We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated.
निर्माण और स्थिर biomolecules के साथ ठोस समर्थन करता है पर धातु के nanostructures interfacing एकत्रित नैनो जैविक प्रणालियों के लक्षण वर्णन सूचना दी है। प्रासंगिक प्रयोगात्मक चरणों का पूरा दृश्य इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी, substrates पर biomolecules के स्थिरीकरण का उपयोग कर nanostructured substrates के निर्माण से जुड़े, वर्णन किया गया है, और उनके लक्षण वर्णन का उपयोग सतह बढ़ाया रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (SERS)। नैनो जैविक प्रणालियों के तीन अलग अलग डिजाइनों के एक प्रोटीन, ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन, और एक डोपामाइन बाध्यकारी डीएनए aptamer सहित कार्यरत हैं। बाद के दो मामलों में, संबंधित ligands, ग्लूकोज़ और डोपामाइन के बंधन, भी शामिल है। biomolecules के तीन प्रकार के अलग अलग तरीकों से nanostructured substrates पर स्थिर रहे हैं, और SERS इमेजिंग के परिणामों को रिपोर्ट कर रहे हैं। SERS की क्षमताओं सतह प्रोटीन से कंपन मोड पता लगाने के लिए, साथ ही प्रोटीन ligand के एक पर कब्जा करने के लिएडी aptamer-ligand के प्रदर्शन कर रहे हैं बाध्यकारी। परिणाम यह भी सतह nanostructure ज्यामिति, biomolecules स्थिरीकरण रणनीति, अणुओं और अधिग्रहण के SERS स्पेक्ट्रा पर बाध्यकारी ligand की उपस्थिति या अनुपस्थिति के रमन गतिविधि के प्रभाव के उदाहरण देकर स्पष्ट करना।
ठोस nanostructures और जैविक पॉलिमर interfacing एकत्रित नैनो जैविक प्रणालियों को विकसित करने और चिह्नित करने के लिए क्षमताओं को अगली पीढ़ी के जैव संवेदन और जैव प्रवर्तन प्रौद्योगिकियों 1,2 में आगे प्रगति करने के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं। यह एक ऐसी उचित ठोस राज्य घटकों (सूक्ष्म या नैनो इलेक्ट्रोड, नैनो इंजीनियर कोटिंग्स, nanowires, या नैनोकणों) 2,3,4 के निर्माण के रूप में अनुसंधान क्षेत्रों की एक संख्या भर में बहु-विषयक पढ़ाई शामिल है; वांछित bioconjugates 5,6,7 बनाने के लिए सतहों पर biomolecules के स्थिरीकरण; और नैनो जैविक इंटरफेस एक निगरानी। ज्यादातर मामलों में, इष्टतम निर्माण, जैव functionalization, और लक्षण वर्णन तरीकों में से चयन दृढ़ता से अंतर से संबंधित है। जाहिर है, nanofabrication तकनीकों की पसंद, प्रणाली की ठोस राज्य घटकों की आवश्यकताओं के द्वारा संचालित किया जाएगा पता लगाने के विधि, पर काफी हद तक निर्भर होने जो टू मेंआर.एन. शामिल बायोपॉलिमरों की प्रकृति और इंटरफ़ेस निगरानी के उद्देश्य से निर्धारित होता है।
Bioconjugate सिस्टम 1,3, सतह बढ़ाया रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (SERS) चिह्नित करने के लिए लागू किया तकनीकों का एक व्यापक विविधता से बाहर सतहों 8,9,10,11 पर रासायनिक और जैविक प्रजातियों का पता लगाने के लिए एक बेहद होनहार पद्धति के रूप में उभरा है। SERS आणविक कंपन करने के लिए इसी अद्वितीय हस्ताक्षरों का कब्जा अनुमति देने के लिए सतह immobilized biomolecules (चित्रा 1) द्वारा एक रंग का प्रकाश की स्थिर बिखरने कार्यरत हैं। यह क्षमता लेबल, जटिल रसायन विज्ञान, या समय लेने वाली चरणों को शामिल किए बिना विभिन्न अणुओं के बीच भेद करने के लिए, SERS जैव का पता लगाने के एक संभावित बहुत कारगर तरीका बनाता है। SERS का एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इसकी उच्च संवेदनशीलता है। महान धातु nanostructures (SERS substrates,) के साथ बातचीत के दौरान प्रकाश के द्वारा स्थानीय सतह plasmons की उत्तेजना को नाटकीय ढंग से पूर्णांक बढ़ जाती हैरमन monolayers से एकल अणु सीमा 8,9,10,11 करने के लिए नीचे, अणुओं की बहुत थोड़ी मात्रा का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, विश्लेष्य द्वारा बिखरने की ensity। अंत में, सबसे biomolecules स्थिर हो जलीय समाधान की आवश्यकता है। पानी अक्सर सीमित रमन गतिविधि है, क्योंकि जलीय नमूनों से पृष्ठभूमि संकेत 9 कम से कम है। SERS के आवेदन पिछले एक दशक में 10 से अधिक एक घातीय वृद्धि का प्रदर्शन किया है। हालांकि, SERS का एक बहुत चर्चा की चुनौती रमन बिखरने के विद्युत चुम्बकीय वृद्धि plasmonic लहरों 11,12,13 प्रेरित कर रहे हैं, जहां धातु nanostructures के आकार, आकार, और रिक्ति पर गंभीर रूप से निर्भर करता है। सब्सट्रेट ज्यामिति के nanoscale आयामों पर आवश्यक है अधिक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य SERS माप को प्राप्त करने के लिए, नियंत्रित करते हैं।
चित्रा 1. सुप्रीम कोर्टसतह बढ़ाया रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का हीम।
SERS substrates, 11,12,13 निर्माण करने के लिए कार्यरत कई तरीके मोटे तौर पर नीचे-ऊपर और ऊपर से नीचे के तरीकों में वर्गीकृत किया जा सकता है। पहले प्रकार के तरीके आत्म विधानसभा या nanostructures के उत्पादन के लिए निर्देशित रासायनिक संश्लेषण की विभिन्न प्रक्रियाओं को रोजगार। अक्सर उदाहरण ठोस समर्थन करता है 11,12,13, थर्मल, धूम, या roughened धातु फिल्मों 11,12 की विद्युत बयान है, और विभिन्न रासायनिक संश्लेषण के तरीकों पर 13 monodisperse नैनोकणों के स्थिरीकरण शामिल संबोधित किया। इस तरह की तकनीक अपेक्षाकृत सरल और सस्ती हो जाते हैं हालांकि, उनमें से ज्यादातर एक संरचनाओं के स्थान पर नियंत्रण की कमी है, और सीमित नमूना नमूना reproducibility के द्वारा चुनौती दी है।
इसके विपरीत, ऊपर से नीचे लिथोग्राफी तकनीक सतहों पर वांछित पैटर्न बनाने के लिए इस तरह के कण मुस्कराते हुए के रूप में manipulable उपकरणों को रोजगार। सबसे अक्सर इस्तेमाल में से एकठोस समर्थन 11,12 पर अलग सब्सट्रेट डिजाइन के लिए अनुमति देने के लिए भी 10 एनएम और नीचे एक लचीलापन करने के लिए नीचे सुविधाओं पर नैनोलिथोग्राफी तरीकों, इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी (EBL), शानदार नियंत्रण प्रदान करता है। EBL में, इलेक्ट्रॉनों की एक किरण उजागर क्षेत्रों में एक रासायनिक परिवर्तन के कारण एक इलेक्ट्रॉन संवेदनशील सामग्री (विरोध) की एक सतह भर में व्यास स्कैन में कुछ नैनोमीटर के एक जगह करने के लिए नीचे ध्यान केंद्रित किया। सकारात्मक टोन के लिए इस तरह तैयार नहीं एक उपयुक्त विलायक (डेवलपर) में एक वृद्धि की विलेयता के लिए अग्रणी polymethylmethacrylate (PMMA) का विरोध रचना बहुलक श्रृंखला का बँटवारा में इलेक्ट्रॉन बीम लोगों तक पहुंचाने के परिणाम के रूप में। इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी की प्रक्रिया एक सब्सट्रेट पर विरोध का एक समान परत के स्पिन कोटिंग भी शामिल है; एक इलेक्ट्रॉन बीम के साथ एक निर्वात चैम्बर में लक्षित विरोध सामग्री के प्रदर्शन; और नमूने के विकास घुलनशील क्षेत्रों को दूर करने के लिए।
ऐसे जुड़े सिलिका के रूप में धातु nanostructures के नीचे ढांकता का समर्थन करता है, ख हैदिखाया een काफी होने के कारण ऐसे सिलिकॉन 14,15 के रूप में अन्य सामग्री की तुलना में plasmonic तरंगों का स्थानीयकरण करने के लिए SERS में तीव्रता बढ़ाने के लिए। हालांकि EBL patterning के ढांकता हुआ substrates पर, विशेष रूप से nanoscale पर, प्रदर्शन के दौरान बिल्ड अप को चार्ज करने के कारण महत्वपूर्ण चुनौतियों शामिल है। इससे पहले, हम इन कठिनाइयों का विरोध से ऊपर प्रवाहकीय बहुलक परतों रखकर दूर किया जा सकता है कि 16,17 से पता चला है। चित्रा 2 इनकार पर धातु nanostructures के उत्पादन के लिए धातु बयान और liftoff के द्वारा पीछा EBL जोखिम और विकास का उपयोग समग्र निर्माण की प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध से पता चलता है सिलिका का समर्थन करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
ई 2. योजना चित्रा। किरण लिथोग्राफी, धातु बयान, और liftoff के प्रक्रिया ढांकता हुआ substrates के 16-19 पर धातु nanostructures के निर्माण करने के लिए कार्यरत चरणों lectron इस पत्र में, हम EBL, substrates के जैव functionalization के द्वारा SERS substrates, निर्माण से जुड़े प्रक्रिया कदम का पूरा दृश्य उपस्थित है, और रमन स्पेक्ट्रा का संग्रह। हमारे हाल ही में काम करता 18,19 में पता लगाया तीन डिजाइनों (देखें आंकड़े 3 और 4, और तालिका 1) को संबोधित कर रहे हैं। डिजाइन एक में, पुनः संयोजक प्रोटीन एक एक जुड़े सिलिका (एफएस) का समर्थन 18 पर जैव क्रियाशील एयू के nanostructures पर स्थिर है, और प्रोटीन की SERS पता लगाने प्रदर्शन किया है। डिजाइन 2 में, पुनः संयोजक ग्लूकोज बाध्यकारी लिगेंड (ग्लूकोज़) के साथ और बिना प्रोटीन 21,26,27 नी-लेपित एफएस पर एजी nanostructures के बीच रिक्त स्थान में हिस्टडीन टैग के माध्यम से स्थिर है, और प्रोटीन से ग्लूकोज के बंधन पता चला है। डिजाइन 3 में, thiolated डोपामाइन बाध्यकारी डी.एन.एक aptamer 19,23 एफएस पर एयू के nanostructures पर स्थिर है, और स्थिर aptamer द्वारा डोपामाइन के बंधन प्रदर्शन किया है। सब्सट्रेट रमन स्पेक्ट्रा अधिग्रहण करने के लिए तैयारी, और विभिन्न biomolecules और स्थिरीकरण की रणनीतियों के प्रतिनिधि से सभी प्रासंगिक प्रायोगिक कदमों के समावेशी, इन उदाहरणों के SERS के विकास के लिए SERS द्वारा नैनो जैविक इंटरफेस पूछताछ अन्वेषण अनुसंधान से, आवेदन की एक व्यापक विविधता के लिए उपयोगी होते हैं एक मान्यता पद्धति के रूप में बाध्यकारी प्रोटीन या aptamer-ligand के रोजगार छोटे अणुओं की biosensors। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Immobiliza के तरीकों, विभिन्न biomolecules का उपयोग कर तीन प्रतिनिधि डिजाइन 3. योजनाएं चित्राtion, और सब्सट्रेट सामग्री: (ए) एक आत्म इकट्ठे monolayer डि पानी में 11-mercaptodecanoic एसिड की (एसएएम) (MUA) से क्रियाशील महान धातु नैनो डॉट्स पर स्थिर प्रोटीन एक; (बी) के महान धातु नैनो डॉट्स के बीच सब्सट्रेट सतह पर स्थिर ग्लूकोज़ के साथ complexed हिस्टडीन टैग ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन (जीबीपी); (सी) महान धातु नैनो डॉट्स पर स्थिर डोपामाइन (यूके) के साथ पूरा डोपामाइन बाध्यकारी aptamer thiol समाप्त। तालिका 1 में अधिक जानकारी के लिए देखें। पैनल (बी) से यह साफ डिजाइन 2 में, इसी ligand के बिना एक नमूना भी तुलना के लिए तैयार किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4।तीन डिजाइनों में कार्यरत biomolecules: (ए) के एक प्रोटीन; (बी) ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन और ग्लूकोज़; (सी) डीएनए aptamer और डोपामाइन बाध्यकारी डोपामाइन। में प्रोटीन तृतीयक संरचनाओं (क) और (ख) क्रमशः, और LINUXAMD64 के लिए VMD के साथ तैयार प्रोटीन डाटा बैंक, PDB आईडी 1BDD 20 और 2HPH 21, संस्करण 1.9.1 22 से ले रहे हैं। (ग) में aptamer माध्यमिक संरचना ValFold 24 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अनुक्रम में 23 से भविष्यवाणी की है और PseudoViewer 3.0 25 के साथ तैयार की है। जी, ए, टी, और सी गुआनिन, एडिनाइन, थाइमिन, और साइटोसिन न्यूक्लियोटाइड के अनुरूप पत्र, क्रमशः। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
डिजाइन एक </टीडी> | डिजाइन 2 | डिजाइन 3 | |
Biopolymer | एक प्रोटीन | ग्लूकोज बाध्यकारी प्रोटीन (जीबीपी) | डोपामाइन बंधन aptamer (यूके) |
बाइंडर | 11-Mercaptoundecanoic एसिड (MUA) आत्म इकट्ठे monolayer (एसएएम) | हिस्टडीन टैग | Thiol Linkers |
Ligand | कोई नहीं | ग्लूकोज़ | डोपामाइन |
समाधान | विआयनीकृत (डीआई) पानी | पोटेशियम फॉस्फेट बफर | Tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) और ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) बफर; फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) |
सब्सट्रेट | एफएस पर एयू संरचनाओं | नी-लेपित एफएस पर एजी संरचनाओं | एफएस पर एयू संरचनाओं |
नमूनों की गिरफ्तारीईए | एक्स 10 माइक्रोन चार माइक्रोन | एक्स 8 माइक्रोन चार माइक्रोन | एक्स 10 माइक्रोन चार माइक्रोन |
पैटर्न | एयू डॉट्स, 50 एनएम पिच | एजी डॉट्स, 40 एनएम पिच | एयू hexagons, 200 एनएम पिच |
एजी hexagons, 200 एनएम पिच | एयू असंरचित पैड | ||
एजी असंरचित पैड | |||
EBL जोखिम खुराक | डॉट्स: | डॉट्स: 105 μC / 2 सेमी | Hexagons: 180 μC / 2 सेमी |
ऐरे मैं 120 μC / 2 सेमी | Hexagons: 170 μC / 2 सेमी | ||
ऐरे द्वितीय 96 μC / 2 सेमी | |||
ऐरे तृतीय 72μC / 2 सेमी | |||
लेजर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य | 532 एनएम | 532 एनएम | 780 एनएम |
तालिका 1. नैनो जैविक प्रणालियों के तीन डिजाइन।
SERS कई अद्वितीय फायदे की पेशकश जैव का पता लगाने के एक अत्यंत शक्तिशाली तकनीक के रूप में एक मान्यता प्राप्त कर रहा है। अत्यंत उच्च संवेदनशीलता विश्लेष्य 9,10,11,35 की बहुत थोड़ी मात्रा का पता लगाने के लिए यह संभव बनाता है, जबकि आणविक कंपन के साथ संबंध चुनिंदा SERS स्पेक्ट्रा से विशिष्ट analytes की "उंगलियों के निशान" की पहचान करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, SERS भी पानी के लिए अपेक्षाकृत असंवेदनशील है कि एक nondestructive तकनीक है, और इस तरह यह बहुत अच्छी तरह से उनके प्राकृतिक जलीय पर्यावरण 9 में जैविक सामग्री की जांच के लिए अनुकूल है। प्रस्तुत परिणाम इन फायदों के साथ ही आगे जैव पता लगाने के लिए एक बहुत ही लचीला लेबल से मुक्त तकनीक के रूप में SERS की मजबूत क्षमता प्रदर्शित जोर। अलग सब्सट्रेट-immobilized biomolecules के monolayers के रोजगार तीन डिजाइनों में, रमन मोड आत्मविश्वास से विशेष analytes के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि खोजा गया है। यही कारण है कि इन biomolecules, का पता लगाने के ओआर उनके संबंधित ligands, SERS substrates के लिए समर्थन के रूप में जुड़े सिलिका की तलीय सतहों को रोजगार का प्रदर्शन किया गया है, इलेक्ट्रॉनिक की सतहों के साथ जैविक सामग्री interfacing जैव इलेक्ट्रॉनिक आर्किटेक्चर उभरते के साथ संबंध में अनेक अनुप्रयोगों का वादा किया है, वर्तमान इलेक्ट्रॉनिक्स और microfluidics सेटिंग्स के साथ संगत डिजाइन बनाता है और विद्युत उपकरणों 2,3। महत्वपूर्ण बात है, दो तीन के डिजाइनों में SERS पता लगाने मान्यता तत्व के रूप में, इस तरह के ग्लूकोज और डोपामाइन, क्रमशः सतह immobilized प्रोटीन और aptamer के monolayers के रोजगार के रूप में छोटे अणुओं की विशिष्ट बंधनकारी के लिए प्रदर्शन किया गया है।
हालांकि, कई पहलुओं "पर चिप" सेटिंग में एक कुशल SERS जैव-खोज को प्राप्त करने के क्रम में ध्यान रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, सबसे biomolecules के लिए आम है कि एक जाने-माने चुनौती ऐसे शुष्क पर्यावरण के रूप में गैर प्राकृतिक परिस्थितियों से अवगत कराया है, खासकर जब नीचा करने के लिए उनकी प्रवृत्ति हैपर्यावरण या तीव्र प्रकाश लेजर। प्रोटोकॉल के दौरान, हम हमेशा रमन स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण करने के लिए नमूनों की तैयारी से पूरे प्रयोग के दौरान उचित समाधान में डूबे जैव क्रियाशील नमूने रखने के महत्व पर जोर दिया है। बाद के लिए, एक कस्टम पानी के सबूत चैम्बर लेजर जोखिम के दौरान तरल के वाष्पीकरण से बचने के लिए (चित्रा 7) बनाया गया है। नमूनों की क्षति से बचने के लिए प्रोटोकॉल के कदम 5.3 में वर्णित के रूप में जोखिम और लेजर तीव्रता की अवधि भी सीमित किया जाना चाहिए।
SERS का पता लगाने के परिणामों कार्यरत सब्सट्रेट, और धातु nanostructures की विशेष रूप से अंतर-सुविधा जुदाई की ज्यामिति के प्रति संवेदनशील पाए जाते हैं। यह आंकड़े 8 और 9 से इस प्रकार के रूप में, डिजाइन एक नमूनों की SERS तीव्रता जुड़े सिलिका पर एयू नैनो डॉट्स के बीच अंतराल की चौड़ाई पर दृढ़ता से निर्भर करता है। एयू nanodots से बाहर के तीन सरणियों मैं परीक्षण कियाn इस डिजाइन (चित्रा 8), उच्चतम रमन तीव्रता एयू सुविधाओं के बीच सबसेसंकरेमें अंतराल है और इसलिए इसे और अधिक कुशल विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र वृद्धि प्रदान करता है जो ऐरे मैं, साथ हासिल की है। 9 चित्रा रूप में दिखाता है, 10-20 एनएम या उससे कम के स्तर पर अंतर-सुविधा separations के नियंत्रण की आवश्यकता है। SERS substrates, fabricating के लिए EBL रोजगार, यहां प्रदर्शन के रूप में, अंतर-सुविधा अंतराल की चौड़ाई को नियंत्रित करने के लिए विशेष रूप से एक कुशल संकल्प प्रदान करता है। एक सकारात्मक टोन EBL साथ PMMA के रूप में इस तरह के विरोध, PMMA, मास्क में छेद के आकार बस जोखिम खुराक बदलने के द्वारा अलग किया जा सकता है। लिफ्ट बंद करने के बाद इस गढ़े धातु डॉट्स के विभिन्न आकारों में यह परिणाम है, और 18 खुराक उचित EBL लोगों तक पहुंचाने का चयन करके वांछित के रूप में डॉट्स के बीच अंतराल की चौड़ाई देखते जा सकता है।
अन्य चुनौती विशिष्ट जैव-खोज आवेदन के लिए SERS सब्सट्रेट ज्यामिति का अनुकूलन है। वृद्धि प्रभाव मैं यद्यपिअंतर-सुविधा अंतराल की कमी के साथ ncreases, जैविक अणुओं के अपेक्षाकृत बड़े आकार के अंतराल हो सकता है कि कैसे संकीर्ण पर सीमाओं लगाता है। इस पर नहीं डॉट्स खुद को (3B चित्रा देखें), स्थिरीकरण विधि प्रोटीन कुशलता से केवल महान धातु डॉट्स के बीच सतह को बांधता है कि इस तरह की है, जहां डिजाइन 2, के लिए परिणाम से स्पष्ट है। यह आंकड़ा 10 से इस प्रकार के रूप में, असंरचित एजी पैड के लिए SERS स्पेक्ट्रा विश्लेष्य से किसी भी बैंड नहीं दिखाते। पैड बहुत पतली अंतर-द्वीप अंतराल के साथ एक नैनो क्रिस्टलीय संरचना का प्रदर्शन हालांकि इन कमियों एक प्रोटीन अणु को समायोजित करने के लिए बहुत संकीर्ण हैं (चित्रा 6F देखें)। फिर भी जटिलता का एक और आयाम प्रोटीन ligand के बंधन का पता लगाया जाना है जब जोड़ा गया है। चित्रा 10 में, SERS सीएच बैंड परिकल्पित जीबीपी रचना में परिवर्तन के द्वारा समझाया जा सकता है, जो लिगेंड से मुक्त एक में से ligand बाध्य जीबीपी से स्पेक्ट्रा में और अधिक स्पष्ट कर रहे हैं, ग्लूकोज़ दो 7,27 के बंधन में वृद्धि हुई रमन गतिविधि के साथ एक और अधिक कठोर संरचना में जिसके परिणामस्वरूप पर। एक दो nanostructured substrates के ligand के मुक्त प्रोटीन से सीएच बैंड ligand बाध्य प्रोटीन से प्रोटीन और ग्लूकोज सीएच बैंड दोनों नैनो hexagons के साथ और अधिक स्पष्ट कर रहे हैं, जबकि नैनो डॉट्स सब्सट्रेट के साथ प्राप्त SERS स्पेक्ट्रा में मजबूत है तुलना तो सब्सट्रेट। दो कारकों इन मतभेदों में कमी की उम्मीद कर रहे हैं, एजी के बीच की जगह की उपलब्धता जीबीपी नी करने के लिए बाध्य कर सकता है, जहां सुविधाएँ, और 'हॉट स्पॉट' में बिखरने रमन के विद्युत चुम्बकीय वृद्धि करने के लिए ligand के समयबद्ध और ligand मुक्त प्रोटीन की संवेदनशीलता इन सुविधाओं के बीच। एक तरफ, नैनो डॉट्स पैटर्न प्रोटीन एजी नैनो डॉट्स सब्सट्रेट पर ग्लूकोज मुक्त जीबीपी के लिए मनाया एक और अधिक स्पष्ट सीएच बैंड समझा जा सकता है, जो बाँध के लिए के लिए नी कोटिंग उपलब्ध है, जहां एक अपेक्षाकृत बड़ा अंतर-सुविधा क्षेत्र प्रदान करता है। दूसरी ओर, उनके गैर वर्दी struc कारणसंरचना (चित्रा 6D देखें), एजी नैनो hexagons नैनो hexagons सब्सट्रेट पर ग्लूकोज बाध्य जीबीपी से मजबूत सीएच कंपन बैंड में जिसके परिणामस्वरूप नैनो hexagons भीतर एजी द्वीपों के बीच संकीर्ण अंतराल में एक मजबूत विद्युत चुम्बकीय वृद्धि दिखाने के लिए खतरा हो सकता है। इस परस्पर क्रिया के कुछ विवरण आगे सत्यापन की आवश्यकता होती है, और इस तरह के जीबीपी के रूप में बड़े प्रोटीन को शामिल जटिल analytes के लिए SERS substrates के अनुकूलन पाइपलाइन में अब भी है।
अन्य घटकों नहीं कर रहे हैं, जबकि केवल ligand के एक चयनित क्षेत्र में सक्रिय रमन, जब जाहिर है, एक मान्यता तत्व के रूप में immobilized biomolecules रोजगार बाध्यकारी ligand के SERS का पता लगाने में मदद की है। इस aptamer बाध्य डोपामाइन का स्पष्ट SERS बैंड प्राप्त कर रहे हैं, जहां डिजाइन 3, (चित्रा 11) का मामला है। aptamer-डोपामाइन जोड़ी उत्कृष्ट विशिष्टता दर्शाती है और SERS स्पेक्ट्रम किसी भी महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि संकेत बिना स्पष्ट बैंड शामिल हैं।
<p class="jove_content"> लेबल शुल्क SERS प्रौद्योगिकी के भविष्य अग्रिम अलग सतह nanostructure डिजाइन की एक व्यापक रेंज के साथ biomolecules 'SERS संकेत वृद्धि के व्यापक परीक्षण शामिल होगा। प्रत्यक्ष लिखने इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी का उपयोग, यहाँ प्रस्तुत नमूना तैयार प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त, आकार, आकार, और अंतर-फीचर जुदाई पर नियंत्रण का एक शानदार स्तर के साथ विभिन्न nanostructures के निर्माण करने के लिए परिणामों की तुलना और पार सत्यापन प्राप्त की सुविधा होगी विभिन्न अनुसंधान समूहों द्वारा। SERS substrates, विधियों 11,12,13 "नीचे से ऊपर" वैकल्पिक रोजगार निर्मित कर रहे हैं जब इस का एक व्यापक विविधता के लिए इष्टतम सब्सट्रेट डिजाइन का एक विश्वसनीय पहचान की ओर धातु nanostructure के आकार और स्थिति का एक बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, reproducibility के प्रमुख चुनौती का पता होता एप्लीकेशन। इन तकनीकों के scalability बाद में इस तरह के नैनो के रूप में पूरक नैनोलिथोग्राफी तरीकों के साथ EBL संयोजन से सुधार किया जा सकता हैnanoscale के डिजाइन के भविष्य के बड़े पैमाने पर उत्पादन की ओर छाप लिथोग्राफी 19 ट्यून करने योग्य EBL तकनीक काम अनुकूलित।The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside, and Albert Cao for their help in developing and preparing the protein conjugates as well as the DNA aptamer; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar, and Trevor Olsen for their assistance in the sample preparation, Jonathan Mane for his assistance in generating images of the molecular structures; and the funding sources including the National Research Council of Canada – National Institute for Nanotechnology (NRC-NINT), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), and the University of Alberta for supporting the work.
11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) | Sigma Aldrich (www.sigmaalrich.com) |
450561 ALDRICH | Used for surface functionalization in Design 1 |
Conductive polymer | Mitsubishi Rayon (www.mrc.co.jp) |
aquaSAVE-57xs | A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures |
D-glucose | Collaborator Lab. | Ligand in Design 2 | |
Dopamine | Collaborator Lab. | Ligand in Design 3 | |
Dopamine binding aptamer (DBA) | Integrated DNA Technologies Inc. (www.idtdna.com) |
5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3' | Biopolymer in Design 3 |
Fused silica wafers | Mark Optics www.markoptics.com |
||
Glucose binding protein (GBP) | Collaborator Lab. (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532) |
PDB ID 2HPH | Biopolymer in Design 2 |
High vacuum grease | Dow Corning (www.dowcorning.com) |
Used to seal water-proof chamber, step 5.1 | |
Hydrogen Peroxide 30%, H2O2 | J.T. Baker | Used for pirahna solution, step 1.2 | |
N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich www.sigmaaldrich.com |
03450 FLUKA | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) |
130672 ALDRICH | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
Potassium phosphate buffer | Collaborator Lab. | Buffer used in Raman sampling | |
Phosphate buffered | Collaborator Lab. | Solvent in Design 3 | |
saline (PBS) | |||
Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2 | MicroChem (www.microchem.com) |
A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist | |
Recombinant protein A | Protein Mods Inc (www.proteinmods.com) |
PDB ID 1BDD (www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd) |
Biopolymer in Design 1 |
Sulfuric acid 96%, H2SO4 | J.T. Baker | Used for pirahna solution, step 1.2 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer | Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) |
T9285 SIGMA | Buffer in Design 3 |
Dicing saw | Diamond Touch Technology Inc. | Used to cut FS wafer, step 1.1 | |
(17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO) | |||
Electron beam evaporator | Kurt J. Lesker (www.lesker.com) |
Used for Au and Ag evaporation | |
Electron beam evaporator | Johnsen Ultravac (JUV) (www.ultrahivac.com) |
JuV E-gun | Used for Ni evaporation |
Microscope cover slips (25 mm) | Fisher Scientific (www.fishersci.ca) |
12-545-102 | Used in water-proof chamber, step 5.1 |
Microscope slides (3×1 in.) | Fisher Scientific (www.fishersci.ca) |
Used in water-proof chamber, step 5.1 | |
Raith 150TWO EBL exposure system | Raith Inc. (www.raith.com) |
Raith 150TWO system | Used for EBL exposures, step 2.2 |
Raman microscope | Thermo Scientific (www.thermoscientific.com) |
Nicolet Almega XR | Used for Raman spectroscopy, step 5.3 |
Sonicator system | Branson (www.bransonic.com) |
Used for liftoff and solutions mixing | |
Spinner | Brewer Spinner and Hotplate (www.brewerscience.com) |
Cee 200X and Cee 1300X | Used to spin-coat PMMA and conductive polymer, step 2.1 |