We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.
Um dos processos principais da inflamação é a infiltração de células imunitárias do lúmen do vaso sanguíneo para o tecido circundante. Isto ocorre quando as células endoteliais, que revestem os vasos sanguíneos, tornam-se adesivas para células imunes circulantes, tais como monócitos. In vitro, a medição da adesividade tem até agora sido feito através da quantificação do número total de monócitos que aderem a uma camada endotelial, quer como uma contagem directa ou indirecta por medição da fluorescência de monócitos aderentes. Embora tais medições indicam a adesividade média da população de células endoteliais, que são confundidos por um número de factores, tais como o número de células, e não revelam a proporção de células endoteliais que são realmente adesiva. Aqui descrevemos e demonstrar um método que permite a enumeração de células adesivas dentro de uma população testada de monocamada endotelial. As células endoteliais são cultivadas em lamelas de vidro e seguindo o desejartratamento são desafiados com monócitos (que pode ser marcado de forma fluorescente). Após a incubação, um procedimento de enxaguamento, que envolve múltiplos ciclos de imersão e secagem, as células são fixadas. Células endoteliais adesivas, que são rodeadas pelos monócitos são prontamente identificados e enumerados, dando um índice de adesão que revela a percentagem real de células endoteliais dentro da população que são adesiva.
A infiltração de células imunes tais como os monócitos através da camada de células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos é um passo importante no processo de inflamação 1. Isto permite que o homing de células imunitárias (imunócitos) para um local da lesão. Em outros casos, e locais, tais como a artéria coronária e artéria carótida, infiltração de monócitos através da camada endotelial pode conduzir à residência indesejável longo prazo destas células da parede da artéria, o que pode conduzir à formação de placas 2. Em todos os casos de imunoc�tica infiltração, o primeiro passo envolve a activação das células endoteliais numa região localizada do vaso sanguíneo. As células endoteliais são activados por citoquinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α e IL-6 para aumentar a expressão de proteínas da superfície celular, tais como VCAM, ICAM e E-selectina que facilitam o recrutamento e fixação dos imunócitos sobre a superfície da célula endotelial 3- 6.
<p class = "jove_content"> Inicialmente, a medição da adesão de células endoteliais foi realizada por contagem de monócitos que aderiram ao monocamada endotelial 7. As limitações deste método em termos de precisão levou à utilização de linfócitos marcados com rádio ou monócito, seguido por quantificação de material radioactivo, que corresponde aos linfócitos ou monócitos adesão 4. Este método foi eventualmente substituída por um método baseado em fluorescência, em que imunócitos de interesse foram marcadas com corante fluorescente e submetidos ao mesmo procedimento tal como acima, com a diferença de que em vez de fluorescência é medida de radioactividade 8. Presentemente este método tem emergido como a mais conveniente e é vendido na forma de kit por vários fornecedores comerciais. Embora este ensaio pode medir os níveis relativos de adesividade entre os controlos e amostras experimentais, não revela se uma alteração na fluorescência é devido a uma modificação uniforme ao longo de toda a adesividade endothelial população de células ou se a mudança se deve a uma diferença de adesividade dentro de uma sub-população de células. É também evidente que o rigor da lavagem exerce um efeito profundo sobre o resultado, e mais importante ainda, a uniformidade de enxaguar monócitos não ligadas entre diferentes monocamadas de células endoteliais será de grande impacto sobre a proximidade dos resultados de repetições e reprodutibilidade dos resultados entre as amostras . Mais recentemente, vários sistemas que bombeiam monócitos em meio através de uma monocamada de células endoteliais foram utilizadas para resolver este problema 9. Além disso, estes sistemas de fluxo também recapitular o efeito da força de corte sobre as células endoteliais. Enquanto as vantagens de tais sistemas são muito clara e atraente, também é importante perceber que, apesar de adesividade de células endoteliais pode ser grandemente aumentada, como é o caso na inflamação aguda, por factores, tais como o TNFa, alguns outros activadores, tais como radiação ionizante 10 elicit muda tchapéu não são prontamente detectado in vitro dentro de intervalos de tempo experimentais por estes sistemas muito rigorosas. Embora estas alterações de adesividade de células endoteliais minutos são facilmente perdido ou rejeitado na vitro, não é necessariamente benignos in vivo, em que essas pequenas mudanças dentro de um tempo de vida, o que é característico de inflamação crónica, pode exercer resultados muito significativos. Assim, um método robusto, mas sensível e específico para detectar e medir a aderência de células endoteliais é necessária.Aqui, nós relatamos um método para medir a aderência de células endoteliais diretamente. Este método não se baseia na medição de fluorescência como indicador substituto indirecta de adesividade de células endoteliais. Revela se as mudanças na adesividade são devido a alteração uniforme em todas as células ou confinados a uma sub-população. Além disso, ele permite a co-coloração de células endoteliais com marcadores, tais como beta-galactosidase associada a senescência, a viabilidade celular Marker, Calcien AM e anticorpos contra as proteínas da superfície celular e intracelulares, que permitem a associação de células endoteliais adesivos individuais para certos estados de células ou a expressão de proteínas específicas.
O ensaio de adesão de monócitos descrita acima foi utilizada com sucesso em experiências concebidas para estudar os efeitos biológicos da radiação ionizante sobre monocamadas endoteliais 10. Embora isto não é o único método disponível para avaliar a aderência de uma monocamada endotelial, é o único método que permite a quantificação da proporção ou a percentagem de células endoteliais no interior de uma monocamada que é adesiva. Esta é uma distinção importante como uma alteração quantitativa global na adesão de monócitos, conforme medido por outros métodos pode ser atribuído quer a um aumento geral na adesividade de todas as células da monocamada endotelial ou para o aumento da adesividade de uma sub-população de células endoteliais no interior da monocamada, tal como mostrado no exemplo acima. O valor de ter esta informação é exemplificada pelo facto de que a capacidade de quantificar a percentagem de células endoteliais que exibiram adesividade aumentada após a irradiação conduziu aos inescapaz conclusão de que este efeito não é devido a uma mutação genética de um gene particular como a percentagem de células que estavam adesiva eram muito acima (mais de 1000 vezes mais) do que seria de esperar de mutação aleatória de um gene por raios-X em que doses .
O factor que permite uma boa reprodutibilidade dos resultados é o regime de lavagem. À medida que o processo de lavagem envolve a imersão da lamela de vidro para o tampão de lavagem seguido por esfregando sobre um tecido, a variabilidade no tampão de turbulência que resulta inevitavelmente a partir do método antigo de pipetagem da solução de lavagem dentro de um poço é evitada. Na verdade, foi a observação da variabilidade excessiva entre repetições obtidos usando o método de pipetagem que nos obrigou a elaborar um procedimento de lavagem que removeu o elemento variabilidade da etapa de lavagem.
É certo que as limitações desta mentira ensaio na necessidade de proceder a contagem manual de clusters de monócitos, o que fazer not permitir que ele seja adaptado para análises de elevado rendimento. Em segundo lugar, a decisão sobre quantas monócitos constituem um cluster tem de ser determinado semi-arbitrariamente eo nível pode ser muito alto e resultar na exclusão de alguns grupos genuínos. A falta de força de cisalhamento neste método também pode ser visto como uma limitação em experiências nas quais é induzida grosseiramente aumentada adesividade de células endoteliais (por exemplo, TNFa +). Em outras situações, no entanto, a ausência de força de corte é uma vantagem, uma vez que permite a detecção do aumento da adesividade menos exagerada. Aumento modesto em monócitos adesividade pode ser particularmente importante e relevante. In vivo, monócitos não seria (em um tempo experimental típico) ser esperado para anexar em grande número às células endoteliais com modesto aumento na adesividade, em grande parte devido à força de cisalhamento. Em vez no entanto, alguns monócitos provavelmente faria, e isso é mais provável para representar o ambiente de inflamação crónica. Como tal,a ausência de força de cisalhamento pode ser uma vantagem, pois proporciona a oportunidade para que pequenos aumentos na adesividade de células endoteliais a ser revelado em prazos experimentais que são tipicamente curto e, possivelmente, demasiado fugaz para permitir modesto aumento na adesividade a ser observado sob tensão de cisalhamento.
A capacidade de sujeitar as células após este ensaio para outras análises, tais como ensaio de senescência e imunofluorescência aumenta a utilidade deste método uma vez que permite a associação de adesividade de células endoteliais específicos para proteínas celulares particulares ou estados celulares tal como demonstrado acima, uma característica que não se encontra disponível com os ensaios de adesão mais velhos.
Este método tem sido utilizado com células endoteliais coronárias humanas imortalizadas EST2 e resultados semelhantes também foram obtidos com células endoteliais coronárias humanas primárias 10, demonstrando que não é específico para apenas uma linha de células particular. Além disso, o ADOPÇÃO deste método de ensaio de aderência de células endoteliais não se opõem sujeitando as mesmas células para o ensaio de adesão padrão que mede a fluorescência de imunócitos rotulados. Juntos, este relatório demonstra que este método é versátil, inclusiva e fornece muito mais informações do que o ensaio de adesão padrão.
The authors have nothing to disclose.
We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Glass coverslips Round 12mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
RPMI | Sigma | R8758 | |
Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
Fibronectin | Sigma | F0895 |