We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.
אחד התהליכים העיקריים של דלקת היא החדירה של תאי מערכת חיסון מלומן של כלי הדם לרקמות שמסביב. מצב זה מתרחש כאשר תאי אנדותל, אשר מרפדים את כלי דם, הפכו לדבק במחזור תאים חיסוניים כגון מונוציטים. מדידה במבחנה של הדביקות הזאת עד עכשיו נעשתה על ידי כימות המספר הכולל של מונוציטים שלדבוק שכבת האנדותל או כספירה ישירה או על ידי מדידה עקיפה של הקרינה של מונוציטים חסיד. בעוד מדידות כאלה לעשות לציין הדביקות הממוצעת של אוכלוסיית תאי אנדותל, הם מבולבל על ידי מספר הגורמים, כגון מספר תאים, ולא לחשוף את חלקם של תאי האנדותל, כי הם דבקים למעשה. כאן אנו מתארים ומדגימים שיטה המאפשרת הספירה של תאים מודבקים בתוך אוכלוסייה שנבדקה של monolayer האנדותל. תאי האנדותל גדלים על coverslips הזכוכית והבא רצוייםטיפול מאותגרים עם מונוציטים (שעשוי להיות שכותרתו fluorescently). לאחר הדגירה, הליך שטיפה, מעורבת סבבים רבים של טבילה וניקוז, התאים הם קבועים. תאי האנדותל דבקים, אשר מוקפים במונוציטים בקלות מזוהים ומנויים, נותנים מדד הידבקות החושף את החלק הממשי של תאי האנדותל באוכלוסייה שהם דבקים.
הסתננות של תאים חיסוניים כגון מונוציטים פני שכבת תאי האנדותל המרפדים את כלי דם היא צעד חשוב בתהליך של דלקת 1. זה מאפשר הביות של תאי מערכת חיסון (immunocytes) לאתר של פציעה. במקרים אחרים ובמקומות כגון עורקים הכליליים ועורק הראשי, חדירה של מונוציטים דרך שכבת האנדותל יכולה להוביל למגורים לטווח ארוך רצויים של תאים אלה בקיר של העורק, שעלול להוביל להיווצרות הפלאק 2. בכל המקרים של חדירת immunocyte, הצעד הראשון כרוך בהפעלתם של תאי האנדותל באזור מקומי של כלי הדם. תאי האנדותל מופעלים על ידי ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון TNF-α ו- IL-6 להגדיל ביטוי של חלבונים בתא שטח כגון VCAM, ICAM ו- E-selectin המאפשרים הגיוס וקשר של immunocytes על פני השטח של תאי אנדותל 3 6.
<p c= "Jove_content" ילדה> בתחילה, מדידה של הידבקות תא אנדותל בוצעה על ידי ספירת מונוציטים שדבקו אנדותל monolayer 7. מגבלותיה של שיטה זו במונחים של דיוק הובילו לשימוש בהלימפוציטים שכותרתו ברדיו או במונוציטים, ואחריו כימות של חומר רדיואקטיבי אשר תואם לימפוציטים או מונוציטים הידבקות 4. שיטה זו הוחלפה סופו של דבר על ידי שיטת הקרינה מבוססת, לפיה immunocytes עניין תויגה עם צבע פלואורסצנטי וכפוף לאותו ההליך כאמור לעיל עם ההבדל הוא הקרינה שבמקום רדיואקטיביות נמדדה 8. כיום שיטה זו התגלתה כנוחה ביותר ונמכר בצורת ערכה על ידי מספר ספקים מסחריים. בעוד assay זה יכול למדוד את הרמות יחסי של דביקות בין בקרות ודגימות ניסוי, זה לא לגלות אם שינוי בקרינה נובע משינוי אחיד בדביקות על פני כל הדואראוכלוסיית תא ndothelial או אם השינוי נובע מהבדל של דביקות בתת-אוכלוסייה של תאים. זה ניכר גם שהחומרה של שטיפה מפעילה השפעה עמוקה על התוצאה, ויותר חשוב מכך, את האחידות של שטיפה את מונוציטים מאוגד בין monolayers תא אנדותל שונה תשפיע במידה רבה על הקרבה של תוצאות ממשכפל והשחזור של התוצאות בין דגימות . לאחרונה, מספר מערכות שלשאוב מונוציטים בתקשורת ברחבי monolayer תא האנדותל שמשו כדי לטפל בבעיה זו 9. בנוסף, זרימת מערכות אלה גם לשחזר את האפקט של כוח גזירה על תאי האנדותל. למרות היתרונות של מערכות כאלה הם ברורים ומאוד אטרקטיביים, זה גם חשוב להבין כי בעוד דביקות תא האנדותל יכולה להיות מוגברת באופן משמעותי, כמו במקרה של דלקת חריפה ב, על ידי גורמים כגון TNFα, כמה מפעילים אחרים, כגון קרינה מייננת 10 לעורר שינויים לאכובע אינו מזוהה בקלות בתוך מבחנה מסגרות זמן ניסיונית על ידי מערכות מאוד מחמירות אלה. בעוד כגון שינויים של הרגע של דביקות תא האנדותל הם החמיצו או פוטרו במבחנה בקלות, זה לא פיר בהכרח in vivo, שבו שינויים קטנים כאמור בתוך זמן חיים, שהוא אופייני לדלקת כרונית, יכולים להפעיל תוצאות מאוד משמעותיות. לפיכך שיטה חזקה, עדיין רגישה, וספציפית כדי לזהות ולמדוד נחוצה דביקות תא האנדותל.כאן, אנו מדווחים על שיטה למדידת דביקות של תאי האנדותל ישירות. שיטה זו אינה מסתמכת על מדידת הקרינה כאינדיקטור פונדקאית עקיף של דביקות תא האנדותל. הוא מגלה אם שינויים בדביקות הם עקב שינוי אחיד על פני כל התאים או מרותק לתת-אוכלוסייה. יתר על כן, היא מאפשרת שיתוף צביעת תאי אנדותל עם סמנים כמו בטא galactosidase הקשורים הזדקנות, מר כדאיות תאker, Calcien בבוקר ונוגדנים נגד פני תא וחלבונים תאיים, המאפשרים לעמותה של תאי האנדותל דבקים פרט למדינות תא מסוימים או ביטוי של חלבונים ספציפיים.
Assay הידבקות מונוציטים שתואר לעיל שימש בהצלחה בניסויים שנועדו לחקור את ההשפעות הביולוגיות של קרינה מייננת על monolayers אנדותל 10. אמנם זה לא השיטה היחידה העומדת לרשות להעריך את הדביקות של monolayer האנדותל, היא השיטה היחידה המאפשרת כימות של החלק או אחוז תאי אנדותל בmonolayer כי הוא דבק. זו הבחנה חשובה כמו שינוי הכמותי עולמי בהידבקות של מונוציטים, כפי שנמדד על ידי שיטות אחרות ניתן לייחס גם לעלייה כללית בדביקות של כל התאים של monolayer האנדותל או לדביקות הגידול של תת-אוכלוסייה של תאי האנדותל בתוך monolayer, כפי שמוצג בדוגמא לעיל. הערך שיש במידע זה בא לידי ביטוי בעובדה שהיכולת לכמת אחוז תאי האנדותל שהציגו דביקות משופרת לאחר ההקרנה הובילה לאינסמסוגל מסקנה שהשפעה זו אינה נובעת ממוטציה הגנטית של גן מסוים כאחוז התאים שהיו דבקים היתה מאוד מעל (מעל 1,000 פעמים יותר) שבו ניתן היו לצפות מן המוטציה של גן אקראי על ידי X-קרינה במינון ש .
הגורם המאפשר שחזור טוב של התוצאות הוא משטר הכביסה. כנוהל השטיפה כרוך הטבילה של coverslip הזכוכית לחיץ לשטוף אחריו מספיגה על רקמה, השתנות במערבולת החיץ שמתעוררת באופן בלתי נמנע מהשיטה של pipetting של החיץ לשטוף לתוך באר הישנה הוא נמנע. ואכן זה היה התצפית של השתנות מוגזמות בין משכפל שהושג באמצעות שיטת pipetting שאלצה אותנו לתכנן הליך כביסה שהסיר את האלמנט השונות מהשלב הכביסה.
אמנם, המגבלות של שקר assay זה בצורך לבצע ספירה ידנית של אשכולות מונוציטים, שעושה not לאפשר לו להיות מותאם לתפוקה גבוהה מנתח. שנית, ההחלטה על אופן מונוציטים רבים מהווים אשכול יש שתיקבע באופן שרירותי וחצי הרמה ניתן להגדיר גבוהה מדי ולגרום להרחקה של כמה אשכולות אמיתיים. יכול גם להיות שנצפה החוסר בכוח גזירה בשיטה זו כהגבלה בניסויים שבהם דביקות משופרת גס של תאי האנדותל מושרה (למשל, + TNFα). במצבים אחרים לעומת זאת, החוסר בכוח הגזירה הוא יתרון שכן היא מאפשרת זיהוי של הגדלת פחות מוגזמת של דביקות. עלייה צנועה בדביקות מונוציטים יכולה להיות חשובה ורלוונטית במיוחד. בvivo, מונוציטים לא (בזמן ניסוי טיפוסי) צפוי לצרף במספרים גדולים לתאי אנדותל עם עלייה צנועה בדביקות, במידה רבה בשל הגזירה כוח. בזמן עם זאת, כמה מונוציטים כנראה הייתם, וזה סביר יותר מייצג את הסביבה של דלקת כרונית. כמו,העדר כוח גזירה יכול להיות יתרון כפי שהוא מספק הזדמנות לעליות קטנות בדביקות תא האנדותל להתגלות במסגרות זמן ניסיוניות שהן בדרך כלל קצרים ואולי גם חולפים כדי לאפשר גידול צנוע בדביקות שנצפה תחת מאמץ גזירה.
היכולת להכפיף את התאים לאחר assay זה לניתוחים אחרים כגון assay הזדקנות ומכתים immunofluorescence מגדילה את התועלת של שיטה זו שכן היא מאפשרת את הקשר של דביקות של תאי האנדותל ספציפיים לחלבונים תאיים מסוימים או מדינות סלולריות כפי שהודגם לעיל, תכונה ש אינו זמין עם מבחני הידבקות המבוגרים.
שיטה זו נעשתה שימוש בתאים-הונצח est2 אדם כלילית אנדותל ותוצאות דומות התקבלו גם בתאים ראשוניים אדם כלילית אנדותל 10, מדגים שזה לא ספציפי רק קו תא מסוים. כמו כן, ADOption של שיטה זו של מנסה לאמוד דביקות של תאי האנדותל אינו מונע העמדת אותם תאים לassay ההידבקות הסטנדרטי שמודד הקרינה של immunocytes שכותרת. יחד, דוח זה מוכיח כי שיטה זו היא תכליתית, כוללת ומספקת הרבה יותר מידע מאשר assay ההידבקות הסטנדרטי.
The authors have nothing to disclose.
We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Glass coverslips Round 12mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
RPMI | Sigma | R8758 | |
Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
Fibronectin | Sigma | F0895 |