We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.
सूजन के कार्डिनल प्रक्रियाओं में से एक के आसपास के ऊतकों को रक्त वाहिनियों के लुमेन से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ है। रक्त वाहिकाओं जो लाइन endothelial कोशिकाओं, ऐसे monocytes के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं परिसंचारी के लिए चिपकने वाला बन गया जब यह होता है। इस चिपचिपाहट की इन विट्रो माप अब एक सीधा गिनती के रूप में या तो एक endothelial परत का पालन करना है कि monocytes की कुल संख्या बढ़ाता द्वारा किया गया है जब तक या पक्षपाती monocytes के प्रतिदीप्ति के अप्रत्यक्ष माप के द्वारा। इस तरह के मापन endothelial सेल आबादी की औसत चिपचिपाहट का संकेत करते हैं, वे इस तरह के सेल नंबर के रूप में कारकों की एक संख्या से चकित कर रहे हैं, और वास्तव में चिपकने वाला हैं कि endothelial कोशिकाओं के अनुपात में प्रकट नहीं करते हैं। यहाँ हम वर्णन और endothelial monolayer के एक परीक्षण आबादी के भीतर चिपकने वाला कोशिकाओं की गणन अनुमति देता है एक विधि प्रदर्शित करता है। Endothelial कोशिकाओं कांच coverslips पर हो रहे हैं और इच्छित निम्नउपचार (कि fluorescently लेबल किया जा सकता है) monocytes के साथ चुनौती दी है। विसर्जन और निकासी के कई दौर से जुड़े ऊष्मायन, एक rinsing प्रक्रिया के बाद, कोशिकाओं तय कर रहे हैं। Monocytes से घिरे हैं जो चिपकने वाला endothelial कोशिकाओं, आसानी से पहचान की है और चिपकने वाला हैं कि आबादी के भीतर endothelial कोशिकाओं के वास्तविक अनुपात से पता चलता है कि एक आसंजन सूचकांक दे रही है, प्रगणित कर रहे हैं।
जैसे रक्त वाहिकाओं कि लाइन endothelial सेल परत भर monocytes के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ सूजन 1 की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। इस चोट की एक साइट के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं (immunocytes) के घर वापस आना अनुमति देता है। ऐसे कोरोनरी धमनी और मन्या धमनी के रूप में अन्य उदाहरण और स्थानों में, endothelial परत के माध्यम से monocytes के घुसपैठ संभावित सजीले टुकड़े 2 के गठन के लिए अग्रणी, धमनी की दीवार में इन कोशिकाओं के अवांछनीय लंबी अवधि के निवास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। Immunocyte घुसपैठ के सभी मामलों में, पहला कदम रक्त वाहिनियों की एक स्थानीय क्षेत्र में endothelial कोशिकाओं की सक्रियता से शामिल है। Endothelial कोशिकाओं ऐसे endothelial सेल सतह 3- पर immunocytes की भर्ती और कुर्की की सुविधा है, जो इस तरह के Vcam, ICAM और ई selectin के रूप में कोशिका की सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए TNF-α और आईएल -6 के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स द्वारा सक्रिय कर रहे हैं 6।
<p cलड़की = "jove_content"> प्रारंभ में, endothelial सेल आसंजन की माप monolayer 7 endothelial का पालन किया है कि monocytes गिनती से बाहर किया गया था। परिशुद्धता के संदर्भ में इस विधि की सीमाओं लिम्फोसाइट या monocytes आसंजन 4 से मेल खाती है जो रेडियोधर्मी सामग्री की मात्रा का ठहराव के द्वारा पीछा रेडियो लेबल लिम्फोसाइट या monocyte का उपयोग करते हैं, करने के लिए नेतृत्व किया। इस विधि के अंत में 8 मापा जाता है ब्याज की immunocytes फर्क बजाय रेडियोधर्मिता की है कि प्रतिदीप्ति होने के साथ ऊपर के रूप में एक ही प्रक्रिया के लिए प्रतिदीप्ति डाई के साथ लेबल और किए गए जिससे एक प्रतिदीप्ति आधारित पद्धति, से रह रहा था। वर्तमान में इस पद्धति का सबसे सुविधाजनक रूप में उभरा है और कई वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं द्वारा किट के रूप में बेचा जाता है। इस परख नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों के बीच चिपचिपाहट के रिश्तेदार के स्तर को मापने सकता है, यह प्रतिदीप्ति में एक परिवर्तन पूरे ई भर में चिपचिपाहट में एक समान परिवर्तन की वजह से है कि क्या प्रकट नहीं करता हैndothelial सेल की आबादी या परिवर्तन की वजह से कोशिकाओं के एक उप जनसंख्या के भीतर चिपचिपाहट के एक अंतर करने के लिए है। इसे धोने की तंगी परिणाम पर गहरा प्रभाव डाल रही है, और अधिक महत्वपूर्ण बात, विभिन्न endothelial सेल monolayers के बीच अपार monocytes बंद rinsing की एकरूपता नमूनों के बीच परिणामों की प्रतिकृति से परिणाम की निकटता और reproducibility पर काफी असर होगा कि यह भी स्पष्ट है । अभी हाल ही में एक endothelial सेल monolayer भर के मीडिया में monocytes पंप कि कई प्रणालियों इस समस्या 9 संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इसके अलावा, इन प्रवाह प्रणाली भी endothelial कोशिकाओं पर कतरनी बल के प्रभाव पुनरावृत्ति। ऐसी प्रणालियों का लाभ स्पष्ट और बहुत आकर्षक हैं जबकि तीव्र सूजन में मामला है, यह इस तरह इस तरह के विकिरण के रूप में TNFα, कुछ अन्य activators, जैसे कारकों से, endothelial सेल चिपचिपाहट बहुत संवर्धित किया जा सकता है, जबकि एहसास है कि यह भी महत्वपूर्ण है 10 निकालना टी में परिवर्तनटोपी आसानी से ये बहुत कड़े सिस्टम द्वारा इन विट्रो प्रयोगात्मक समय फ्रेम के भीतर का पता नहीं कर रहे हैं। Endothelial सेल चिपचिपाहट के ऐसे मिनट में परिवर्तन को आसानी से याद है या इन विट्रो में बर्खास्त कर दिया जाता है, यह जीर्ण सूजन की विशेषता है जो एक जीवन समय के भीतर इस तरह के छोटे-मोटे परिवर्तन, बहुत महत्वपूर्ण परिणामों लागू कर सकते हैं जहां विवो में जरूरी सौम्य नहीं है। इसलिए एक मजबूत, अभी तक संवेदनशील है, और विशेष विधि का पता लगाने और endothelial सेल चिपचिपाहट की जरूरत है मापने के लिए।यहाँ, हम सीधे endothelial कोशिकाओं की चिपचिपाहट को मापने के लिए एक विधि की रिपोर्ट। इस विधि endothelial सेल चिपचिपाहट के एक अप्रत्यक्ष किराए की सूचक के रूप में प्रतिदीप्ति माप पर भरोसा नहीं करता। यह चिपचिपाहट में परिवर्तन के सभी कक्षों में एक समान परिवर्तन के कारण या एक उप-आबादी तक ही सीमित रहे हैं कि क्या पता चलता है। इसके अलावा, यह जीर्णता जुड़े बीटा galactosidase, सेल व्यवहार्यता मार्च के रूप में मार्कर के साथ endothelial कोशिकाओं के सह-धुंधला अनुमति देता हैKER, Calcien AM और निश्चित सेल राज्यों या विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अलग-अलग चिपकने वाला endothelial कोशिकाओं की एसोसिएशन की इजाजत दी कोशिका की सतह और intracellular प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी,।
ऊपर वर्णित monocyte आसंजन परख एन्दोथेलिअल monolayers के 10 पर विकिरण का जैविक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए डिजाइन प्रयोगों में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया था। यह एक endothelial monolayer के चिपचिपाहट का आकलन करने के लिए उपलब्ध एकमात्र तरीका नहीं है, यद्यपि यह चिपकने वाला है कि एक monolayer के भीतर अनुपात या endothelial कोशिकाओं का प्रतिशत की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है कि एकमात्र तरीका है। इस monocytes के आसंजन में एक वैश्विक मात्रात्मक परिवर्तन के रूप में एक महत्वपूर्ण अंतर है, अन्य तरीकों से मापा एन्दोथेलिअल monolayer के या endothelial कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या की वृद्धि चिपचिपाहट के लिए सभी कोशिकाओं की चिपचिपाहट में एक सामान्य वृद्धि करने के लिए या तो जिम्मेदार ठहराया जा सकता है monolayer के भीतर, के रूप में ऊपर के उदाहरण में दिखाया गया है। इस जानकारी होने के मूल्य विकिरण इनेस का नेतृत्व करने के बाद क्षमता में इजाफा चिपचिपाहट का प्रदर्शन किया है कि endothelial कोशिकाओं का प्रतिशत यों के लिए तथ्य यह है कि द्वारा उदाहरण हैइस आशय चिपकने वाला थे कि कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में एक विशेष जीन के आनुवंशिक उत्परिवर्तन के कारण नहीं है कि सक्षम निष्कर्ष है कि खुराक में एक्स-विकिरण से एक जीन के यादृच्छिक उत्परिवर्तन से उम्मीद होगी जो कि (1,000 गुना अधिक) के ऊपर बहुत थे ।
परिणामों की अच्छी reproducibility के लिए अनुमति देता है कि कारक धोने शासन है। कपड़े धोने की प्रक्रिया एक ऊतक पर dabbing द्वारा पीछा धोने बफर में कांच coverslip के विसर्जन शामिल है, अनिवार्य रूप से एक कुएं में धो बफर के pipetting की पुरानी पद्धति से उत्पन्न होती है जो बफर अशांति में परिवर्तनशीलता बचा है। दरअसल यह धोने कदम से परिवर्तनशीलता तत्व निकाल दिया कि एक कपड़े धोने की प्रक्रिया वसीयत करने के लिए हमें मजबूर है कि pipetting विधि का उपयोग कर प्राप्त प्रतिकृति के बीच अत्यधिक परिवर्तनशीलता का अवलोकन किया गया था।
वैसे, जरूरत इस परख झूठ की सीमाओं n करते हैं जो monocyte समूहों का मार्गदर्शन गिनती, बाहर ले जाने के लिएओ.टी. उच्च throughput विश्लेषण के लिए यह अनुकूलित किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं। दूसरे, कई monocytes एक क्लस्टर का गठन कैसे पर निर्णय अर्द्ध मनमाने ढंग से निर्धारित किया जाना है और यह स्तर बहुत अधिक सेट और कुछ वास्तविक समूहों के बहिष्कार का परिणाम हो सकता है। इस विधि में कतरनी बल की कमी भी endothelial कोशिकाओं की निहायत बढ़ाया चिपचिपाहट प्रेरित है, जिसमें प्रयोगों (उदाहरण के लिए, + TNFα) में एक सीमा के रूप में देखा जा सकता है। यह चिपचिपाहट के कम अतिरंजित वृद्धि का पता लगाने के लिए अनुमति देता है के रूप में अन्य स्थितियों में हालांकि, कतरनी बल की कमी के कारण एक फायदा है। Monocyte चिपचिपाहट में मामूली वृद्धि विशेष रूप से महत्वपूर्ण और प्रासंगिक हो सकता है। में vivo, monocytes (एक ठेठ प्रयोगात्मक समय में) बल कतरनी की वजह चिपचिपाहट में मामूली वृद्धि हुई है, के साथ कोशिकाओं endothelial करने के लिए बड़ी संख्या में संलग्न करने के लिए उम्मीद नहीं की जा होगा। कुछ ही समय में हालांकि, कुछ monocytes शायद होगा, और इस जीर्ण सूजन का वातावरण प्रतिनिधित्व करने के लिए और अधिक होने की संभावना है। जैसे की,यह चिपचिपाहट में मामूली वृद्धि कतरनी तनाव के तहत मनाया जा करने की अनुमति के लिए आम तौर पर कम है और संभवतः भी क्षणभंगुर हैं जो प्रयोगात्मक समय फ्रेम में सामने उजागर हो endothelial सेल चिपचिपाहट में छोटे वृद्धि के लिए अवसर प्रदान करता है के रूप में कतरनी बल के अभाव एक फायदा हो सकता है।
प्रदर्शन के ऊपर के रूप में यह विशेष रूप से सेलुलर प्रोटीन या सेलुलर राज्यों को विशिष्ट endothelial कोशिकाओं की चिपचिपाहट की एसोसिएशन की अनुमति देता है के रूप में इस तरह के वार्धक्य परख और immunofluorescence धुंधला के रूप में अन्य विश्लेषण करने के लिए इस परख के बाद कोशिकाओं के अधीन करने की क्षमता, एक विशेषता यह इस पद्धति की उपयोगिता बढ़ जाती है कि पुराने आसंजन assays के साथ उपलब्ध नहीं है।
इस विधि est2-अमर मानव कोरोनरी endothelial कोशिकाओं और इसी तरह के परिणामों के साथ इस्तेमाल किया गया है भी कि यह सिर्फ एक विशेष सेल लाइन के लिए विशिष्ट नहीं है कि प्रदर्शन, प्राथमिक मानव कोरोनरी endothelial कोशिकाओं 10 के साथ प्राप्त किया गया। इसके अलावा, हलचलendothelial कोशिकाओं की चिपचिपाहट परख करने की क्रिया की इस पद्धति का ption में लेबल immunocytes के प्रतिदीप्ति उपाय है कि मानक आसंजन परख करने के लिए एक ही कोशिकाओं को subjecting बाधा नहीं है। साथ में, इस रिपोर्ट में इस विधि, समावेशी बहुमुखी और मानक आसंजन परख की तुलना में बहुत अधिक जानकारी प्रदान करता है कि यह दर्शाता है।
The authors have nothing to disclose.
We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Glass coverslips Round 12mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
RPMI | Sigma | R8758 | |
Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
Fibronectin | Sigma | F0895 |