Eftersom signalen från prover som utsätts för endast dopamin utan immobiliserade aptamer visar inga resultedopaminbanden 19, är de observerade SERS banden förväntas komma från aptamer bundna dopamin. Figur 11 jämför SERS spektra av immobiliserade aptamer på guldnanostrukturer före och efter tillsats av dopamin. Som väntat gör immobiliserade dopamin fria aptamer inte uppvisar Raman-band. Däremot är ett antal uttalade Raman-band observerats för dopamin bundna immobiliserade aptamer. Positionerna för de flesta band i figur 11 är nära dem i kristallin dopamin, om än med skillnader i amplituder.

igure 11 "src =" / filer / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg "/>
Figur 11. SERS spektra av ligand fria (lila linje) och ligand-bunden (blå linje) dopamin-bindande aptamer immobiliserad på Au nano hexagon substrat i design 3 19. Den röda linjen visar en kontroll SERS spektrum av dopamin pulver. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

SERS vinner ett erkännande som en extremt kraftfull teknik för bio-detektion med många unika fördelar. Relationen med molekylära vibrationer tillåter selektivt identifiera "fingeravtryck" av specifika analyter från SERS-spektra, medan den extremt höga känslighet gör det möjligt att detektera mycket små mängder av analyten 9,10,11,35. Dessutom är SERS en icke-förstörande teknik som också är relativt okänslig för vatten, och därmed är det mycket väl lämpad för sondering biologiska material i sin naturliga vattenmiljö 9. De resultat som presenteras betona dessa fördelar samt ytterligare demonstrera stark potential SERS som en mycket flexibel etikettfria teknik för bio-detektion. I tre utföranden som använder monolager av olika substrat immobiliserade biomolekyler, har Raman lägen upptäckts som kunde tryggt skrivas de speciella analyter. Att upptäcka dessa biomolekyler, or sina respektive ligander, har visats anställa plana ytor av kvartsglas som stöd för SERS substrat, gör mönster som är kompatibla med nuvarande elektronik och mikrofluidik inställningar, lovande många tillämpningar i samband med framväxande bioelektroniska arkitekturer gränssnitt biologiska material med ytor av elektroniska och elektrokemiska anordningar 2,3. Viktigt i två av tre utföranden SERS upptäckt har visats för specifik bindning av små molekyler, såsom glukos och dopamin, som sysselsätter monolager av ytan-immobiliserade protein och aptamer respektive som igenkänningselement.

Dock bör flera aspekter tas om hand för att uppnå en effektiv SERS biologisk upptäckt i "on-chip" inställning. Först av allt, är ett välkänt utmaning som är gemensam för de flesta biomolekyler deras benägenhet att brytas ned, särskilt när den utsätts för icke-naturliga betingelser såsom torr omgivjön eller intensivt laserljus. Under hela protokollet, har vi betonat vikten av att alltid hålla bio-funktion prover nedsänkta i lämpliga lösningar under hela experimentet, från beredning av proverna till förvärvet av Raman spektra. För det senare har en anpassad vattentäta kammare utformats (Figur 7) för att undvika avdunstning av vätskan under laserexponeringar. Varaktigheten av exponering och laserintensitet bör också begränsas enligt beskrivningen i steg 5.3 i protokollet för att undvika skador av proverna.

Resultaten av SERS detekterings påträffas känsliga för geometrin av det använda substratet, och i synnerhet det inbördes funktionen separation av de metalliska nanostrukturer. Som det framgår av figur 8 och 9, i SERS intensitet Design ett prov är starkt beroende av bredden på spalterna mellan Au nano prickar på kvartsglas. Av tre grupperingar av Au nanodots testade jagn denna design (Figur 8), är den högsta Raman intensiteten uppnås med Array I, som har de smalaste klyftorna mellan Au funktioner och därför ger mer effektiv elektromagnetiskt fält förbättring. Såsom figur 9 illustrerar, krävs kontroll över inter-feature separationer på nivån 10-20 nm eller mindre. Anställa EBL för att tillverka SERS substrat, vilket visas här, ger en effektiv upplösning specifikt för styrning av bredder mellan funktions luckor. Med en positiv tons EBL motstå exempelvis PMMA, kan storleken på hålen i PMMA masker varieras genom att helt enkelt ändra exponeringsdoser. Efter lättning detta resulterar i olika storlekar av metall prickar, och bredden på mellanrum mellan prickarna kan stämmas enligt önskemål genom att välja lämplig EBL exponering doser 18.

Den andra utmaningen är optimering av SERS substratgeometri för specifik biologisk upptäckt ansökan. Även om förstärkningseffekten increases med en minskning av de inter-funktionen luckor, den relativt stora storleken av biologiska molekyler medför begränsningar för hur smala de luckor kan vara. Detta är uppenbart från resultaten för Design 2, där immobiliseringen metoden är sådan att proteinet binder effektivt endast till ytan mellan ädelmetall prickar, men inte till prickarna själva (se figur 3B). Som det framgår av figur 10, gör SERS spektra för ostrukturerade Ag pads inte visa några band från analyten. Även dynorna uppvisar en nanokristallin struktur med mycket tunna mellan öarna luckor (se figur 6F) dessa luckor är för smala för att rymma en proteinmolekyl. Ännu en annan dimension av komplexitet tillsättes när protein-ligand-bindning måste detekteras. I fig 10, SERS CH banden är mer uttalade i spektrat ur ligandbundna GBP än i liganden fria en, vilken kan vara hypotetiskt förklaras genom en förändring i GBP konformavid bindning av D-glukos 2 7,27, vilket resulterar i en styvare struktur med ökad Raman-aktivitet. Om man jämför de två nanostrukturerade substrat, CH-bandet från ligand-fritt protein är starkare i SERS spektra erhålls med nano prickar substrat, medan både protein och glukos CH band från ligand bundet protein är mer uttalad med nano hexagoner substrat. Två faktorer förväntas resultera i att dessa skillnader, tillgången på utrymme mellan Ag funktioner där GBP kunde binda till Ni, och känsligheten hos ligand bundna och ligand fritt protein till den elektromagnetiska förbättring av Ramanspridning i "hot spots" mellan dessa egenskaper. Å ena sidan ger nano dotsmönster en relativt större inter funktion där Ni beläggning är tillgänglig för proteinet att binda, vilket kan förklara en mer uttalad CH band observerats för glukos fria GBP på Ag nano prickar substrat. Å andra sidan, på grund av deras icke-enhetlig struk-Ture (se figur 6D), kan Ag nano hexagoner vara benägna att vara starkare elektro förbättring i smala klyftor mellan Ag öar inom nano hexagoner resulterar i starkare CH vibrations band från glukos bunden GBP på nano hexagoner substrat. Vissa detaljer i detta samspel kräver ytterligare verifiering och optimering av SERS substrat för komplexa analyter med stora proteiner såsom GBP är fortfarande i pipeline.

Det är uppenbart att SERS detektion av ligandbindning utnyttjar immobiliserade biomolekyler som ett igenkänningselement underlättas när endast liganden är Raman-aktiv i en utvald region, medan de andra komponenterna är det inte. Detta är fallet för Design 3, där uttalade SERS band av aptamer bundna dopamin erhålls (figur 11). Den aptamer-dopamin paret uppvisar utmärkt specificitet och SERS spektrumet består uttalade band utan större bakgrundssignal.

11,12,13, vilket möjliggör en bättre kontroll av metall nanostruktur storlek och placering mot en tillförlitlig identifiering av optimal substrat design för ett brett utbud av applikationer. Skalbarhet av dessa tekniker kan därefter förbättras genom att kombinera EBL med kompletterande nanolitografi metoder såsom nanoimprintlitografi 19 mot framtida massproduktion av nano mönster optimerad användning av de avstämbara EBL tekniker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) Sigma Aldrich 450561  ALDRICH Used for surface functionalization in Design 1
Conductive polymer Mitsubishi Rayon aquaSAVE-57xs A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures
D-glucose Collaborator Lab. Ligand in Design 2
Dopamine Collaborator Lab. Ligand in Design 3
Dopamine binding aptamer (DBA) Integrated DNA Technologies Inc. 5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3'  Biopolymer in Design 3
Fused silica wafers Mark Optics
Glucose binding protein (GBP) Collaborator Lab. PDB ID 2HPH Biopolymer in Design 2
High vacuum grease Dow Corning Used to seal water-proof chamber
Hydrogen Peroxide 30%, H2O2 J.T. Baker Used for pirahna solution
N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) Sigma Aldrich 03450 FLUKA Used for immobilization of biopolymer in Design 1
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma Aldrich 130672 ALDRICH Used for immobilization of biopolymer in Design 1
Potassium phosphate buffer Collaborator Lab. Buffer used in Raman sampling
Phosphate buffered  saline (PBS) Collaborator Lab. Solvent in Design 3
Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2 MicroChem  A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist
Recombinant protein A Protein Mods Inc PDB ID 1BDD Biopolymer in Design 1
Sulfuric acid 96%, H2SO4 J.T. Baker Used for pirahna solution
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer Sigma Aldrich T9285 SIGMA Buffer in Design 3
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Equipment
Name Company Catalog Number Comments
Dicing saw Diamond Touch Technology Inc.
(17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO)
Used to cut FS wafer
Electron beam evaporator Kurt J. Lesker Used for Au and Ag evaporation
Electron beam evaporator Johnsen Ultravac (JUV) JuV E-gun Used for Ni evaporation
Microscope cover slips (25 mm) Fisher Scientific 12-545-102 Used in water-proof chamber
Microscope slides (3×1 in.) Fisher Scientific Used in water-proof chamber
Raith 150TWO EBL exposure system Raith Inc. Raith 150TWO  system Used for EBL exposures
Raman microscope Thermo Scientific Nicolet Almega XR Used for Raman spectroscopy
Sonicator system Branson Used for liftoff and solutions mixing
Spinner Brewer Spinner and Hotplate Cee 200X and Cee 1300X Used to spin-coat PMMA and conductive polymer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medlintz, I. L. Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques. Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).
  2. Walcarius, A., Minteer, S. hD., Wang, J., Yu, L., Merkoçi, A. Nanomaterials for Bio-Functionalized Electrodes: Recent Trends. J. Mater. Chem. B. 1, 4878-4908 (2013).
  3. Kim, J., et al. Applications, Techniques, and Microfluidic Interfacing for Nanoscale Biosensing. Microfluid. Nanofluid. 7, 149-167 (2009).
  4. Rassaei, L., Singh, P. S., Lemay, S. G. Lithography-Based Nanoelectrochemistry. Anal. Chem. 83, 3974-3980 (2011).
  5. Wong, L. S., Khan, F., Micklefield, J. Selective Covalent Protein Immobilization: Strategies and Applications. Chem. Rev. 109, 4025-4053 (2009).
  6. Ley, C., Holtmann, D., Mangold, K. -M., Schrader, J. Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Electrodes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 88, 539-551 (2011).
  7. Kim, D., Herr, A. E. Protein Immobilization Techniques for Microfluidic Assays. Biomicrofluidics. 7, 041501 (2013).
  8. Anker, J. N., Hall, W. P., Lyandres, O., Shah, N. C., Xhao, J., Van Duyne, R. P. Biosensing with Plasmonic Nanosensors. Nature Materials. 7, 442-453 (2008).
  9. Bantz, K. C., et al. Recent Progress in SERS Biosensing. Phys.Chem. 13, 11551-11567 (2011).
  10. Sharma, B., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Ringe, E., Van Duyne, R. P. SERS: Materials, Applications, and the Future. Mater. Today. 15, 16-25 (2012).
  11. Kleinman, S. L., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Dieringer, J. A., Van Duyne, R. P. Creating, Characterizing, and Controlling Chemistry with SERS Hot Spots. Phys.Chem.Chem.Phys. 15, 21-36 (2013).
  12. Fan, M., Andrade, F. S., Brolo, A. G. A Review on the Fabrication of Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy and their Applications in Analytical Chemistry. Anal. Chim. Acta. 693, 7-25 (2011).
  13. Cao, Y., Li, D., Jiang, F., Yang, Y., Zh, H. Engineering Metal Nanostructure for SERS Application. J. Nanomater. 123812, 1-12 (2013).
  14. Glembocki, O., Rendell, R., Alexson, D., Prokes, S., Fu, A., Mastro, M. Dielectric-Substrate-Induced Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. B. 80, 085416 (2009).
  15. Merlen, A., et al. Surface Enhanced Spectroscopy with Gold Nanostructures on Silicon and Glass Substrates. Surf. Sci. 605, 1214-1218 (2011).
  16. Muhammad, M., Buswell, S. C., Dew, S. K., Stepanova, M. Nanopatterning of PMMA on Insulating Surfaces with Various Anticharging Schemes Using 30 keV Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 29, 06F304 (2011).
  17. Peters, R., Fito, T., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Study of Multilayer Systems in Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 31, 06F407 (2013).
  18. Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Application of EBL Fabricated Nanostrucutred Substrates for SERS Detection of Protein A in Aqueous Solution. J. Vac. Sci. Technol.B. 31, (2013).
  19. Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Protein-Ligand Binding Using D-glucose and Glucose Binding Protein on Nanostructured Plasmonic Substrates. (2014).
  20. Peters, R. Fabrication and Testing of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates for the Detection of Biomolecules [MSc Thesis]. University of Alberta. (2014).
  21. Gouda, H., Torigoe, H., Saito, A., Sato, M., Arata, Y., Shimada, I. Three-Dmensional Solution Structure of the B Domain of Staphylococcal Protein A: Comparisons of the Solution and Crystal Structures. Biochemistry. 31, 9665-9672 (1992).
  22. Cuneo, M. J., Johnson, S. J., Beese, L. S., Hellinga, H. W. High Resolution Structure of E. Coli Glucose/Galactose Binding Protein Bound with Glucose. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank. (2009).
  23. Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD - Visual Molecular Dynamics. J. Molec. Graphics. 14, 33-38 (1996).
  24. Walsh, R., DeRosa, M. C. Retention of Function in the DNA Homolog of the RNA Dopamine Aptamer. Biochem. Biophys. Res. Comm. 388, 732-735 (2009).
  25. Akitomi, J., Kato, S., Yoshida, Y., Horii, K., Furuich, M., Waga, I. ValFold: Program for the Aptamer Truncation Process. Biomed. Inf. 7, 38-40 (2011).
  26. Han, K., Lee, Y., Kim, W. PseudoViewer: Automatic Visualization of RNA Pseudoknots. Bioinformatics. 18, S321-S327 (2002).
  27. Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic Binding Proteins: a Versatile Superfamily for Protein Engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 495-504 (2004).
  28. Benson, D. E., Conrad, D. W. Design of Bioelectronic Interfaces by Exploiting Hinge-Bending Motions in Proteins. Science. 293, 1641-1644 (2001).
  29. Bozic, S., Chorzempa, J. Pirahna Cleaning. University of Alberta. (2011).
  30. Mohammad, M. A. Raith 150TWO SOP. University of Alberta. (2011).
  31. Schmidt, M. W., et al. General Atomic and Molecular Electronic Structure System. J. Comput. Chem. 14, 1347-1363 (1993).
  32. Bode, B. M., Gordon, M. S. MacMolPlt: a Graphical User Interface for GAMESS. J. of Mol. Graph. Mod. 16, 133-138 (1998).
  33. Bright, A., Devi, T. S. R., Gunasekaran, S. Spectroscopical Vibrational Band Assignment and Qualitative Analysis of Biomedical Compounds with Cardiovascular Activity. Int. J. Chem. Tech. Res. 2, 379-388 (2010).
  34. Bandekar, J. Amide Modes and Protein Conformation. Biochim. Biophys. Acta. 1120, 123-243 (1992).
  35. Barth, A., Zscherp, C. What Vibrations Tell About Proteins. Quarterly Reviews of Biophysics. 35, 369-340 (2002).
  36. Chrimes, A. F., Khoshmanesh, K. h, Stoddart, P. R. M. itchellA., Kalantar-Zadeh, K. Microfluidics and Raman Microscopy: Current Applications and Future Challenges. Chem. Soc. Rev. 42, 5880-5906 (2013).
  37. Park, S. -K., Lee, N. -S., Lee, S. -H. Vibrational Analysis of Dopamine Neutral Base based on Density Functional Force Field. Bull.-Korean Chem. Soc. 21, 959-968 (2000).
  38. Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors. Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).
  39. Lakowicz, L. R., et al. Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer. Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).
Surface Enhanced Raman Spec detektion av biomolekyler Använda EBL Fabricated nanostrukturerade Substrat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peters, R. F., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates. J. Vis. Exp. (97), e52712, doi:10.3791/52712 (2015).More

Peters, R. F., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates. J. Vis. Exp. (97), e52712, doi:10.3791/52712 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter