We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated.
Tillverkning och karakterisering av konjugerade nano biologiska system gränssnitt metalliska nanostrukturer på fasta underlag med immobiliserade biomolekyler rapporteras. Hela sekvensen för relevanta försökssteg beskrivs, som inbegriper tillverkning av nanostrukturerade substrat med användning av elektronstrålelitografi, immobilisering av biomolekyler på substraten, och deras karakterisering utnyttjar ytförstärkt Raman-spektroskopi (SERS). Tre olika utformningar av nano biologiska system används, inklusive protein A, glukos bindande protein, och en dopamin bindande DNA aptamer. I de två senare fallen, bindningen av respektive ligander, D-glukos och dopamin, ingår också. De tre typer av biomolekyler immobiliseras på nanostrukturerade substrat genom olika metoder, och resultaten av SERS avbildning rapporteras. Funktionerna i SERS att upptäcka vibrationslägen från ytan-immobiliserade proteiner, samt att fånga protein liganden ettd aptamer-ligand bindning demonstreras. Resultaten illustrerar också påverkan av ytan nanostrukturer geometri, biomolekyler immobilisering strategi, Raman aktiviteten hos molekylerna och närvaron eller frånvaron av den ligandbindande på SERS-spektra förvärvas.
Möjligheter att utveckla och karakterisera konjugerade nano biologiska system gränssnitt fasta nanostrukturer och biologiska polymerer blir allt viktigare att ytterligare framsteg inom nästa generations bio analys och bio-manövreringsteknik 1,2. Detta innebär tvärvetenskapliga studier över ett antal forskningsområden, såsom tillverkning av relevanta solid state komponenter (mikro eller nanoelektroder, nanotekniska beläggningar, nanotrådar, eller nanopartiklar) 2,3,4; immobilisering av biomolekyler på ytorna för att skapa önskade biokonjugat 5,6,7; och övervakning nano biologiska gränssnitt 1. I de flesta fall är valet av optimal tillverkning, bio-funktion och karakteriseringsmetoder starkt interrelaterade. Tydligt, skulle valet av nanotillverkningstekniker drivas av kraven för de halvledarkomponenterna i systemet, att vara i hög grad beroende av den detektionsmetod som i turn bestäms av vilken typ av biopolymerer inblandade och i syfte att övervaka gränssnittet.
Av en bred variation av tekniker som används för att karakterisera Bioconjugate system 1,3, yta förbättrad Raman spektroskopi (SERS) har vuxit fram som en mycket lovande metod för att upptäcka kemiska och biologiska arter på ytor 8,9,10,11. SERS sysselsätter inelastisk spridning av monokromatiskt ljus med utanpå immobiliserade biomolekyler (Figur 1) tillåter fångst av unika signaturer som motsvarar molekylära vibrationer. Denna förmåga att skilja mellan olika molekyler utan att involvera etiketter, komplex kemi, eller tidskrävande steg, gör SERS en potentiellt mycket effektiv metod för biologisk upptäckt. En annan viktig fördel med SERS är dess höga känslighet. Den excitation av lokaliserade ytplasmoner av ljus interagerar med ädelmetallnanostrukturer (SERS substrat) ökar dramatiskt intensity av Ramanspridning av analyten, vilket tillåter detektering av mycket små mängder av molekyler, från monoskikt ner till den enda molekyl gräns 8,9,10,11. Slutligen flesta biomolekyler kräver vattenlösningar för att vara stabil. Eftersom vatten har ofta begränsad Raman aktivitet, är bakgrundssignalen från vatten prover minimeras 9. Tillämpningar av SERS har uppvisat en exponentiell ökning under det senaste decenniet 10. Dock är ett mycket omdiskuterat utmaning SERS att den elektromagnetiska förbättringen av Ramanspridning är kritiskt beroende av storlek, form, och avståndet mellan metallnanostrukturer där plasmoniska vågor induceras 11,12,13. För att åstadkomma effektiva och reproducerbara SERS mätningar, kontroll över substratgeometri krävs vid nanodimensioner.
Figur 1. Scheme av ytförstärkt Ramanspektroskopi.
Många metoder som används för att tillverka SERS substrat 11,12,13 kan grovt delas in i bottom-up och top-down metoder. Metoder för den första typen använder olika processer av självsammansättning eller riktad kemisk syntes för att producera nanostrukturer. Ofta behandlas exempel inkluderar immobilisering av monodispersa nanopartiklar på fasta underlag 11,12,13, termisk, spotta, eller elektrokemisk avsättning av uppruggade metallfilmer 11,12, och olika kemiska syntesmetoder 13. Även sådana tekniker tenderar att vara relativt enkelt och billigt, de flesta av dem utmanas av en brist på kontroll över placeringen av strukturerna, och begränsade urvalet till prov reproducerbarhet.
Däremot top-down litografitekniker anställa hanterbart instrument såsom partikelstrålar för att skapa önskade mönster på ytor. En av de mest oftananolitografi metoder, elektronstrålelitografi (EBL), erbjuder superb kontroll över funktioner ner till under 10 nm och även en flexibilitet för att möjliggöra olika substrat mönster på fasta underlag 11,12. I EBL, en stråle av elektroner fokuseras ner till en fläck av några nanometer i avsökningar diameter över en yta av en elektronkänsligt material (resist) som orsakar en kemisk förändring i exponerade områden. För positiv ton motstår såsom polymetylmetakrylat (PMMA), elektronstråle exponering resulterar i klyvning av polymerkedjorna som utgör resisten, vilket leder till en ökad löslighet i ett lämpligt lösningsmedel (framkallare). Processen med elektronstrålelitografi inkluderar spinnbeläggning av ett enhetligt skikt av resist på ett substrat; exponering av den målinriktade resistmaterialet i en vakuumkammare med en elektronstråle; och utveckling av provet för att avlägsna de lösliga regionerna.
Dielektriska stöd underifrån metalliska nanostrukturer, såsom kvartsglas, har been visat att avsevärt öka intensitet i SERS pga lokalisering av plasmoniska vågor jämfört med andra material såsom kisel 14,15. Men EBL mönstring på dielektriska substrat, särskilt på nanonivå, innebär stora utmaningar på grund ladda uppbyggnad under exponeringen. Tidigare har vi visat 16,17 att dessa svårigheter kan övervinnas genom att placera ledande polymerskikt ovanför resisten. Figur 2 visar en schematisk bild av den totala tillverkningsprocessen med användning EBL exponering och framkallning, följt av metallavsättning och löstagbart för att producera metalliska nanostrukturer på fuserade kiseldioxidbärare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schema för eLectron strålelitografi, metalldeponering och liftoff processen steg som används för att tillverka metallnanostrukturer på dielektriska substrat 16-19. I detta dokument presenterar vi hela sekvensen av processteg som involverar SERS substrat tillverkning av EBL, bio-funktionalisering av substraten, och samling av Raman-spektra. Tre mönster utforskas i våra nya produktioner 18,19 adresseras (se figurerna 3 och 4, och tabell 1). I Design 1, är rekombinant protein A immobiliserat på bio-funktion Au nanostrukturer på en kvarts (FS) stöd 18, och SERS detektering av proteinet demonstreras. I Design 2, rekombinant glukos-bindande protein 21,26,27 med och utan liganden (D-glukos) immobiliseras medelst histidin taggar i utrymmen mellan Ag nanostrukturer på Ni-belagda FS, och bindningen av glukos till proteinet detekteras. I Design 3, tiolerad dopamin bindande DNEn aptamer 19,23 immobiliseras på Au nanostrukturer på FS, och bindningen av dopamin genom immobiliserade aptamer demonstreras. Inklusive alla relevanta försöks steg från substratberedning till Raman spektra förvärv, och representant för olika biomolekyler och strategier immobilisering, dessa exempel är användbara för ett brett utbud av applikationer, från prospektering forskning förhör nano biologiska gränssnitt SERS till utvecklingen av SERS biosensorer av små molekyler som anställer protein- eller aptamer-ligandbindning som en igenkänningsmetod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. System av tre representativa utföranden med olika biomolekyler, metoder immobilizations, och substratmaterial: (A) protein A immobiliserade på ädelmetallen nano prickar funktion av en egenmonterad monolager (SAM) i 11-mercaptodecanoic syra (MUA) i DI vatten; (B) histidin-taggade glukosbindande protein (SEK) i komplex med D-glukos immobiliserad på substratytan mellan ädelmetallnano prickar; (C) tiol-termine dopamin bindande aptamer kompletteras med dopamin (DBA) immobiliserade på ädla metallnano prickar. Se ytterligare detaljer i tabell 1. I Design 2 illustreras av panelen (B), var ett prov utan motsvarande liganden också förberett för jämförelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4.Biomolekyler anställda i tre utföranden: (A) protein A; (B) glukos-bindande protein och D-glukos; (C) dopamin bindande DNA aptamer och dopamin. De protein tertiära strukturer i (a) och (b) är tagna från Protein Data Bank, PDB ID 1BDD 20 och 2HPH 21, respektive, och dras med VMD för LINUXAMD64, version 1.9.1 22. Den aptamer sekundär struktur i (c) spås från sekvensen 23 med hjälp ValFold 24 programvara och dras med PseudoViewer 3,0 25. Bokstäverna G, A, T, och C motsvarar guanin, adenin, tymin och cytosin nukleotider, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Design 1 </td> | Design 2 | Design 3 | |
Biopolymer | Protein A | Glukos-bindande protein (SEK) | Dopamin bindande aptamer (DBA) |
Bindemedel | 11-Mercaptoundecanoic syra (MUA) själv monterade monolager (SAM) | Histidin taggar | Tiol linkers |
Ligand | Inget | D-glukos | Dopamin |
Lösning | Avjoniserat (DI) vatten | Kaliumfosfatbuffert | Tris (hydroximetyl) aminometan (TRIS) och etylendiamintetraättiksyra (EDTA) buffert; Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) |
Substrat | Au strukturer på FS | Ag strukturer på Ni-belagda FS | Au strukturer på FS |
Mönstrad area | 4 ^ m x 10 ^ m | 4 ^ m x 8 | im | 4 ^ m x 10 ^ m |
Mönster | Au prickar, 50 nm tonhöjd | Ag prickar, 40 nm tonhöjd | Au hexagoner, 200 nm tonhöjd |
Ag hexagoner, 200 nm tonhöjd | Au ostrukturerade dynor | ||
Ag ostrukturerade dynor | |||
EBL exponeringsdoser | Dots: | Prickar: 105 iC / cm 2 | Sexhörningar: 180 iC / cm 2 |
Array I 120 iC / cm2 | Sexhörningar: 170 iC / cm 2 | ||
Array II 96 iC / cm2 | |||
Array III 72iC / cm 2 | |||
Laser excitationsvåglängd | 532 nm | 532 nm | 780 nm |
Tabell 1. Tre mönster av nano biologiska system.
SERS vinner ett erkännande som en extremt kraftfull teknik för bio-detektion med många unika fördelar. Relationen med molekylära vibrationer tillåter selektivt identifiera "fingeravtryck" av specifika analyter från SERS-spektra, medan den extremt höga känslighet gör det möjligt att detektera mycket små mängder av analyten 9,10,11,35. Dessutom är SERS en icke-förstörande teknik som också är relativt okänslig för vatten, och därmed är det mycket väl lämpad för sondering biologiska material i sin naturliga vattenmiljö 9. De resultat som presenteras betona dessa fördelar samt ytterligare demonstrera stark potential SERS som en mycket flexibel etikettfria teknik för bio-detektion. I tre utföranden som använder monolager av olika substrat immobiliserade biomolekyler, har Raman lägen upptäckts som kunde tryggt skrivas de speciella analyter. Att upptäcka dessa biomolekyler, or sina respektive ligander, har visats anställa plana ytor av kvartsglas som stöd för SERS substrat, gör mönster som är kompatibla med nuvarande elektronik och mikrofluidik inställningar, lovande många tillämpningar i samband med framväxande bioelektroniska arkitekturer gränssnitt biologiska material med ytor av elektroniska och elektrokemiska anordningar 2,3. Viktigt i två av tre utföranden SERS upptäckt har visats för specifik bindning av små molekyler, såsom glukos och dopamin, som sysselsätter monolager av ytan-immobiliserade protein och aptamer respektive som igenkänningselement.
Dock bör flera aspekter tas om hand för att uppnå en effektiv SERS biologisk upptäckt i "on-chip" inställning. Först av allt, är ett välkänt utmaning som är gemensam för de flesta biomolekyler deras benägenhet att brytas ned, särskilt när den utsätts för icke-naturliga betingelser såsom torr omgivjön eller intensivt laserljus. Under hela protokollet, har vi betonat vikten av att alltid hålla bio-funktion prover nedsänkta i lämpliga lösningar under hela experimentet, från beredning av proverna till förvärvet av Raman spektra. För det senare har en anpassad vattentäta kammare utformats (Figur 7) för att undvika avdunstning av vätskan under laserexponeringar. Varaktigheten av exponering och laserintensitet bör också begränsas enligt beskrivningen i steg 5.3 i protokollet för att undvika skador av proverna.
Resultaten av SERS detekterings påträffas känsliga för geometrin av det använda substratet, och i synnerhet det inbördes funktionen separation av de metalliska nanostrukturer. Som det framgår av figur 8 och 9, i SERS intensitet Design ett prov är starkt beroende av bredden på spalterna mellan Au nano prickar på kvartsglas. Av tre grupperingar av Au nanodots testade jagn denna design (Figur 8), är den högsta Raman intensiteten uppnås med Array I, som har de smalaste klyftorna mellan Au funktioner och därför ger mer effektiv elektromagnetiskt fält förbättring. Såsom figur 9 illustrerar, krävs kontroll över inter-feature separationer på nivån 10-20 nm eller mindre. Anställa EBL för att tillverka SERS substrat, vilket visas här, ger en effektiv upplösning specifikt för styrning av bredder mellan funktions luckor. Med en positiv tons EBL motstå exempelvis PMMA, kan storleken på hålen i PMMA masker varieras genom att helt enkelt ändra exponeringsdoser. Efter lättning detta resulterar i olika storlekar av metall prickar, och bredden på mellanrum mellan prickarna kan stämmas enligt önskemål genom att välja lämplig EBL exponering doser 18.
Den andra utmaningen är optimering av SERS substratgeometri för specifik biologisk upptäckt ansökan. Även om förstärkningseffekten increases med en minskning av de inter-funktionen luckor, den relativt stora storleken av biologiska molekyler medför begränsningar för hur smala de luckor kan vara. Detta är uppenbart från resultaten för Design 2, där immobiliseringen metoden är sådan att proteinet binder effektivt endast till ytan mellan ädelmetall prickar, men inte till prickarna själva (se figur 3B). Som det framgår av figur 10, gör SERS spektra för ostrukturerade Ag pads inte visa några band från analyten. Även dynorna uppvisar en nanokristallin struktur med mycket tunna mellan öarna luckor (se figur 6F) dessa luckor är för smala för att rymma en proteinmolekyl. Ännu en annan dimension av komplexitet tillsättes när protein-ligand-bindning måste detekteras. I fig 10, SERS CH banden är mer uttalade i spektrat ur ligandbundna GBP än i liganden fria en, vilken kan vara hypotetiskt förklaras genom en förändring i GBP konformavid bindning av D-glukos 2 7,27, vilket resulterar i en styvare struktur med ökad Raman-aktivitet. Om man jämför de två nanostrukturerade substrat, CH-bandet från ligand-fritt protein är starkare i SERS spektra erhålls med nano prickar substrat, medan både protein och glukos CH band från ligand bundet protein är mer uttalad med nano hexagoner substrat. Två faktorer förväntas resultera i att dessa skillnader, tillgången på utrymme mellan Ag funktioner där GBP kunde binda till Ni, och känsligheten hos ligand bundna och ligand fritt protein till den elektromagnetiska förbättring av Ramanspridning i "hot spots" mellan dessa egenskaper. Å ena sidan ger nano dotsmönster en relativt större inter funktion där Ni beläggning är tillgänglig för proteinet att binda, vilket kan förklara en mer uttalad CH band observerats för glukos fria GBP på Ag nano prickar substrat. Å andra sidan, på grund av deras icke-enhetlig struk-Ture (se figur 6D), kan Ag nano hexagoner vara benägna att vara starkare elektro förbättring i smala klyftor mellan Ag öar inom nano hexagoner resulterar i starkare CH vibrations band från glukos bunden GBP på nano hexagoner substrat. Vissa detaljer i detta samspel kräver ytterligare verifiering och optimering av SERS substrat för komplexa analyter med stora proteiner såsom GBP är fortfarande i pipeline.
Det är uppenbart att SERS detektion av ligandbindning utnyttjar immobiliserade biomolekyler som ett igenkänningselement underlättas när endast liganden är Raman-aktiv i en utvald region, medan de andra komponenterna är det inte. Detta är fallet för Design 3, där uttalade SERS band av aptamer bundna dopamin erhålls (figur 11). Den aptamer-dopamin paret uppvisar utmärkt specificitet och SERS spektrumet består uttalade band utan större bakgrundssignal.
<p class="jove_content"> Framtida förväg om etikettavgiften SERS teknik skulle innebära omfattande tester av biomolekyler 'SERS signalförstärkning med ett brett utbud av olika ytan nanostruktur mönster. Användningen av direktskrivelektronstrålelitografi för att tillverka olika nanostrukturer med en superb nivå av kontroll över storlek, form, och inter funktionen separation, i kombination med de provberedningsprotokoll som presenteras här, skulle underlätta jämförelser och kors validering av de resultat som uppnåtts med olika forskargrupper. Detta skulle lösa den stora utmaningen för reproducerbarhet när SERS substrat tillverkas anställa alternativa "bottom up" metoder 11,12,13, vilket möjliggör en bättre kontroll av metall nanostruktur storlek och placering mot en tillförlitlig identifiering av optimal substrat design för ett brett utbud av applikationer. Skalbarhet av dessa tekniker kan därefter förbättras genom att kombinera EBL med kompletterande nanolitografi metoder såsom nanoimprintlitografi 19 mot framtida massproduktion av nano mönster optimerad användning av de avstämbara EBL tekniker.The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside, and Albert Cao for their help in developing and preparing the protein conjugates as well as the DNA aptamer; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar, and Trevor Olsen for their assistance in the sample preparation, Jonathan Mane for his assistance in generating images of the molecular structures; and the funding sources including the National Research Council of Canada – National Institute for Nanotechnology (NRC-NINT), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), and the University of Alberta for supporting the work.
11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) | Sigma Aldrich (www.sigmaalrich.com) |
450561 ALDRICH | Used for surface functionalization in Design 1 |
Conductive polymer | Mitsubishi Rayon (www.mrc.co.jp) |
aquaSAVE-57xs | A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures |
D-glucose | Collaborator Lab. | Ligand in Design 2 | |
Dopamine | Collaborator Lab. | Ligand in Design 3 | |
Dopamine binding aptamer (DBA) | Integrated DNA Technologies Inc. (www.idtdna.com) |
5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3' | Biopolymer in Design 3 |
Fused silica wafers | Mark Optics www.markoptics.com |
||
Glucose binding protein (GBP) | Collaborator Lab. (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532) |
PDB ID 2HPH | Biopolymer in Design 2 |
High vacuum grease | Dow Corning (www.dowcorning.com) |
Used to seal water-proof chamber, step 5.1 | |
Hydrogen Peroxide 30%, H2O2 | J.T. Baker | Used for pirahna solution, step 1.2 | |
N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich www.sigmaaldrich.com |
03450 FLUKA | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) |
130672 ALDRICH | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
Potassium phosphate buffer | Collaborator Lab. | Buffer used in Raman sampling | |
Phosphate buffered | Collaborator Lab. | Solvent in Design 3 | |
saline (PBS) | |||
Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2 | MicroChem (www.microchem.com) |
A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist | |
Recombinant protein A | Protein Mods Inc (www.proteinmods.com) |
PDB ID 1BDD (www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd) |
Biopolymer in Design 1 |
Sulfuric acid 96%, H2SO4 | J.T. Baker | Used for pirahna solution, step 1.2 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer | Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) |
T9285 SIGMA | Buffer in Design 3 |
Dicing saw | Diamond Touch Technology Inc. | Used to cut FS wafer, step 1.1 | |
(17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO) | |||
Electron beam evaporator | Kurt J. Lesker (www.lesker.com) |
Used for Au and Ag evaporation | |
Electron beam evaporator | Johnsen Ultravac (JUV) (www.ultrahivac.com) |
JuV E-gun | Used for Ni evaporation |
Microscope cover slips (25 mm) | Fisher Scientific (www.fishersci.ca) |
12-545-102 | Used in water-proof chamber, step 5.1 |
Microscope slides (3×1 in.) | Fisher Scientific (www.fishersci.ca) |
Used in water-proof chamber, step 5.1 | |
Raith 150TWO EBL exposure system | Raith Inc. (www.raith.com) |
Raith 150TWO system | Used for EBL exposures, step 2.2 |
Raman microscope | Thermo Scientific (www.thermoscientific.com) |
Nicolet Almega XR | Used for Raman spectroscopy, step 5.3 |
Sonicator system | Branson (www.bransonic.com) |
Used for liftoff and solutions mixing | |
Spinner | Brewer Spinner and Hotplate (www.brewerscience.com) |
Cee 200X and Cee 1300X | Used to spin-coat PMMA and conductive polymer, step 2.1 |