We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated.
Fabrikasjon og karakterisering av konjugerte nano biologiske systemer grensesnitt metalliske nanostrukturer på fast underlag med immobiliserte biomolekyler er rapportert. Hele sekvensen av relevante eksperimentelle fremgangsmåten er beskrevet, som omfatter fremstilling av nanostrukturerte substrater ved hjelp av elektronstrålelitografi, immobilisering av biomolekyler på substratene, og deres karakterisering utnytte overflate forbedret Raman-spektroskopi (SERS). Tre forskjellige design av nano biologiske systemer er ansatt, inkludert protein A, glukose bindende protein, og en dopamin bindende DNA aptamer. I de to sistnevnte tilfeller binding av respektive ligander, D-glukose og dopamin, er også inkludert. De tre typer av biomolekyler er immobilisert på nanostrukturerte substrater av forskjellige metoder, og resultatene av SERS avbildning blir rapportert. Egenskapene til SERS å detektere vibrasjonsmodi fra overflate immobiliserte proteiner, så vel som for å fange protein-ligand-end aptamer-ligandbindende blir demonstrert. Resultatene viser også innflytelsen av overflatenanostrukturen geometri, biomolekyler immobilisering strategi, Raman-aktivitet av molekylene og tilstedeværelse eller fravær av den ligand binding på SERS spektra ervervet.
Evner til å utvikle og karakter konjugerte nano biologiske systemer grensesnitt solide nanostrukturer og biologiske polymerer blir stadig viktigere for ytterligere fremskritt innen neste generasjons bio-sensing og bio-aktiverings teknologier 1,2. Dette innebærer tverrfaglige studier på tvers av en rekke forskningsfelt, for eksempel fabrikasjon av relevante solid-state komponenter (mikro-eller nano-elektroder, nano-konstruert belegg, nanotråder, eller nanopartikler) 2,3,4; immobilisering av biomolekyler på flatene for å skape ønskede bioconjugates 5,6,7; og overvåking av nano biologisk grensesnitt 1. I de fleste tilfeller er valg av optimal fabrikasjon, bio-funksjon, og karakterisering metoder sterkt inter-relatert. Åpenbart vil valget av Nanofabrication teknikker bli drevet av kravene til halvlederkomponenter i systemet, som i stor grad avhengig av påvisningsmetoden, som i turn er bestemt av arten av de biopolymerer som er involvert, og hensikten med å overvåke grenseflaten.
Ut av et bredt spekter av teknikker som brukes for å karakterisere Bioconjugate systemer 1,3, overflaten forbedret Raman-spektroskopi (SERS) har dukket opp som en svært lovende metode for påvisning av kjemiske og biologiske arter på overflater 8,9,10,11. SERS syssels uelastisk spredning av monokromatisk lys ved overflate immobilisert biomolekyler (figur 1) slik at fangst av unike signaturer som tilsvarer molekylære vibrasjoner. Denne evnen til å skille mellom ulike molekyler uten å involvere etiketter, kompleks kjemi, eller tidkrevende trinn, gjør SERS en potensielt svært effektiv metode for bio-gjenkjenning. En annen viktig fordel med SERS er den høye følsomhet. Eksitasjon av lokaliserte overflateplasmons av lys i samspill med edle metall nanostrukturer (SERS substrater) øker dramatisk intensity av Raman spredning av analytten, slik at påvisning av meget små mengder av molekyler, fra monolag ned til enkelt-molekyl grense 8,9,10,11. Endelig er de fleste biomolekyler krever vandige oppløsninger for å være stabil. Fordi vann har ofte begrenset Raman aktivitet, er bakgrunnssignal fra vandige prøver minimert 9. Anvendelser av SERS har utstilt en eksponentiell økning det siste tiåret 10. Men en omdiskutert utfordring SERS er at den elektromagnetiske forbedring av Raman-spredning avhenger kritisk av størrelsen, formen og avstanden mellom metallnanostrukturer hvor Plasmonic bølger blir indusert 11,12,13. For å oppnå effektive og reproduserbare målinger SERS, kontroll over substratet geometri er nødvendig på nanoskala dimensjoner.
Figur 1. Scheme av overflate forbedret Raman-spektroskopi.
Mange metoder som benyttes for å dikte SERS underlag 11,12,13 kan grovt deles inn i bottom-up og top-down metoder. Metoder for den første typen benytter ulike prosesser av selvbygging eller rettet kjemisk syntese å produsere nanostrukturer. Ofte adressert eksempler er immobilisering av monodisperse nanopartikler på faste støtte 11,12,13, termisk, frese, eller elektrokjemisk deponering av ru metall filmer 11,12, og ulike kjemiske syntesemetoder 13. Selv om slike teknikker har en tendens til å være forholdsvis enkel og billig, er de fleste av dem utfordret av en mangel på kontroll over plasseringen av strukturer, og begrenset sample-til-sample reproduserbarhet.
I kontrast, top-down litografi teknikker ansette manipulable instrumenter som partikkelstråler for å skape ønskede mønstre på overflater. En av de mest bruktenanolithography metoder, elektronstråle litografi (EBL), tilbyr suveren kontroll over funksjoner ned til under 10 nm og også en fleksibilitet til å tillate ulike substrat design på fast underlag 11,12. I EBL, en stråle av elektroner rettet ned mot en flekk av noen få nanometer i diameter skanninger tvers av en overflate av et elektron følsomt materiale (motstå) å bevirke en kjemisk forandring i eksponerte områder. For positiv tone motstår som polymethylmethacrylate (PMMA), elektron resultater eksponerings bjelke i spalting av polymerkjedene som utgjør motstå, som fører til en økt løselighet i et passende løsemiddel (utbygger). Prosessen med elektronstrålelitografi omfatter spinn-belegging av et ensartet lag av motstand på et substrat; eksponering av det målrettede motstå materiale i et vakuumkammer med en elektronstråle; og utvikling av prøven for å fjerne de oppløselige områder.
Dielektriske stolper under metalliske nanostrukturer, for eksempel smeltet silisiumdioksid, har been vist til en betydelig øke intensiteten i SERS grunn av lokalisering av Plasmonic bølger i forhold til andre materialer som silisium 14,15. Men EBL mønster på dielektriske underlag, spesielt på nanonivå, innebærer betydelige utfordringer som følge av lade oppbygging under eksponering. Tidligere har vi vist 16,17 at disse vanskelighetene kan overvinnes ved å anbringe ledende polymerlag over resisten. Figur 2 viser en skjematisk fremstilling av den samlede fremstillingsprosess ved bruk av EBL eksponering og utvikling fulgt av metallavsetning og liftoff å produsere metallnanostrukturer for smeltet silisiumdioksydbærere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Scheme av eLectron bjelke litografi, metall avsetning, og liftoff prosessen trinn ansatt for å dikte metalliske nanostrukturer på dielektriske underlag 16-19. I denne artikkelen presenterer vi hele sekvensen av prosesstrinn som involverer SERS underlag fabrikasjon av EBL, bio-funksjon av underlag, og samling av Raman-spektrene. Tre utførelser utforsket i våre nyere arbeider 18,19 er adressert (se figur 3 og 4, og tabell 1). I design 1, er rekombinant protein A immobilisert på bio-funksjonalisert Au nanostrukturer på et smeltet silisiumdioksyd (FS) støtte 18, og SERS påvisning av proteinet er vist. I Design 2, rekombinant glukose-bindende protein 21,26,27 med og uten ligand (D-glukose) er immobilisert ved hjelp av histidin-koder i mellomrommene mellom Ag nanostrukturer på Ni-belagte FS, og bindingen av glukose til proteinet blir detektert. I Design 3, tiolert dopamin-bindende DNEn aptamer 19,23 er immobilisert på Au nanostrukturer på FS, og binding av dopamin ved immobilisert aptamer blir demonstrert. Inklusive alle relevante eksperimentelle skritt fra forbehandling til Raman spektra oppkjøpet, og representant for ulike biomolekyler og strategier for immobilisering, disse eksemplene er nyttige for et bredt spekter av applikasjoner, fra leting forskning avhør nano-biologisk grensesnitt ved SERS til utvikling av SERS biosensorer av små molekyler som syssels protein- eller aptamer-ligandbinding som en anerkjennelse metode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Ordninger av tre representative design ved hjelp av ulike biomolekyler, metoder for immobilizasjon, og substrat-materialer: (a) protein A immobilisert på edelmetallnano prikker funksjonalisert ved en selv-sammenstilt monolag (SAM) 11-mercaptodecanoic syre (MUA) i DI vann; (B) histidin-merket glukose-bindende protein (GBP) kompleksdannet med D-glukose immobilisert på substratoverflaten mellom edelmetallnano punkter; (C) tiol-terminert dopamin bindende aptamer ferdig med dopamin (DBA) immobilisert på edle metall nano prikker. Se nærmere omtale i tabell 1. I Design 2 illustrert av panel (B), ble en prøve uten tilsvarende ligand også forberedt for sammenligning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4.Biomolekyler ansatt i tre utførelser: (A) protein A; (B) glukose bindende protein, og D-glukose; (C) dopamin bindende DNA aptamer og dopamin. Protein tertiære strukturer i (a) og (b) er hentet fra Protein Databanken, PDB ID 1BDD 20 og 2HPH 21, henholdsvis, og trukket med VMD for LINUXAMD64, versjon 1.9.1 22. Den aptamer sekundærstruktur i (c) er spådd fra sekvensen 23 bruker ValFold 24 programvare og trukket med PseudoViewer 3.0 25. Bokstavene G, A, T, og C tilsvarer guanin, adenin, tymin, og cytosin nukleotider, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Design 1 </td> | Design 2 | Design 3 | |
Biopolymer | Protein A | Glukose bindende protein (GBP) | Dopamin bindende aptamer (DBA) |
Binder | 11-Mercaptoundecanoic syre (MUA) selv-montert monolayer (SAM) | Histidin tags | Tiol linkere |
Ligand | None | D-glucose | Dopamin |
Oppløsning | Deionisert (DI) vann | Kaliumfosfatbuffer | Tris (hydroksymetyl) aminometan (TRIS) og etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) buffer; Fosfatbufret saltvann (PBS) |
Substrat | Au strukturer på FS | Ag strukturer på Ni-belagt FS | Au strukturer på FS |
Mønstret area | 4 mikrometer x 10 mikrometer | 4 mikrometer x 8 mikrometer | 4 mikrometer x 10 mikrometer |
Mønster | Au prikker, 50 nm banen | Ag prikker, 40 nm banen | Au sekskanter, 200 nm banen |
Ag sekskanter, 200 nm banen | Au ustrukturerte pads | ||
Ag ustrukturerte pads | |||
EBL eksponeringsdoser | Dots: | Dots: 105 mikrochipen / cm 2 | Hexagons: 180 mikrochipen / cm 2 |
Array jeg 120 mikrochipen / cm 2 | Hexagons: 170 mikrochipen / cm 2 | ||
Array II 96 mikrochipen / cm 2 | |||
Array III 72Mikrochipen / cm 2 | |||
Laser eksiteringsbølgelengde | 532 nm | 532 nm | 780 nm |
Tabell 1. Tre design av nano biologiske systemer.
SERS er å få en anerkjennelse som en ekstremt kraftig teknikk av bio-deteksjon tilbyr mange unike fordeler. Forholdet med molekylære vibrasjoner gjør det mulig selektivt å identifisere "fingeravtrykk" av bestemte analytter fra SERS spektra, mens den ekstremt høye følsomhet som gjør det mulig å detektere meget små mengder av analytten 9,10,11,35. Videre er SERS en destruktiv teknikk som også er relativt ufølsom for vann, og dermed er det veldig godt egnet for undersøkelser av biologisk materiale i sitt naturlige vandig miljø 9. Resultatene presenteres understreke disse fordelene samt ytterligere demonstrere stort potensial for SERS som en svært fleksibel etikett-fri teknikk av bio-gjenkjenning. I tre utførelser som anvender monolag av forskjellige substrat-immobiliserte biomolekyler, har Raman modi blitt oppdaget at kunne trygt tilskrives de spesielle analytter. At påvisning av disse biomolekyler, or deres respektive ligander, har blitt demonstrert ved anvendelse av plane overflater av smeltet silisiumdioksyd som støtte for SERS substrater, gjør de utførelser som er kompatible med dagens elektronikk og Microfluidics innstillinger, lovende tallrike anvendelser i forbindelse med nye bio-elektronisk grensesnitt arkitekturer biologiske materialer med overflater av elektroniske og elektrokjemiske enheter 2,3. Viktigere, i to av tre design SERS deteksjon er vist for spesifikk binding av små molekyler, som glukose og dopamin, syssels monolag av overflaten-immobilisert protein og aptamer, henholdsvis som gjenkjennelseselementer.
Imidlertid bør flere aspekter tas vare på for å oppnå en effektiv SERS bio-deteksjon i "on-chip" innstilling. Først av alt, en velkjent utfordring som er vanlig for de fleste biomolekyler er deres tilbøyelighet til å nedbrytes, særlig når de utsettes for ikke-naturlige tilstander slik som tørr omgivmiljø eller intense laserlys. Gjennom protokollen, har vi understreket viktigheten av alltid å holde bio-funksjon prøver nedsenket i hensiktsmessige løsninger under hele forsøket, fra utarbeidelse av prøvene til oppkjøpet av Raman spektra. For den sistnevnte, har en tilpasset vanntette kammer er konstruert (figur 7) for å unngå fordampning av væsken under lasereksponering. Varigheten av eksponeringen og laserintensiteten bør også være begrenset, som beskrevet i trinn 5.3 i protokollen for å unngå skade på prøvene.
Resultatene av SERS deteksjon er funnet følsom for geometrien av substratet som anvendes, og spesielt inter-funksjonen separering av de metalliske nanostrukturer. Som det fremgår av figurene 8 og 9, den SERS intensiteten av Design en prøvene sterkt avhengig av bredden av gapene mellom Au nano prikker på smeltet silisiumdioksyd. Ut av tre matriser av Au nanodots testet jegn denne utforming (figur 8) blir den høyeste Raman intensitet som oppnås med Array I, som har den smaleste mellomrom mellom Au funksjoner og derfor gir en mer effektiv elektromagnetisk feltøkning. Som figur 9 viser, er kontroll av inter-funksjonen separasjoner på nivå med 10 til 20 nm eller mindre nødvendig. Ansette EBL for å fabrikkere Sers underlag, som demonstrert her, gir en effektiv oppløsning spesielt for å kontrollere bredden på inter har hull. Med en positiv-tone EBL motstå slik som PMMA, kan størrelsen på hullene i PMMA masker varieres ved ganske enkelt å endre eksponeringsdoser. Etter avløftingen dette resulterer i forskjellige størrelser av metall prikker, og bredden av spaltene mellom punkter kan innstilles etter ønske ved å velge riktig EBL eksponeringsdoser 18.
Den andre utfordringen er optimalisering av geometri SERS substrat for spesifikke bio-deteksjon søknad. Selv om forbedring effekt increases med en nedgang på mellom har hull, den relativt store størrelsen på biologiske molekyler pålegger begrensninger på hvor smal hullene kan være. Det er tydelig fra resultatene for Design 2, hvor immobiliseringen fremgangsmåte er slik at proteinet effektivt kun bindes til overflaten mellom edelmetall prikker, men ikke til de punkter selv (se figur 3B). Som det følger av figur 10, gjør SERS spektra for ustrukturerte Ag pads ikke vise noen band fra analytten. Selv om pads utviser en nano-krystallinsk struktur med svært tynne inter-øya hull (se figur 6F) disse hullene er for smale til å romme et proteinmolekyl. Enda en annen dimensjon av kompleksitet tilsettes når protein-ligand-binding må bli detektert. I figur 10 er SERS CH band er mer uttalt i spektrene fra ligand-bundet GBP enn i ligand-fri en, som kan være hypotetisk forklares ved en endring i GBP konformasjonved binding av D-glukose 2 7,27, noe som resulterer i en mer stiv konstruksjon med øket Raman-aktivitet. Hvis man sammenligner de to nanostrukturerte underlag, CH band fra ligand-free protein er sterkere i SERS spektra tatt med nano-prikker substrat, mens både protein og glukose CH band fra ligand-bundet protein er mer uttalt med nano-sekskanter substrat. To faktorer forventes å resultere i disse forskjellene, tilgjengeligheten av plass mellom Ag har der GBP kunne binde seg til Ni, og mottakelighet av ligand-bundet og ligand gratis protein til den elektromagnetiske forbedring av Raman spredning i "hot spots" mellom disse funksjonene. På den ene siden, nano prikker mønster gir en relativt større inter-funksjonen område hvor Ni belegget er tilgjengelig for å binde proteinet, noe som kan forklare en mer uttalt CH båndet observert for glukose-fri GBP på Ag nano prikker substrat. På den annen side, på grunn av deres ikke-uniform strukTure (se figur 6D), kan Ag nano-sekskanter være tilbøyelige til å vise en sterkere elektro forbedring i trange åpninger mellom Ag øyene innenfor nanosekskanter som fører til sterkere CH vibrasjons band fra glukose-bundet GBP på nano-sekskanter underlaget. Noen detaljer av denne veksel krever ytterligere verifisering, og optimalisering av SERS substrater for komplekse analytter som involverer store proteiner slik som GBP er fortsatt i rørledningen.
Åpenbart er SERS påvisning av ligand binding anvender immobiliserte biomolekyler som en gjenkjenningselementet lettes når bare liganden er Raman aktiv i et valgt område, mens de andre komponenter er ikke. Dette er tilfellet for oppbygging 3, hvor de forklarte SERS bånd aptamer-bundet dopamin erholdt (figur 11). Den aptamer-dopamin paret viser utmerket spesifisitet og SERS spekteret omfatter uttalt band uten betydelig bakgrunnssignal.
<p class="jove_content"> Future forkant av etiketten-fee SERS teknologi vil innebære omfattende tester av biomolekyler 'SERS signalforsterkning med et bredt spekter av ulike overflatenanostrukturen design. Bruken av direkte-skrive elektronstråle litografi å dikte ulike nanostrukturer med en ypperlig grad av kontroll over størrelse, form, og inter-feature separasjon, kombinert med prøveopparbeidelse protokoller som presenteres her, ville lette sammenligning og kryssvalidering av resultatene oppnådd av ulike forskningsmiljøer. Dette vil løse den store utfordringen for reproduserbarhet når SERS underlag er fabrikkert ansette alternative "bottom up" metoder 11,12,13, noe som åpner for en bedre kontroll av metall nanostrukturen størrelse og plassering mot en pålitelig identifisering av optimal underlaget design for et bredt spekter av applikasjoner. Skalerbarhet av disse teknikkene kan senere bli bedre ved å kombinere EBL med utfyllende nanolithography metoder som nanoavtrykk litografi 19 mot fremtidig masseproduksjon av nanoskala design optimalisert ansette tunbare EBL teknikker.The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside, and Albert Cao for their help in developing and preparing the protein conjugates as well as the DNA aptamer; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar, and Trevor Olsen for their assistance in the sample preparation, Jonathan Mane for his assistance in generating images of the molecular structures; and the funding sources including the National Research Council of Canada – National Institute for Nanotechnology (NRC-NINT), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), and the University of Alberta for supporting the work.
11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) | Sigma Aldrich (www.sigmaalrich.com) |
450561 ALDRICH | Used for surface functionalization in Design 1 |
Conductive polymer | Mitsubishi Rayon (www.mrc.co.jp) |
aquaSAVE-57xs | A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures |
D-glucose | Collaborator Lab. | Ligand in Design 2 | |
Dopamine | Collaborator Lab. | Ligand in Design 3 | |
Dopamine binding aptamer (DBA) | Integrated DNA Technologies Inc. (www.idtdna.com) |
5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3' | Biopolymer in Design 3 |
Fused silica wafers | Mark Optics www.markoptics.com |
||
Glucose binding protein (GBP) | Collaborator Lab. (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532) |
PDB ID 2HPH | Biopolymer in Design 2 |
High vacuum grease | Dow Corning (www.dowcorning.com) |
Used to seal water-proof chamber, step 5.1 | |
Hydrogen Peroxide 30%, H2O2 | J.T. Baker | Used for pirahna solution, step 1.2 | |
N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich www.sigmaaldrich.com |
03450 FLUKA | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) |
130672 ALDRICH | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
Potassium phosphate buffer | Collaborator Lab. | Buffer used in Raman sampling | |
Phosphate buffered | Collaborator Lab. | Solvent in Design 3 | |
saline (PBS) | |||
Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2 | MicroChem (www.microchem.com) |
A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist | |
Recombinant protein A | Protein Mods Inc (www.proteinmods.com) |
PDB ID 1BDD (www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd) |
Biopolymer in Design 1 |
Sulfuric acid 96%, H2SO4 | J.T. Baker | Used for pirahna solution, step 1.2 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer | Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) |
T9285 SIGMA | Buffer in Design 3 |
Dicing saw | Diamond Touch Technology Inc. | Used to cut FS wafer, step 1.1 | |
(17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO) | |||
Electron beam evaporator | Kurt J. Lesker (www.lesker.com) |
Used for Au and Ag evaporation | |
Electron beam evaporator | Johnsen Ultravac (JUV) (www.ultrahivac.com) |
JuV E-gun | Used for Ni evaporation |
Microscope cover slips (25 mm) | Fisher Scientific (www.fishersci.ca) |
12-545-102 | Used in water-proof chamber, step 5.1 |
Microscope slides (3×1 in.) | Fisher Scientific (www.fishersci.ca) |
Used in water-proof chamber, step 5.1 | |
Raith 150TWO EBL exposure system | Raith Inc. (www.raith.com) |
Raith 150TWO system | Used for EBL exposures, step 2.2 |
Raman microscope | Thermo Scientific (www.thermoscientific.com) |
Nicolet Almega XR | Used for Raman spectroscopy, step 5.3 |
Sonicator system | Branson (www.bransonic.com) |
Used for liftoff and solutions mixing | |
Spinner | Brewer Spinner and Hotplate (www.brewerscience.com) |
Cee 200X and Cee 1300X | Used to spin-coat PMMA and conductive polymer, step 2.1 |